Platform Pencitraan Bioluminescence multicolor Baru untuk review Menginvestigasi

NF k AKTIVITAS B dan Apoptosis hearts Sel Kanker Payudara Manusia

Laura Mezzanotte 1, Naan 1, Isabel M. Mol 2, Clemens WGM Lo¨wik 1, Eric L. Kaijzel 1 *
1 Departemen RADIOLOGI, Pusat Kesehatan Universitas Leiden, Leiden, Belanda, 2 Departemen endokrinologi, Pusat Kesehatan Universitas Leiden, Leiden, Belanda

Abstrak

Latar Belakang: Evaluasi obat baru untuk review development klinis tergantung PADA Teknologi skrining calon Dan Model praklinis Informatif. Here Kami
mengembangkan platform yang pencitraan multicolor bioluminesen untuk review Beroperasi simultan menyelidiki faktor Transkripsi NF k B menandakan Dan apoptosis.

Metode: Garis sel kanker payudara manusia (MDA-MB-231) telah dimodifikasi secara genetis untuk mengekspresikan luciferase cahaya, merah dan biru yang
memancarkan luciferase untuk memantau jumlah sel dan viabilitas, NF - k kegiatan promotor B dan untuk melakukan pemilahan dan deteksi, masing-masing. Substrat
pro-luciferin Z-DEVD-animoluciferin dipekerjakan untuk menentukan apoptosis caspase aktivitas 3/7. Kami seperti garis sel untuk in vitro Kumpulan senyawa alami
dan in vivo pencitraan optik tumor necrosis factor TNF Sebuah- diinduksi NF k aktivasi B.

hasil: Celastrol, resveratrol, sulphoraphane dan kurkumin menghambat NF k Kegiatan promotor sangat signifikan dan dalam cara yang tergantung dosis. Semua
senyawa kecuali resveratrol diinduksi caspase 3/7 tergantung apoptosis. Beraneka warna
bioluminescence in vivo pencitraan memungkinkan penyelidikan pertumbuhan tumor dan NF k B induksi pada model tikus kanker payudara.

Kesimpulan: metode baru kami menyediakan platform pencitraan untuk identifikasi, validasi, skrining dan optimalisasi senyawa yang bekerja pada NF k B signaling
dan apoptosis baik in vitro dan in vivo.

Kutipan: Mezzanotte L, An N, Mol IM, Lo¨wik CWGM, Kaijzel EL (2014) Sebuah Pencitraan Multicolor Bioluminescence Baru Platform untuk Selidiki NF k B Aktivitas dan Apoptosis di Sel Kanker Payudara Manusia. PLoS
ONE 9 (1): e85550. doi: 10.1371 / journal.pone.0085550

Editor: Partha Mukhopadhyay, Institut Kesehatan Nasional, Amerika Serikat

diterima 10 September 2013; diterima 4 Desember 2013; Diterbitkan 17 Januari 2014

Hak cipta: 2014 Mezzanotte dkk. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka di bawah ketentuan lisensi Creative Commons Attribution, yang memungkinkan
Penggunaan tak terbatas, distribusi, dan pemulihan dalam media apapun, seperti penulis asli dan sumber dikreditkan.

aktivitas: Karya ini didukung oleh NanoNextNL, konsorsium mikro dan nanoteknologi dari Pemerintah Belanda dan 130 mitra dan Dewan Beasiswa Cina. Penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain penelitian, data
dan analisis, keputusan untuk mempublikasikan, atau penyusunan naskah.

Bersaing Minat: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada minat ada.

* E-mail: elkaijzel@lumc.nl

pengantar alat-alat penelitian praklinis, yang menjamin analisis yang lebih cepat dan lebih
akurat dari jalur molekuler, adalah penting untuk memperbaiki desain dan skrining
Dalam sejarah terakhir laporan bioluminescent sudah digunakan secara luas obat baru dan diagnosis dan pengobatan kanker.
untuk pengembangan tes berbasis sel dan in vivo pencitraan [1-5]. Kata kunci:
molekul molekul molekul molekul berbagai berbagai berbagai berbagai berbagai
Nuklir Faktor-kappa B (NF k B) transduksi sinyal
berbagai berbagai protein protein protein protein protein protein protein protein
jalur telah diidentifikasi sebagai jalur utama kanker peradangan yang terkait, dalam
protein protein protein protein protein protein protein protein.
transformasi sel dan pertumbuhan tumor dan invasi sel dan metastasis, terutama
pada kanker payudara [17,18]. Memahami mekanisme NF k aktivasi B pada sel tumor
akan memfasilitasi pembangunan sarana untuk pencegahan kanker dan terapi
sistem bioluminescence multicolor hasil emisi tinggi kuantum hadir yang memberi
[19-21]. Menargetkan NF k B aktivasi jalur, umumnya diaktifkan dalam sel kanker
pendeteksian tinggi in vitro tetapi juga di in vivo pengaturan. Secara khusus, penggunaan
payudara, diharapkan untuk menurunkan ambang kelangsungan hidup bahkan jika
kombinasi mengeluarkan enzim D-luciferindependent dengan panjang gelombang emisi
NF k B penghambatan umumnya tidak cukup untuk mendorong apoptosis diucapkan
puncak yang berbeda ( 'warna-warni' mengeluarkan enzim) [11], dengan mengeluarkan
dalam sel-sel kanker. NF
enzim menggunakan substrat yang berbeda seperti coelenterazine atau vargulin [12-14]
memperluas potensi tes berbasis sel dan in vivo pencitraan. Ini analisis multiplexing
k B inhibitor dapat digunakan sebagai radioterapi atau untuk pencegahan kanker.
menurunkan format uji dan memungkinkan pengurangan dan penyempurnaan dari
senyawa alami yang berbeda yang langsung atau tidak langsung NF k Kegiatan B
eksperimen hewan [15,16].
pada titik-titik kunci di sepanjang jalur aktivasi dan mereka telah dilakukan untuk
kemoprevensi, chemosensitization atau adjuvant [22-26].
alat pencitraan baru akan membantu dalam memahami mekanisme molekuler
yang mengarah pada perkembangan kanker dan metastasis serta resistensi
terhadap kemoterapi. Perkembangan tersebut

PLoS ONE | www.plosone.org 1 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550


Efek obat kandidat antikanker baru di NF k B signaling telah banyak diteliti oleh
pendekatan berbasis klasik seperti transfeksi transien menggunakan NF k B
promotor-reporter plasmid [27] dan mobilitas elektroforesis beralih tes [28]. alat optik
dan hewan bioluminescent transgenik telah diperkenalkan untuk memulai efek pada
NF k B signaling, seperti fusi p65-GFP [29], saya k B Sebuah- luciferase (I k B Sebuah- Fluc)
wartawan fusion [30] dan NF k B luc reporter tikus [31].
Dalam penelitian ini kami mengembangkan dan divalidasi sistem sel baru tiga
kanker warna yang dihasilkan oleh transduksi lentiviral dari garis sel kanker
payudara manusia MDA-MB-231 dengan wartawan bioluminescent yang berbeda.
Secara khusus, klik kumbang hijau luciferase (CBG99) digunakan untuk memantau
vitalitas sel sementara mutan merah luciferase kunang-kunang (PpyRE9) dipantau
NF k aktivitas promotor B. Biru extGluc, bentuk transmembran dari Gaussia
luciferase, menjabat sebagai reporter in vitro pemilahan sel dan ex vivo analisis sel.
Selain itu, penggunaan luciferase pro-substrat ZDEVD-aminoluciferin, yang berisi
DEVD tetrapeptide urut diakui oleh caspase-3 dan -7, memungkinkan pencitraan
non-invasif apoptosis pada sel luciferase mengekspresikan baik in vitro dan
in vivo [ 32]. Setelah aktivasi caspase-3 atau -7 dalam sel apoptosis, yang DEVD
peptida dibelah, dan aminoluciferin dibebaskan bereaksi dengan luciferase untuk
menghasilkan cahaya terukur.
Dengan cara platform ini pencitraan baru kita meneliti efek dari senyawa alami
yang berasal dari tumbuhan seperti celastrol, resveratrol, kurkumin, asam betulinic
dan sulphoraphane di TNF Sebuah-
diinduksi NF k aktivasi B dan apoptosis pada sel kanker payudara manusia. Untuk
pertama kalinya, analisis NF k aktivasi B dan perkembangan tumor dari sel ke model
hewan menggunakan gen reporter warna-warni untuk pengujian obat dilaporkan.
Prosedur eksperimental
pernyataan etika
hewan percobaan dan disetujui oleh Komite Bioetika dari Universitas Leiden,
Belanda. Semua hewan menerima perawatan manusia sesuai dengan '' Kode Etik
Penggunaan Laboratorium Hewan di Cancer Research '' (Inspectie W & V, Juli
1999).
kultur sel dan reagen
MDA-MB-231 sel-sel kanker payudara manusia (ATCC nomor HTB-26 TM) dipertahankan
dalam dimodifikasi Eagle menengah Dulbecco (Invitrogen, Grand Island, USA)
ditambah dengan 10% serum janin sapi (Sigma, St Louis, USA), 100 U / ml penisilin
(Sigma) dan 0,1 mg / ml streptomisin (Sigma). Sel-sel ditumbuhkan pada 37 u C
dalam 5% CO 2 inkubator dilembabkan. Senyawa dibeli dari perusahaan berikut:
celastrol dan curcumin (Cayman, Michigan, USA), L-sulforaphane dan resveratrol
(Sigma), dan asam betulinic (Tocris, Bristol,
UK). Manusia TNF rekombinan Sebuah dibeli dari Sigma.
konstruksi vektor lentiviral
Untuk membuat PRR-L-PGKCBG99, gen luciferase CBG99 itu dipotong dengan
NheI dan XbaI dari pGL3-CBG99 (Promega, Leiden, Belanda) dan kloning dalam
MCS dari PRR-L-PGK (hadiah semacam dari Prof. R. Hoeben [33 ]).
The bicistronic PLM-NF k B PpyRE9 vektor dibangun dengan memperkuat gen
luciferase PpyRE9 dari vektor pGEX-6p2-PpyRE9 (disediakan oleh Prof. B.
Branchini [34]) menggunakan primer berikut: maju primer 5 9- GGCGGCCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3
dan D-Luciferin (Synchem, Jerman) ditambahkan pada konsentrasi akhir 0,5 mM.
9 dengan situs pembatasan NcoI dan sebaliknya primer 5 9- GTCTAGATTAGATTTTCCGCCCTTCTTGGCCTT-3
Kegiatan luciferase diukur menggunakan IVIS Spectrum (Caliper, Alameda, CA,
9 dengan XbaI situs pembatasan. Selanjutnya,
PLoS ONE | www.plosone.org
Multicolor Pencitraan dari NF k B Aktivitas dan Apoptosis
gen luciferase PpyRE9 dikloning dengan mengganti gen luc dalam vektor kontrol
pGL3 (Promega) untuk membuat vektor pGL3-PpyRE9. NF k B promotor elemen
responsif yang dipotong dengan KPNI dan NcoI dari pGL4.32 vektor [ luc2P / NF k B-RE
/ Hygro] (Promega) dan kloning ke dalam vektor pGL3-PpyRE9 untuk menciptakan
pGL3-NF k B PpyRE9 vektor. Selanjutnya, NF k B PpyRE9 kaset itu dipotong dengan
enzim restriksi KPNI dan XbaI, tumpul dan diklon ke vektor pNFAT dua arah
bicistronic (baik yang disediakan oleh Prof. MR Van de Brink [35]) di mana kaset
NFAT-CBRed telah dihapus. Yang dihasilkan vektor lentiviral bicistronic bernama
pLMNF- k B PpyRE9 diperiksa untuk orientasi. Plasmid baru berisi Gaussia
Luciferase asli [extGLuc] di bawah kendali PGK promotor dalam satu arah dan NF k B
PpyRE9 kaset ke arah lain.
Sel Transduksi dan seleksi
lentivirus diri menonaktifkan diproduksi seperti yang dijelaskan sebelumnya [33].
MDA-MB-231 sel ditransduksi dalam langkah-langkah berurutan. Pertama,
MDA-MB-231 sel ditransduksi dengan lentivirus mengekspresikan
PRR-L-PGKCBG99 dan dipilih dengan membatasi metode dilusi. Kemudian,
diperoleh CBG99 luciferase garis sel positif ditransduksi dengan PLM-NF k B PpyRE9
lentivirus dan FACS-diurutkan menggunakan poliklonal anti-Gaussia luciferase
antibodi (Nanolight tech., Pinetop, AZ).
MTS dan Luciferase assay
Tiga berwarna MDA-MB-231 sel unggulan di piring 96-baik dan, 24 jam
kemudian, diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda puromycin (0,1 m g / ml -
10 m g / ml), yang dikenal selektif antibiotik beracun untuk sel eukariotik. Setelah lain
24 jam inkubasi, piring dibagi untuk analisis yang berbeda. Sebuah MTS uji
kolorimetri untuk kelangsungan hidup sel menilai, CellTiter 96 H AQ ueous Satu Solusi
Sel Proliferasi Assay (Promega, Leiden, Belanda) digunakan sesuai dengan
deskripsi produsen. Singkatnya, solusi MTS ditambahkan ke media selama 2 jam
setelah absorbansi diukur pada 490 nm dengan ELISA lempeng pembaca
(VersaMax Molekuler Devices, Sunnyvale, CA). Untuk mengukur aktivitas luciferase
biokimia, sel dicuci dengan PBS, dipanen di reporter buffer lisis dan diuji untuk
aktivitas luciferase dengan luminometer (SpectraMax L luminescence lempeng
pembaca, Molecular Devices). Kurva kelangsungan hidup sel dibuat untuk kedua
MTS -dan tes luciferase.
Reporter aktivitas gen assay
Tiga berwarna MDA-MB-231 sel unggulan di 96-baik piring gelap
(Greiner bio-satu, Jerman) pada konsentrasi 5000 sel / baik, pengobatan
24 jam sebelumnya. Garis sel pertama kali divalidasi untuk NF k tanggapan B dengan
menambahkan TNF Sebuah ( 10 ng / ml) untuk titik waktu yang berbeda inkubasi
(mulai dari 2 sampai 72 jam). Setelah mendirikan periode optimal TNF Sebuah stimulasi,
efek dari senyawa tanaman yang diturunkan diselidiki pada TNF Sebuah-
diinduksi NF k aktivasi B di MDA-MB-231 sel. Untuk itu, sel-sel diperlakukan dengan
media (kontrol negatif), TNF Sebuah ( 10 ng /
ml, kontrol positif), TNF Sebuah bersama-sama dengan senyawa alami
kemopreventif: celastrol (0.1 m M-2.5 m M), sulforaphane
(5 m M-100 m M), kurkumin (10 m M-20 m M), resveratrol (1 m M- 200 m M) atau asam
betulinic (0,1 m M-30 m M), diikuti oleh 24 jam inkubasi. Kegiatan luciferase
ditentukan sebagai berikut: media di piring diganti dengan phosphate-buffered saline
USA). Tahap instrumen disimpan pada 37 u C dan pencitraan set up adalah FOV C.
Cahaya
2 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550
 Multicolor Pencitraan NF- k Aktivitas B dan Apoptosis

Output diukur dengan menggunakan filter terbuka dan serangkaian band pass filter Triple colored MDA-MB-231 xenograft model
(20 nm) mulai dari 500 nm sampai 700 nm masing-masing untuk 5 detik, 5 menit Triple colored MDA-MB-231 cells (2 6 10 6) were implanted in the mammary fat pads
setelah penambahan substrat untuk hidup sel. Semua data dinyatakan dalam of female athymic (BALB/c nu/nu) mice. D-luciferin (150 mg/kg) was injected
foton-fluks dan dianalisis dengan Living Gambar Software 4.0 (Caliper, Alameda, intraperitoneally and imaging started 5 minutes later using a FOV C and a 30 sec
CA, USA). Algoritma unmixing spektral diaplikasikan pada gambar untuk acquisition time for both open filter and band pass filters acquisition. Mice were
memisahkan mengeluarkan enzim merah dan hijau seperti yang dijelaskan imaged weekly. Tumors reached a palpable size (around 150 mm 3) after two to three
sebelumnya [11]. Data dihitung menggambarkan beberapa daerah kepentingan weeks.
(ROI) sesuai dengan daerah baik dari piring 96-baik hitam di gambar sesuai dengan
hasil unmixing. CBG aktivitas luciferase dalam spektrum hijau (puncak emisi panjang
gelombang 540 nm) telah digunakan sebagai indikasi vitalitas sel dan aktivitas Induction of NF- k B
PpyRE9 luciferase dalam spektrum merah (puncak emisi panjang gelombang 620
When tumor growth reached an exponential increase in CBGluc signals, mice
nm) sebagai indikasi aktivitas promotor. m M.
were randomized in three groups. A control group received an intratumoral
injection of PBS and an
intravenous injection of PBS. TNF a ( 20 m g/kg) was injected intravenously in the
second and third group. Next, these mice were given an intratumoral injection of
celastrol (2 mg/kg) or PBS. Mice were imaged after the injection and after 24 hours
with the same settings. Evaluation of NF- k B induction was performed by comparison
Western blot analysis of P65 in nuclear extracts of images before and 24 hours after treatment.
To confirm the results of the reporter gene assays, western blot analysis was
performed to test NF- k B activity in the nuclear extracts. MDA-MB-231 cells (1 6 10 6 cells/well)
were seeded in 6well plates for 24 hours, then treated with medium (negative Induction of apoptosis
control), TNF a ( 10 ng/ml positive control), or TNF a ( 10 ng/ml) with celastrol (0.1 m M,
To measure induction of apoptosis, triple colored MDA-MB231 tumors were
0.5 m M and 1 m M) or betulinic acid (0.5 m M, 1 m M, 10 m M and 30 m M). After 24
grown as described above, intratumorally injected with celastrol and after 4 and 24
hours of treatment cells were collected, and nuclear extracts were made using
hours Z-DEVDaminoluciferin (50 mg/kg) was injected intraperitoneally. Activation of
Nuclear and Cytoplasmic extraction reagents (Thermo Scientific, Rockford, U.S.A.).
caspase 3/7 was measured 20 min after injection of substrate using an open filter
Total amount of protein of each sample was determined by a Pierce BCA protein
and an exposure time of 30 sec.
assay kit (Thermo Scientific, Rockford, U.S.A.). 15 m g of nuclear extracts was
applied to a 10% SDS-PAGE and transferred onto a nitrocellulose membrane. After
washing,
Immunohistochemistry
Tumors were surgically removed, fixed in 4% formaldehyde and further processed
for paraffin embedment. Sections (6–7 m m) dibuat menggunakan mikrotom standar
the membrane was incubated with an anti-P65 polyclonal antibody in
dan ditempatkan pada slide kaca. Antibodi anti-Gaussia luciferase poliklonal
TPBS 1:1000 dilutions (Cell Signaling Technology, Danvers, U.S.A.) overnight at
(Nanolight tech.) Dan antibodi anti-kelinci-FITC digunakan untuk mengungkapkan
room temperature. A GAPDH antibody (Cell Signaling Technology) was used to
keberadaan sel tumor positif Gaussia luciferase.
correct for the amount of total protein. The blots were washed, exposed to an
HRP-conjugated secondary antibody for 1 hour, and finally detected using enhanced
chemiluminescence (ECL) reagents (Thermo Scientific). Detection of ECL signals
Analisis statistik
was performed with the IVIS Spectrum and quantification of bands using Living
Setiap in vitro percobaan dilakukan tiga kali dengan enam sampel mereplikasi per
Image Software 4.0.
titik data. T-test Student telah diterapkan untuk menentukan perbedaan yang
signifikan secara statistik dalam aktivitas promotor antara kontrol positif dan kondisi
yang dirawat. Untuk in vivo percobaan di mana lebih dari dua kelompok
dibandingkan, ANOVA satu arah diikuti oleh uji post-hoc Tukey digunakan untuk
Caspase 3/7 activity apoptosis assay
menentukan perbedaan yang signifikan di antara kelompok yang diobati.
Triple colored MDA-MB-231 cells were seeded in a 96-well dark plate (Greiner
bio-one) for 24 hours to attach. The cells were then treated with medium (negative
control), or chemopreventive natural compounds, followed by another 4 hours or 24
hours of incubation. Rows of cells were then divided to estimate the effect of the
Hasil
different compounds on cell viability and apoptosis. Cell viability was established by
the addition of D-luciferin to live cells; caspase 3/7 activity was determined by adding
Generasi vektor lentiviral bioluminescent
the luciferase prosubstrate, Z-DEVD-aminoluciferin using a Caspase-Glo 3/7 Assay
Vektor pRRL-PGKCBG99 mengandung gen luciferase CBG99 yang digerakkan
(Promega). Upon activation of caspase-3 or -7, the DEVD peptide is cleaved off,
oleh promotor PGK dengan puncak emisi pada 540 nm setelah penambahan
releasing the aminoluciferin to react with luciferase generating measurable light [32].
substrat D-luciferin. Vektor bicistronik pLM-NF- k B PpyRE9 terdiri dari NF- k B PpyRE9
The bioluminescent signals generated by the addition of the Z-DEVD-aminoluciferin
dan kaset PGK-extGLuc dipisahkan oleh urutan isolator untuk memastikan induksi
were divided by the signals generated by the CBG99 luciferase upon addition of
tinggi promotor setelah integrasi vektor (Gambar 1.A). PpyRE9 luciferase memiliki
D-luciferin in order to correct the data set for the amount of viable cells. Data are
puncak emisi pada 620 nm menggunakan D-luciferin sebagai substrat. Kehadiran
reported showing the corrected signal for controls (only medium added) and the
gen transmembran Gluc reporter di bawah kendali promotor konstitutif dalam vektor
different treatments (medium containing the different plant-derived natural
bikistronik merupakan '' warna ketiga '' sejak puncak emisi Gluc luciferase adalah
compounds).
480 nm dan membutuhkan penambahan substrat yang berbeda (misalnya
coelenterazine). (Gambar 1.B).

PLOS ONE | www.plosone.org 3 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550

 Multicolor Imaging of NF- k B Activity and Apoptosis

Gambar 1. In vitro karakterisasi warna yang berbeda sel MDA-MB-231. ( 1.A) Schematic representation of the lentiviral constructs used for developing triple color MDA-MB-231 cells. (1.B) Graph
representing the emission spectrum of the three luciferases used in the study. ExtGluc in blue, CBG99 in green and PpyRE9 in red. (1.C) Graph representing the correlation between the CBG99
luciferase signal and cells number in the MDAMB-231 cell line. (1.D) Graph represents the correspondence between bioluminescent signal from CBG99 luciferase expressing MDA-MB-231 and the
absorbance signals of MTS assay generating a kill curve using puromycin. doi:10.1371/journal.pone.0085550.g001

Triple garis sel MDA-MB-231 berwarna sebagai alat untuk vitalitas inkubasi menunjukkan menjadi titik waktu di mana NF tinggi k B induksi pencapaian

monitoring dan NF k aktivitas promotor B (Gambar 2) dengan lipatan rata-rata induksi 70 6 13. ada perbedaan yang signifikan
di NF k B lipat induksi kabur saat mengerami TNF Sebuah untuk waktu yang lebih
Untuk membuat garis sel MDA-MB-231 berwarna tiga, sel pertama kali
lama (48 dan 72 jam).
ditransduksi dengan lentivirus mengekspresikan PRR-L-PGKCBG99 dan dipilih
dengan membatasi pengenceran untuk mendapatkan populasi sel positif di mana
jumlah cahaya yang dihasilkan oleh reaksi bioluminescent ketat berkorelasi dengan
jumlah sel (R 2 = 0.99) (Gambar 1.C). Populasi yang dipilih menjalani transduksi kedua
dengan lentivirus mengandung pLM- NF k B PpyRE9. transmembran yang glukan
yang digunakan kembali kedua menggunakan antibodi anti-gluk untuk tidak
langsung FACS-penyortiran. Hal ini sejalan dengan seleksi tinggi vektor bicistronic.

Sebuah MTS dan uji luciferase dilakukan secara tepat di 96-baik untuk
menunjukkan antara kematian dan luminescence. Firefly dan klik cadangan enzim
kumbang yang ATP bergantung dan karena itu tidak bisa menghasilkan cahaya.
Sintesis protein inhibitor puromycin merupakan racun bagi sel-sel eukariotik dan
sebagai zat memvalidasi. Seperti dalam Gambar 1.d, output menunjukkan
puromycin (kisaran konsentrasi 0- 10 m g / ml) efek pada sel. Di duanya tes output
sinyal-sinyal misalnya, menunjukkan bahwa CBG99 menemukan luciferase hijau
(puncak emisi: 540 nm) dapat dianggap sebagai indikasi vitalitas sel.

Untuk lebih memvalidasi sel untuk NF k respons B, kami melakukan analisis waktu
tergantung TNF Sebuah- diinduksi NF k aktivasi B. Pada TNF a Sebuah konsentrasi 10
ng / ml, 24 jam
Figure 2. Time course analysis of TNF a- induced NF- k B activation in the triple color MDA-MB-231
cell line. Non-significant differences were detected in NF- k B activation between 24, 48 and 72
hours of stimulation with TNF a ( 10 ng/ml). doi:10.1371/journal.pone.0085550.g002

PLOS ONE | www.plosone.org 4 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e85550

 Multicolor Pencitraan dari NF k B Aktivitas dan Apoptosis

Gambar 3. Celastrol memiliki efek penghambatan pada TNF Sebuah- diinduksi NF k B signaling di MDA-MB-231 sel. ( 3.a) Grafik mewakili penurunan NF kali lipat k B induksi di MDA-MB-231 sel
menggunakan celastrol oleh assay multicolor (* p value, 0,05; ** nilai p, 0,01). (3.B) gambar komposit dari spektrum tidak dicampur dari mengeluarkan enzim: sinyal hijau mewakili emisi CBG99, sinyal
merah mewakili spektrum emisi PpyRE9 dan sinyal biru mewakili ekspresi ExtGluc di sel kontrol (kolom pertama) dan sel diperlakukan dengan TNF Sebuah dalam kombinasi dengan peningkatan
konsentrasi celastrol (0,1-3 m M). (3.C) Kiri: grafik melaporkan intensitas pita relatif protein p65 dari ekstrak nuklir kontrol sampel dan sampel diobati dengan TNF Sebuah ( 10 ng / ml) atau TNF a + celastrol
(0,1 m M; 0,5 m M dan 1 m M). Kanan: deteksi protein p65 dalam ekstrak nuklir dan GAPDH digunakan sebagai protein kontrol.

doi: 10.1371 / journal.pone.0085550.g003

Effects of chemopreventive natural compounds on NF- NF k aktivitas promotor B. Kolom biru menunjukkan deteksi Gaussia luciferase

k B promoter activity menyatakan setelah penambahan coelenterazine asli dan digunakan sebagai kontrol

The triple color assay was used to investigate the effects of chemopreventive tambahan untuk ekspresi dari konstruksi. Variabilitas intra-assay, dihitung sebagai

natural compounds on NF- k B signaling. Data have been corrected for the number of koefisien variasi (CV) dari sinyal tidak dicampur hijau dari sumur kontrol, adalah

cells (CBG99-green vitality signals) to normalize the fold of induction considering that sekitar 6,0% saat pengujian tersebut dilakukan dengan enam ulangan. Variabilitas

some compounds induce cell death through apoptosis already after a short antar-assay, dihitung dari sembilan bagian sel berturut-turut, jauh lebih tinggi dari

incubation time. For instance, already 4 hours of incubation with celastrol, an active variabilitas intra-assay dengan CV dikumpulkan untuk semua kontrol assay dari

ingredient of the traditional Chinese medicinal plant Tripterygium wilfordii, telah 34%.

ditunjukkan untuk memodulasi efek antikanker dan diinduksi apoptosis dalam

berbagai sel kanker yang berbeda [36,37]. Hasil kami menunjukkan bahwa Untuk mengkonfirmasi efek celastrol pada TNF Sebuah- diinduksi NF k B signaling di

pengobatan sel dengan celastrol jelas menunjukkan penghambatan yang signifikan MDA-MB-231 sel, analisis western blot protein p65 di ekstrak sel nuklir dilakukan. Seperti

TNF Sebuah- diinduksi NF k Kegiatan B promotor setelah 24 jam dalam berbagai ditunjukkan dalam Gambar 3.C, TNF Sebuah pengobatan meningkatkan jumlah p65

konsentrasi 0,1-2 m M (p, 0,05 untuk 0,1-0,5 m M; p, dalam inti sementara penambahan celastrol memiliki efek penghambatan pada TNF yang Sebuah-
diinduksi NF k B signaling. Data dalam grafik yang dinormalisasi menggunakan GAPDH
protein sebagai kontrol untuk beban total protein.

0,01 untuk 1-2 m M). Data dikoreksi untuk vitalitas sel yang diukur dengan ekspresi
CBG99 hijau luciferase (Gambar 3.a). Gambar 3.B menunjukkan gambar wakil dari Resveratrol, sebuah polifenol yang ditemukan dalam konsentrasi tinggi dan berpikir untuk

assay dilakukan setelah penerapan algoritma unmixing untuk gambar: kolom hijau memberikan beberapa properti yang bermanfaat dari anggur merah [38], menunjukkan efek

sumur menunjukkan deteksi CBG99 sinyal luciferase hijau sedangkan merah-oranye penghambatan yang signifikan pada TNF Sebuah- diinduksi NF

untuk kolom kuning menunjukkan sel diperlakukan dengan TNF Sebuah ditambah k aktivitas promotor B di MDA-MB-231 sel pada konsentrasi mulai 1-200 m M setelah

meningkatnya konsentrasi celastrol. Penurunan sinyal merah merupakan indikasi 24 jam (p, 0,05 untuk 1-10 m M;

untuk penghambatan p, 0,01 untuk 50-200 m M). Sulphoraphane, sebuah kemopreventif dan anti-inflamasi
senyawa [39,40] ampuh, juga diberikan sebuah

PLoS ONE | www.plosone.org 5 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550


Gambar 4. Pengaruh senyawa alami kemopreventif pada NF k aktivitas promotor B. Grafik mewakili efek pada NF k B induksi di MDA-MB-231 sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda dari
resveratrol (4.A), sulphoraphane (4.b), curcumin (4.c) dan asam betulinic (4.D) (* nilai p,
0,05; ** p value, 0,01).
doi: 10.1371 / journal.pone.0085550.g004
efek penghambatan TNF Sebuah- diinduksi NF k aktivitas promotor B di MDA-MB-231
sel dalam berbagai 5-100 m M dengan signifikansi yang lebih tinggi (p, 0,01 20-100 m
M). Juga kurkumin, yang berasal dari kunyit ( Curcuma longa) [ 41], yang telah dikenal
karena sifat anti-inflamasi, menunjukkan efek yang sama sudah di 20 m M (p, 0,05
untuk 10 m M; p, 0,01 untuk 20 m M).
Sebaliknya, asam betulinic, sebuah triterpenoid pentasiklik alami ditunjukkan
untuk menunjukkan berbagai aktivitas biologis, peningkatan TNF yang Sebuah- diinduksi
NF k Kegiatan promotor B secara signifikan pada 30 m M menunjukkan efek aditif
dalam kombinasi dengan TNF Sebuah aktivitas setelah 24 jam [42]. Hasilnya
ditunjukkan pada Gambar 4. Selain itu, analisis western blot mengkonfirmasikan
adanya peningkatan p65 dalam fraksi nuklir sel diperlakukan dengan TNF Sebuah dan
30 m M of Betulinic acid (Figure S1).
In vivo monitoring of NF- k B signaling by
bioluminescence imaging
Injection of the triple colored MDA-MB-231 cell line in the mammary fat pad
induced tumor growth in mice. Tumor development was followed by CBG99 BLI for
three weeks (Figure 5.A). At that timepoint animals received a dose of TNF a
(20 m g/kg) to induce NF- k B dependent PpyRE9 red luciferase expression to validate
dual color imaging in vivo. For the analysis the red/green signals were spectrally
resolved (Figure 5.B) from the series of images taken using the 20 nm band pass
filters applying a spectral unmixing algorithm. Animal receiving TNF a
showed an increased light output in the image collected using red
PLoS ONE | www.plosone.org
Multicolor Pencitraan dari NF k B Aktivitas dan Apoptosis
filters clearly detectable after 24 hours compared to control images taken at initial
time point (t =0 h) (Figure 5.C). An average 2.6 fold induction of NF- k B was
measured by analysing the red signal at t =24 h. Moreover, ex vivo imaging of the
tumor directly after the in vivo imaging session confirmed the induction of NF- k B
PpyRE9 luciferase (Figure 5.D). Additional immunohistochemistry of the excised
tumors confirmed the presence of Gaussia luciferase on the surface of the cells
(Figure 5.E).
To confirm the efficacy of celastrol on NF- k B signaling in vivo,
mice were injected with the triple colored cells and treated with TNF a ( 20 m g/kg) in
combination with celastrol. Analysis of NF-
k B induction, corrected for the green CBG99 signals at 0 and after 24 hours,
revealed an increased red/green signal ratio (2.5 6 0.3) when treated with TNF a. This
ratio is significantly different (p,
0.05) from that of mice treated with celastrol (red/green signal ratio of 1.2 6 0.1)
showing an in vivo inhibitory effect of celastrol on NF- k Kegiatan B (Gambar 6).
Caspase 3/7-dimediasi apoptosis setelah pengobatan dengan senyawa
alami kemopreventif
Induksi apoptosis oleh senyawa kemopreventif diukur dengan menggunakan
luciferase prosubstrate kunang-kunang yang berisi DEVD tetrapeptide urutan. Untuk
percobaan ini, triplecolored MDA-MB-231 sel diinkubasi dengan senyawa alami yang
berbeda tanpa adanya TNF Sebuah. Konstitutif CBG99 ekspresi luciferase diizinkan
untuk memantau kelangsungan hidup sel-sel secara paralel dengan caspase 3/7
kegiatan. Setelah 4 jam inkubasi
6 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550
 Multicolor Imaging of NF- k B Activity and Apoptosis

Gambar 5. in vivo pemantauan NF k B signaling oleh bioluminescence pencitraan. kurva pertumbuhan triple berwarna MDA-MB-231 sel ditanamkan di pad lemak susu dari tikus athymic wanita dan
diukur dengan BLI (5A). Merah dan luciferase emisi spektrum hijau yang dihasilkan dari analisis unmixing spektral diterapkan pada rangkaian gambar yang diperoleh (5B). Gambar perwakilan dari
gambar tidak dicampur dan komposit diperoleh dengan aplikasi algoritma unmixing pada 0 dan 24 jam setelah TNF Sebuah injeksi pada model tikus kanker payudara (5.C). Di sebelah kiri, gambar yang
sesuai dengan sinyal hijau (vitalitas) sementara di tengah gambar yang sesuai dengan sinyal merah (NF k B induction). The graphs represent the average unmixed red and green signals obtained 0 and
24 hours after TNF a injection in three different mice. (5.D) Representative picture of unmixed images obtained with ex vivo analysis of tumors derived from mice challenged with or without TNF a. ( 5.E)
Image showing Gluc expression on the membrane of cells derived from excised tumors and detected using a polyclonal anti-Gluc antibody and a FITC-conjugated secondary antibody.
doi:10.1371/journal.pone.0085550.g005

PLOS ONE | www.plosone.org 7 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e85550


Gambar 6. Celastrol memiliki efek penghambatan pada TNF Sebuah- diinduksi NF k B sinyal pada
sel kanker payudara in vivo. Grafik pelaporan / rasio sinyal merah hijau yang diukur dalam
kelompok diobati dengan TNF Sebuah atau TNF a + celastrol (2 mg / kg) pada 0 dan 24 jam.
Pengobatan dengan celastrol menurunkan merah / hijau rasio sinyal berdemonstrasi untuk
bertindak atas NF k B signaling.
doi: 10.1371 / journal.pone.0085550.g006
celastrol, sulphoraphane, curcumin and betulinic acid induced high caspase 3/7
activity at 1 m M, 50 m M, 20 m M and 10 m M, respectively. Interestingly, resveratrol
induced apoptosis at a concentration of 1 m M. Namun, caspase 3/7 kegiatan tidak
secara signifikan lebih tinggi dari induksi basal kontrol apoptosis menunjukkan
bahwa resveratrol menyebabkan kematian sel yang paling mungkin dalam caspase
3/7 secara independen (Gambar 7).
Selain itu, celastrol juga mampu menginduksi caspase 3/7 kegiatan
in vivo ( Angka 8). Setelah pengobatan dengan celastrol, tikus menunjukkan sinyal
luminescence signifikan lebih tinggi (kali lipat dari induksi
1,5 6 0,2 p, 0,05 pada 4 jam dan 2,1 6 0,3 p, 0,001 pada 24 jam) sinyal luminescence
kemudian basal pada t = 0 jam. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam sinyal
luminescence ditemukan pada tikus kontrol non-diobati.
Diskusi
Induksi NF k B signaling dan apoptosis adalah beberapa proses kunci dalam kanker.
senyawa alami yang berasal dari tumbuhan telah terbukti mempengaruhi proses-proses
kunci dan penggunaannya yang muncul dalam pengobatan kanker. Untuk alasan ini kami
dihasilkan platform bioluminescence pencitraan multicolor untuk menyelidiki efek dari
senyawa alami yang diturunkan dari tanaman di NF k aktivitas B dan apoptosis untuk kedua in
vitro dan in vivo analisis.
Kami mampu untuk mengungkapkan efek dari senyawa alami yang berasal dari
tumbuhan (celastrol, resveratrol, kurkumin dan sulphoraphane) di NF k B signaling dan
kelangsungan hidup metastasis itu, triple negative sel kanker payudara manusia
MDA-MB-231. Hasil kami memberikan wawasan baru yang berguna dalam efek dari
senyawa yang berbeda di NF k B transkripsi bawah regulasi pada sel kanker payudara
manusia dan membuka kemungkinan baru untuk menyelidiki NF k B signaling in other
established human cancer cell lines by implementing the triple colored bioluminescent
reporter cell system.
Lentiviral vector technology is an efficient method to stably and randomly
integrate foreign DNA in dividing and non-dividing cells. The possibility of sequential
transductions allowed us to select the cell population with the desired expression
profile. Once the stable cell line is generated, the time of the assay is consistently
reduced compared to traditional transcriptional assays because the transient
transfection step is eliminated. Moreover, the off-target effects caused by the
transfection reagents, i.e. cytotoxicity and impact on transcript level, are now avoided
[43].
PLoS ONE | www.plosone.org
Multicolor Pencitraan dari NF k B Aktivitas dan Apoptosis
Pilihan promotor PGK untuk sel-sel kanker mamalia memastikan tingkat baik
ekspresi konstitutif dari CBG99 luciferase hijau. Korelasi yang baik antara uji MTS
dan sinyal CBG99 menegaskan bahwa CBG99 bisa berfungsi sebagai indikator
viabilitas sel. Akibatnya, luciferase memancarkan hijau telah digunakan untuk
mengukur viabilitas sel di in vitro
tes tetapi juga di in vivo menggunakan bioluminescence pencitraan.
Pengenalan vektor dua arah bicistronic di luc CBG mengungkapkan garis sel
memungkinkan penciptaan garis sel MDAMB-231 berwarna tiga mengekspresikan
merah PpyRE9 luciferase dikendalikan oleh NF k B promotor dan bentuk
transmembran dari Gaussia luciferase, didorong oleh promotor PGK. Validasi lini sel
ini tiga berwarna MDA-MB-231 mengungkapkan bahwa NF k B induksi dengan TNF Sebuah
bisa dengan mudah dipantau sudah setelah 4 dan 8 jam dengan induksi sangat kuat
setelah 24 jam. titik waktu ini adalah optimal saat melakukan eksperimen inhibisi
dengan senyawa alami. 5 salinan NF k elemen respon B terletak hulu dari CMV
promotor minimal telah terbukti menghasilkan NF tinggi k B induksi dengan TNF Sebuah
[ 44].
Sejak celastrol telah ditunjukkan untuk bertindak atas NF
k B jalur [36] kita divalidasi assay berdasarkan sel kita dengan menunjukkan bahwa NF k B
penghambatan bertepatan dengan p65 ekspresi protein menurun pada inti dari
MDA-MB-231 sel. Kami juga menemukan bahwa dosis yang menyebabkan NF k B
penghambatan juga menyebabkan caspase-3/7 bergantung apoptosis setelah 4 jam
sudah pada konsentrasi
0,1 m M [37,45].
In analogy we tested other natural compounds (e.g. resveratrol, curcumin,
sulphoraphane and betulinic acid) to investigate their activity on TNF a- induced NF- k B
promoter activity and whether they can induce caspase-3/7 dependent apoptosis.
Results showed that resveratrol significantly inhibited the TNF a- induced NF- k B
promoter activity already at a concentration of 1 m M and induced caspase-3/7
dependent apoptosis as early after 4 hours as described earlier [46–48]. At higher
concentrations it was not possible to detect caspase 3/7 activity due to massive cell
death caused by (a) caspase 3/7 independent mechanism(s).
Addition of sulphoraphane resulted in a reduction on TNF a-
induced NF- k Aktivitas promoter B dan induksi apoptosis tergantung caspase 3/7
yang sesuai dengan literatur sebelumnya [39,40]. Beberapa penelitian
mengungkapkan bahwa sulphoraphane tidak hanya bertindak sebagai obat
kemopreventif, tetapi juga sebagai agen kemoterapi pada tumor kolon dan pankreas
[49] dan baru-baru ini efeknya pada sel induk kanker payudara telah dibuktikan [50].
Menariknya, kapasitasnya untuk mengaktifkan kembali reseptor estrogen (ER)
ekspresi dalam sel kanker payudara ER-negatif dengan modifikasi kromatin aktif
juga telah ditunjukkan [51].
Seperti yang ditunjukkan sebelumnya [41,52], efek kurkumin yang signifikan pada
pengurangan TNF Sebuah- diinduksi NF- k Aktivitas promoter B dan aktivitas
caspase-3 terlihat pada konsentrasi 20 m M. Curcumin juga telah terbukti efektif
dalam terapi antikanker tidak hanya sebagai obat kemopreventif tetapi juga sebagai
coadjuvant dalam terapi kanker payudara. Kurkumin dan analognya yang lebih kuat
telah terbukti membunuh [52,53] sel kanker payudara dan mengurangi potensi
metastatik. Namun, bioavailabilitas kurkumin in vivo masih merupakan masalah untuk
penggunaan klinisnya. Analog kurkumin yang lebih kuat telah dijelaskan yang
menurunkan dosis efektif in vivo. Hasil terbaru menunjukkan bahwa peningkatan
analog kurkumin seperti UBS109 dan EF31 [54], sudah efektif dengan dosis 1 m M,
dan akan mewakili perbaikan yang besar terhadap penggunaan klinis dari kurkumin
dalam terapi adjuvant kanker payudara (Mezzanotte L, hasil tidak dipublikasikan).
Formulasi berdasarkan Nanomaterials untuk biodistribusi efektif kurkumin telah
digunakan pada kanker payudara metastatik [55-57]. sistem pengiriman berbasis
nanoteknologi untuk lebih kuat kurkumin ana-
8 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550

Gambar 7. Efek senyawa alami kemopreventif pada caspase 3/7-dimediasi apoptosis in vitro. Grafik mewakili caspase 3/7 aktivitas pengukuran dengan caspase 3/7 assay Glo dan dikoreksi untuk
vitalitas sel pada 4 jam setelah pengobatan dengan celastrol (7.Seorang) resveratrol (7.b), sulphoraphane (7.C), kurkumin (7. D) dan asam betulinic (7.E). doi: 10.1371 / journal.pone.0085550.g007
logues untuk meningkatkan bioavailabilitas mereka akan meningkatkan efektivitas pengobatan
kanker.
Kami in vitro Hasil dari percobaan pada apoptosis dan NF k B menandakan memperkuat
hipotesis bahwa celastrol, dan kurang poten resveratrol, dapat digunakan sebagai terapi
adjuvant untuk pengobatan kanker payudara triple negatif karena mereka menunjukkan
efek penghambatan NF
k B signaling dan induksi apoptosis pada skala mikromolar. Sulphoraphane dan
kurkumin juga efektif, meskipun pada tingkat lebih rendah. Asam Betulinic tidak
memiliki efek penghambatan pada NF k B signaling meskipun masih efektif untuk
pengobatan kanker karena menyebabkan apoptosis sel-sel kanker yang mungkin
tidak dimediasi oleh NF k Downregulation B. Diperkirakan rendahnya variasi untuk
kedua intra-assay dan variabilitas antar-assay yang tersedia dalam format piring
96-baik, akan ada sifat yang memungkinkan untuk tiga-warna MDA-MB-231 sel
assay yang sama dengan keseluruhan layar melalui melayang-layang. yang
diperlukan untuk melakukan skrining [58].
PLoS ONE | www.plosone.org
Pencitraan Multicolor dari NF k B Aktivitas dan Apoptosis
Selain itu, pendekatan multicolor yang sama dapat diterapkan untuk memantau jalur
yang berbeda dalam sel jalur lain.
The relatif tinggi fluks foton sel rata-rata dari tiga warna garis sel MDA-MB-231 in vitro
( 900 dan 1500 ph / sec / sel untuk CBG99 dan extGluc, masing-masing) memungkinkan
untuk melakukan BLI mikroskop pada sel tunggal. Data awal menunjukkan kelayakan
pencitraan sel tunggal menggunakan bioluminescence mikroskop dengan menambahkan
0,2 MMD-luciferin atau 20 mM dari coelenterazine asli sel kultur (data tidak
ditampilkan). Untuk warna yang dipulang bioluminescent dilengkapi dengan filter
optik yang tepat diperlukan [59]. Hidup dengan pencitraan dan contoh yang lebih
baik dari tes-tes biokimia dan dapat digunakan untuk data yang memungkinkan dari
berbagai aktivator atau inhibitor pada konsentrasi yang berbeda pada tingkat waktu.
Perkembangan warna dari tiga buah kanker dan terbukti bermanfaat untuk in vivo
Studi meningkatkan
9 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550

Gambar 8. Celastrol menginduksi caspase 3/7-dimediasi apoptosis in vivo. Grafik melaporkan in vivo caspase 3/7 aktivitas diukur dengan menggunakan DEVDluciferin di kontrol dan diperlakukan
kelompok pada 0 jam, 4 jam dan 24 jam. Sebuah pengobatan tunggal celastrol (2 mg / kg) secara signifikan meningkatkan induksi kali lipat dari caspase 3/7 kegiatan pada 24 jam dibandingkan dengan
kontrol (* p value, 0,05; ** nilai p, 0,01). doi: 10.1371 / journal.pone.0085550.g008
prediktabilitas model praklinis untuk pengujian obat. Setelah suntikan sel di lapisan
lemak susu, pertumbuhan tumor dapat dicitrakan dengan cara bioluminescence
pencitraan. pertumbuhan tumor diikuti selama tiga minggu mengukur sinyal yang
berasal dari CBG99 luciferase. Saat itu tumor titik mencapai ukuran teraba dan tikus
ditantang dengan TNF Sebuah untuk menguji NF k aktivitas promotor B. Setelah induksi
dengan TNF Sebuah, gambar bercahaya diambil menggunakan serangkaian filter band
pass dan algoritma unmixing spektral diterapkan untuk membedakan sinyal hijau
CBG99 dari PpyRE9 sinyal merah [11]. Hasil penelitian kami menunjukkan
kemungkinan untuk menerapkan analisis citra multicolor dan mengevaluasi efek obat
pada NF k B signaling in vivo dengan menggunakan satu suntikan substrat tunggal
dimana total emisi cahaya dari tumor lebih tinggi dari 10 7 ph / s (pada hari 21). ex vivo analisisSupporting Information
tumor menegaskan bahwa tikus ditantang dengan TNF Sebuah menunjukkan sinyal
meningkat di wilayah merah spektrum karena induksi NF k B-driven ekspresi PpyRE9.
imunohistokimia tambahan menunjukkan adanya Gaussia luciferase pada membran
sel kanker dan mengungkapkan bahwa ekspresi konstruk bicistronic secara stabil
dipertahankan pada sekitar 90% dari sel-sel kanker payudara selama pertumbuhan
mereka in vivo. Keuntungan utama menggunakan extGluc dalam model kami adalah
kemungkinan untuk menyortir sel oleh FACS dan untuk mendeteksi mereka berdua in
vitro dan ex vivo. Oleh karena itu, extGluc dapat digunakan sebagai tag tertentu yang
tidak memiliki toksisitas pada sel berbeda dengan beberapa protein fluorescent [60,61].
Hewan diobati dengan TNF Sebuah untuk menginduksi NF k B-driven PpyRE9
ekspresi sendiri atau dalam kombinasi dengan celastrol untuk menentukan in vivo Efek
dari dosis tunggal obat di NF k aktivitas promotor B. Celastrol dipilih karena itu yang
paling ampuh NF k B inhibitor antara senyawa yang diuji dan disuntikkan
intratumorally untuk memastikan bioavailabilitas yang baik. Rasio antara sinyal tidak
dicampur merah dan sinyal tidak dicampur hijau diperbolehkan mengukur efek
celastrol di NF k aktivitas promotor B. Selain itu, kami mampu gambar aktivitas
caspase 3/7 secara real time dan menentukan efek celastrol setelah
PLoS ONE | www.plosone.org
Multicolor Pencitraan dari NF k B Aktivitas dan Apoptosis
24 jam pada tikus menggunakan substrat DEVD-luciferin seperti yang dilaporkan dalam pekerjaan sebelumnya
[32].
Kesimpulannya, dikembangkan multicolor platform yang pencitraan optik kami
memungkinkan penyelidikan simultan NF k B signaling dan apoptosis diinduksi oleh
obat seperti ditegaskan oleh kedua kami in vitro dan in vivo studi menggunakan
celastrol. Platform pencitraan baru membuka peluang baru untuk menguji efikasi dan
bioavailabilitas (formulasi baru) senyawa yang bertindak atas NF k B signaling for
single time point experiments in small animals.
Figure S1 Increased presence of p65 in the nuclear fraction of MDA-MB-231 cells
after treatment with TNF a
and Betulinic acid. Western Blot analysis. Left: graph reporting the relative band
intensity of p65 protein from the nuclear extracts of control sample and samples
treated with TNF a ( 10 ng/ml) or TNF a + betulinic acid (0.5 m M; 1 m M; 10 m M and 30 m
M). Right: p65 protein detection in nuclear extracts and GAPDH used as control
protein. (TIF)
Acknowledgments
Kami mengakui Prof. Rob Hoeben dan Martijn Rabelink dari Departemen Molecular Cell Biology
of Leiden University Medical Center untuk produksi lentiviral, Prof. Bruce Branchini dari
Connecticut College, New London, untuk hadiah jenis gen luciferase PpyRE9 dan Prof. Marcel
van den Brink, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NY, untuk menyediakan vektor lentiviral
dua arah membawa ExtGluc (pNFAT).
penulis Kontribusi
Disusun dan dirancang percobaan: LM CL EK. Melakukan percobaan: LM NA IM. Menganalisis
data: LM CL EK. Kontribusi reagen / bahan / alat analisis: CL. Menulis kertas: LM CL EK.
10 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550

Referensi
1. Michelini E, Cevenini L, Mezzanotte L, Coppa A, Roda A (2010) tes berbasis Sel: memicu penemuan obat.
Anal Bioanal Chem 398, 227-238.
2. Brasier AR, Ron D (1992) Luciferase assay gen pelapor dalam sel mamalia. Metode Enzymol. 216, 386-97.
3. Kayu KV (1990) gen Luc: pengenalan warna dalam tes bioluminescence. J Biolumin Chemilumin. 5,107-114.
4. Contag CH, Jenkins D, Contag PR, Negrin RS (2000) Penggunaan gen reporter untuk pengukuran optik
penyakit neoplastik in vivo. Neoplasia 2, 41-52.
5. De A, Lewis XZ, Gambhir SS (2003) pencitraan noninvasif wartawan ekspresi gen lentiviral-dimediasi pada
tikus hidup. Mol Ther. 7, 681-691.
6. Hosseinkhani S (2011) enigma Molekuler bioluminescence multicolor dari luciferase kunang-kunang. Sel Mol
Hidup Sci. 7, 1167-1182.
7. Branchini BR, Ablamsky DM, Murtiashaw MH, Uzasci L, Fraga H, et al. (2007) termostabil merah dan hijau
mutan kunang-kunang luciferase cahaya memproduksi untuk aplikasi reporter bercahaya. Anal Biochem
361, 253-262.
8. Nakajima Y, Kimura T, Sugata K, Enomoto T, Asakawa A, et al. Sistem (2005) multicolor luciferase assay:
satu langkah pemantauan beberapa ekspresi gen dengan substrat tunggal. Biotechniques 38, 891-894.
9. Michelini E, Cevenini L, Mezzanotte L, Ablamsky D, Southworth T, et al. (2008) teknologi gen
spektral-diselesaikan untuk bioluminescent multiplexing cellbased tes dan skrining tinggi konten. Anal
Chem 80, 260-267.
10. Gammon ST, Leevy WM, Gross S, Gokel GW, Piwnica-Worms D (2006) unmixing spektral dari
bioluminescence warna-warni yang dipancarkan dari sumber-sumber biologis yang heterogen. Anal Chem
78, 1520-1527.
11. Mezzanotte L, Que saya, Kaijzel EL, Branchini B, Roda A, et al. (2011) Sensitif warna ganda in vivo pencitraan
bioluminescence menggunakan kodon merah baru dioptimalkan kunang-kunang luciferase dan klik kumbang
luciferase hijau. PLoS ONE 6, e19277.
12. Wurdinger T, Badr C, Pike L, de Kleine R, Weissleder R, et al. (2008) Sebuah luciferase disekresikan untuk
ex vivo pemantauan proses in vivo. Nat Metode 5, 171-173.
13. Loening AM, Wu AM, Gambhir SS (2007) Red-bergeser Renilla reniformis varian luciferase untuk pencitraan
dalam mata pelajaran hidup. Metode Nat. 4, 641-643.
14. Yamagishi K, Enomoto T, Ohmiya Y (2006) Perfusi-berbasis budaya disekresikan bioluminescence reporter
assay dalam sel hidup. Anal Biochem 354, 15-21.
15. Fan F, Kayu KV (2007) tes Bioluminescent untuk skrining high-throughput. Assay Obat Dev Technol 5,
127-136.
16. Stell A, Belcredito S, Ramachandran B, Biserni A, Rando G, et al. (2007) pencitraan multimodality: aplikasi
farmakologis novel sistem reporter. QJ Nucl Med Mol. Pencitraan 51, 127-138.
17. Liu M, Sakamaki T, Casimiro MC, Willmarth NE, Quong AA, et al. (2010) kanonik NF-kappaB jalur mengatur
tumorigenesis susu pada tikus transgenik dan ekspansi sel tumor batang. Kanker Res. 70, 10.464-10.473.
18. Huber MA, Beug H, Wirth T (2004) transisi epitel-mesenchymal: NFkappaB mengambil tengah panggung.
Siklus Sel 3, 1477-1480.
19. Karin M, Greten FR (2005) NF-kappaB: menghubungkan peradangan dan kekebalan terhadap perkembangan
kanker dan kemajuan. Nat Rev Immunol. 5, 749-759.
20. Prasad S, Ravindran J, Aggarwal BB (2010) NF-kappaB dan kanker: bagaimana intim hubungan ini. Mol Sel
Biochem. 336, 25-37.
21. Lin Y, Bai L, Chen W, Xu S (2010) jalur aktivasi NF-kappaB, muncul target molekul untuk pencegahan kanker
dan terapi. Target ahli Opin Ther. 14, 45-55.
22. Haefner B. (2006) Target NF-kappaB di antikanker kemoterapi ajuvan. Kanker Perlakukan Res. 130,
219-245.
23. Katula KS, McCain JA, Radewicz AT (2005) kemampuan relatif dari senyawa diet untuk memodulasi aktivitas
faktor-kappaB nuklir sebagai dinilai dalam sistem reporter cellbased. J. Med. Makanan 8, 269-274.
24. Ralhan R, Pandey MK, Aggarwal BB (2009) Nuklir faktor-kappa B link agen karsinogenik dan kemopreventif.
Depan. Biosci. (Sekolah ed) 1, 45-60.
25. Castillo-Pichardo L, Marti 'nez-Montemayor MM, Marti 'nez JE, Dinding KM,
Cubano LA, et al. (2009) Penghambatan pertumbuhan tumor mammae dan metastasis ke tulang dan hati
oleh polifenol anggur diet. Clin. Exp. Metastasis 26, 505-
516.
26. Jeong WS, Kim IW, Hu R, Kong AN (2004) sifat modulator dari berbagai agen kemopreventif alami pada
aktivasi NF-kappaB sinyal jalur. Pharm. Res. 21, 661-670.
27. Robbins D, Zhao Y (2011) Pencitraan NF k B signaling pada tikus untuk skrining
obat antikanker. Metode Mol. Biol. 716, 169-177.
28. Ashall L, Horton CA, Nelson DE, Paszek P, Harper CV, et al. (2009) stimulasi berdenyut menentukan waktu
dan spesifisitas transkripsi NF-kappaB-dependent. Ilmu 324, 242-246.
29. Bartfeld S, Hess S, Bauer B, Machuy N, Ogilvie LA, et al. (2010) Highthroughput dan single-sel pencitraan
dari NF-kappaB osilasi menggunakan jalur sel monoklonal. BMC Sel Biol. 16, 11:21.
30. Gross S, dan Piwnica-Worms D (2005) Real-time pencitraan aktivasi IKK ligan-diinduksi dalam sel utuh dan
pada tikus hidup. Metode Nat. 2, 607-614.
31. Carlsen H, Moskaug JO, Fromm SH, Blomhoff R (2002). Dalam pencitraan vivo aktivitas NFkappa B. J
Immunol. 1; 1441-6.
32. Scabini M, Stellari F, Cappella P, Rizzitano S, Texido G, et al. (2011) In vivo pencitraan apoptosis tahap awal
dengan mengukur real-time caspase-3/7 activatio-
n.Apoptosis. 16: 198-207.
PLOS ONE | www.plosone.org
Multicolor Imaging of NF- k B Activity and Apoptosis
33. Carlotti F, Bazuine M, Kekarainen T, Seppen J, Pognonec P, et al. (2004) vektor Lentiviral efisien transduce
diam adiposit matang 3T3-L1. Mol. Ther. 9, 209-217.
34. Branchini BR, Ablamsky DM, Davis AL, Southworth TL, Butler B, et al. (2010) mengeluarkan enzim
Merah-emitting untuk reporter bioluminescence dan pencitraan aplikasi. Anal. Biochem. 396, 290-297.
35. Na IK, Markley JC, Tsai JJ, Yim NL, Beattie BJ, et al. (2010) visualisasi serentak perdagangan, ekspansi,
dan aktivasi limfosit T dan prekursor Tcell in vivo. Darah 116: e18-25.
36. Sethi G, Ahn KS, Pandey MK, Aggarwal BB (2007) Celastrol, sebuah triterpen baru, mempotensiasi
apoptosis TNF-diinduksi dan menekan invasi sel tumor dengan menghambat produk gen
NF-kappaB-diatur dan TAK1-dimediasi aktivasi NF-kappaB . Darah. 109, 2727-2735.
37. Kannaiyan R, Manu KA, Chen L, Li F, Rajendran P, et al. (2011) Celastrol menghambat proliferasi sel tumor
dan meningkatkan apoptosis melalui aktivasi c-Juni N-terminal kinase dan penindasan PI3 K / Akt jalur
sinyal. Apoptosis 16, 1028-1041.
38. Pozo-Guisado E, Merino JM, Mulero-Navarro S, Lorenzo-Benayas MJ, Centeno F, et al. (2005) apoptosis
Resveratrol-diinduksi dalam MCF-7 sel kanker payudara manusia melibatkan mekanisme
caspase-independen dengan downregulation Bcl-2 dan NF-kappaB. Int. Kanker J.. 116, 1004.
39. Bulan DO, Kim MO, Kang SH, Choi YH, Kim GY (2009) Sulforaphane menekan aktivasi TNF-alpha-dimediasi
NF-kappaB dan menginduksi apoptosis melalui aktivasi spesies tergantung oksigen reaktif caspase-3.
Kanker Lett.
274, 132-142.
40. Kallifatidis G, Rausch V, Baumann B, Apel A, Beckermann BM, et al. (2009) Sulforaphane menargetkan
pankreas sel tumor-memulai dengan NF-kappaB diinduksi sinyal anti-apoptosis. Gut 58, 949-963.
41. Chiu TL, Su CC (2009) Curcumin menghambat proliferasi dan migrasi dengan meningkatkan Bax untuk Bcl-2
rasio dan penurunan ekspresi NF-kappaBp65 pada kanker payudara MDA-MB-231 sel. Int. J. Mol. Med.
23,469-475.
42. Kasperczyk H, La Ferla-Bruhl K, Westhoff MA, Behrend L, Zwacka RM, et al. (2005) asam Betulinic sebagai
penggerak baru NF-kappaB: mekanisme molekuler dan implikasi untuk terapi kanker. Onkogen 24,
6945-6956.
43. Jacobsen L, Calvin S, Lobenhofer E (2009) efek transkripsi transfeksi: potensi kesalahan interpretasi data
ekspresi gen yang dihasilkan dari sel-sel transiently transfeksi. Biotechniques 47.825.
44. Badr CE, Niers JM, Tjon-Kon-Fat LA, Noske DP, Wurdinger T, et al. (2009) Real-time monitoring faktor nuklir
aktivitas kappaB dalam sel kultur dan pada model binatang. Mol. Pencitraan 8, 278-290.
45. Sung B, Taman B, Yadav VR, Aggarwal BB (2010) Celastrol, sebuah triterpen, meningkatkan apoptosis
TRAIL-diinduksi melalui down-regulasi protein kelangsungan hidup sel dan up-regulasi reseptor kematian.
J. Biol. Chem. 285, 11.498-11.507.
46. ​Scarlatti F, Sala G, Somenzi G, Signorelli P, Sacchi N, et al. (2003) Resveratrol menginduksi penghambatan
pertumbuhan dan apoptosis pada sel kanker payudara metastatik melalui de novo ceramide signaling. FASEB
J. 17, 2339-2341.
47. Nguyen TH, Mustafa FB, Pervaiz S, Ng FS, Lim LH (2008) ERK1 / 2 aktivasi diperlukan untuk apoptosis
resveratrol yang diinduksi di MDA-MB-231 sel. Int. J. Oncol. 33, 81-92.
48. Tang HY, Shih A, Cao HJ, Davis FB, Davis PJ, et al. (2006) Resveratrol-induced cyclooxygenase-2
memfasilitasi apoptosis p53-dependent pada sel kanker payudara manusia. Mol Kanker Ther. 5,
2034-2042.
49. Lampe JW. (2009) Sulforaphane: dari kemoprevensi pengobatan kanker pankreas? Gut 58, 900-902.
50. Li Y, Zhang T, Korkaya H, Liu S, Lee HF, et al. (2010) Sulforaphane, komponen diet tunas brokoli / brokoli,
menghambat sel induk kanker payudara. Clin Kanker Res. 16, 2580-2590.
51. Meeran SM, Patel SN, Li Y, Shukla S, Tollefsbol TO (2012) Bioactive suplemen diet mengaktifkan ekspresi
ER di sel kanker payudara ER-negatif dengan modifikasi kromatin aktif. PLoS ONE 7, e37748.
52. Zong H, Wang F, Fan QX, Wang LX (2012) Curcumin menghambat perkembangan metastasis sel kanker
payudara melalui penekanan aktivator plasminogen urokinase oleh jalur pensinyalan NF-kappa B. Mol.
Biol. Rep. 39, 4803–4808.
53. Kim SR, Park HJ, Bae YH, Ahn SC, Wee HJ, dkk. (2012) Curcumin menurunkan regulasi ekspresi visfatin
dan menghambat invasi sel kanker payudara. Endokrinologi 153, 554–563.
54. Sun A, Lu YJ, Hu H, Shoji M, Liotta DC, et al. (2009) Curcumin analog sitotoksisitas terhadap sel kanker
payudara: eksploitasi mekanisme redoks tergantung. Bioorg Med Chem Lett. 19, 6627–31.
55. Anand P, Kunnumakkara AB, Newman RA, Aggarwal BB (2007) Bioavailabilitas kurkumin: masalah dan janji.
Mol. Pharm. 4, 807–818.
56. Yallapu MM, Gupta BK, Jaggi M, Chauhan SC (2010) Fabrication of curcumin encapsulated PLGA
nanoparticles for improved therapeutic effects in metastatic cancer cells. J. Colloid. Interface. Sci. 351,
19–29.
57. Thamake SI, Raut SL, Gryczynski Z, Ranjan AP, Vishwanatha JK (2012) Alendronate coated
poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticles for active targeting of metastatic breast cancer.
Biomaterials 33, 7164–7173.
58. Maddox CB, Rasmussen L, White EL (2008) Adapting Cell-Based Assays to the High Throughput Screening
Platform: Problems Encountered and Lessons Learned. JALA Charlottesv. Va. 13, 168–173.
11 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e85550
 Multicolor Pencitraan NF- k Aktivitas B dan Apoptosis

59. Kwon H, Enomoto T, Shimogawara M, Yasuda K, Nakajima Y, dkk. (2010) Pencitraan bioluminescence 60. Liu HS, Jan MS, Chou CH, Chen PH, Ke NJ (1999) Apakah protein fluorescent hijau beracun bagi sel-sel
ekspresi gen ganda pada tingkat sel tunggal. Bioteknologi 48, 460–462. hidup? Biochem. dan Res Biophys.l. Comm.260, 712–717.
61. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005). Panduan untuk memilih protein fluorescent. Metode Nat. 2,
905–9.

PLOS ONE | www.plosone.org 12 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e85550