UJIAN TENGAH SEMESTER

SEMESTER 1

Disusun oleh :

Nama Mahasiswa : Rheza Rizaldy

NIM : MBK.20.16.01.0210
Mata Kuliah : Instrumentasi
Semester : 1 (Satu)
Penguji : Dr.dr. H Agung Putra, M.Si. Med.

Soal Ujian Intrumentasi

“Immunostaining dan Ekspresi Protein Method pada Basic Culture”

Dr.dr. H Agung Putra, M.Si. Med.

Jum’at, 22 Oktober 2020

Seorang peneliti melakukan penelitian kultur sel invitro tentang “Exosome

Mesencymal Stem Cell” dalam menghambat proliferasi sel kanker. Analisis dilakukan
secara kualitatif dengan menilai ekspresi Cyclin D siklus sel dan secara kuantitatif
terhadap protein Ras kinase intraseluler.
Pertanyannya:

1. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan menilai ekspresi Cyclin D

a. Bagaimana teknik immunostaining untuk mengetahui Cyclin D yang terekspresi ?

Cyclin D merupakan protein starter untuk mulainya siklus sel. Cyclin D
merupakan protein inti yang berikatan dengan CDK4/CDK6 membentuk kompleks
cyclin D-CDK4/6, yang terlibat dalam proses fosforilasi protein retinoblastoma
(pRb) pada fase G1 dan S siklus sel dan berperan penting dalam membantu
perbaikan DNA sel.
Prosedur standar penilaian kualitatif cyclin D dapat menggunakan metode
pewarnaan Imunohistokimia (IHK) dengan menggunakan antibodi Cyclin D (Clone
SP4, Biocare, USA). Hasil pulasan imunohistokimia tersebut kemudian diperiksa
menggunakan mikroskop cahaya.

b. Hal apakah yang akan dinilai dan bagaimana penilaiannya ?

Skala penilaian intensitas imunoekspresi Cyclin D:
1. Skala 0-3 (0, tidak terwarna; 1+, terwarna lemah; 2+, terwarna sedang; 3+,
terwarna kuat), dan
2. Skala 0-4 (0, negatif; 1+, 80%).
Penilaian imunoekspresi Cyclin D ditentukan berdasar atas jumlah
perkalian intensitas dan distribusi dengan total histoskor lemah 0-4 dan kuat
dengan histoskor 6-12.

c. Sebutkan langkah preparasi sampel sebelum dilakukan analisis ekspresi Cyclin !

Sel kanker dikeluarkan dari freezer (-80 0C), dihangatkan dalam penangas
air pada suhu 37 0C selama 2 – 3 menit. Setelah mencair, sel dipindahkan ke dalam
conical tube yang telah berisi 10 ml media DMEM, diinkubasi selama 3 – 4 jam
pada suhu 37 0C/ 5% CO2, kemudian disentrifugasi untuk memisahkan sel kanker
(pelet) dengan media DMEM. Pelet yang terbentuk diamati dibawah mikroskop
untuk melihat apakah sel melekat di dasar culture dish dan bila jumlah sel di dalam
culture dish mencapai 70 – 85 % (konfluen), dilakukan panen sel.
2. Selain itu, juga terdapat teknik analisis kuantitatif yang melibatkan protein Ras
kinase.
a. Bagaimana teknik analisis kuantitatif terkait Ras kinase ?

Ras kinase merupakan salah satu jenis dari gen RAS, yang merupakan
protoonkogen. Immunoblot atau Western Blot (WB) merupakan salah satu metode
pemeriksaan kuantitatif yang dapat digunakan. WB berfungsi untuk
mengidentifikasi antibody spesifik pada suatu protein dengan berat molekul tertentu
yang telah diseparasi. Pada awalnya berat molekul protein diseparasi atau
dipisahkan berdasarkan struktur 3D dan panjang peptidanya. Separasi protein
dilakukan dengan menggunakan SDS-PAGE elektroforesis kemudian ditransfer ke
kertas nitrocellulose (NC) untuk kemudian dilacak dengan menggunakan antibody
yang spesifik kepada protein target. Dalam satu pita pada SDS-PAGE kemungkinan
terdapat berbagai macam protein dengan berat molekul yang berbeda yang dapat
berikatan dengan antibody. Deteksi ekspresi protein dilakukan dengan prinsip
imunologi menggunakan antibody primer dan sekunder, dengan menggunakan
fluoresensi. Reaksi antara antibody primer dan sekunder akan memberikan hasil
fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di
kamar gelap.
b. Hal apakah yang akan dinilai dan bagaimana penilaiannya ?
Berikut ini adalah contoh hasil pembacaan antibody di kertas NC.

Intepretasi hasil dari western blot mirip dengan SDS-PAGE elektroforesis.

Kita menggunakan persamaan regresi linier dari marker yang digunakan sebagai
standart. Pita sampel yang berwarna pada NC merupakan protein dengan berat
 molekul tertentu yang kita hitung dengan menggunakan persamaan regresi linier.

c. Sebutkan langkah preparasi sampel sebelum dilakukan analisis Ras Kinase ?

Pemeriksaan diawali dengan transfer protein dari gel ke matriks dengan
menggunakan Trans-blot semi dry Western blot seri 221 BR17045 (Bio Rad).
Membran yang digunakan adalah nitroselulosa ECL. Transfer protein dilakukan
pada tegangan 150 volt selama 30-45 menit. Proses transfer ini harus bebas dari
gelembung udara. Membrane dicuci dengan buffer TBS (Tris buffer Saline) selama
2x10 menit.

3. Dimana letak persamaaan dan perbedaan antara teknik analisis uji no 1 dan uji no 2 ?
Immunohistokimia (IHK) merupakan pemeriksaan yang menggunakan
antibodi untuk mendeteksi dan menganalisis ekspresi protein sambil
mempertahankan komposisi, karakteristik seluler, dan struktur jaringan asli. IHK
dapat sangat membantu dalam mendiagnosis kelainan pada penyakit seperti kanker
di mana sampel tumor tersedia dan data kontekstual diperlukan.
Western blot adalah tekhnik untuk mendeteksi suatu protein spesifik dalam
suatu sampel pada membrane nitrocellulose atau membrane transfer lain, seperti
juga pada tekhnik imunohistokimia dan ELISA (enzyme-link immunosorbent
assay) meskipun terdapat perbedaan mendasar dalam pelaksanaan dan analisisnya.
Dengan membandingkan kadar protein spesifik yang dicari dengan kadar
rekombinan protein target yang diketahui sebagai suatu standar pada western blot,
kadar absolut protein spesifik tersebut dapat dianalisis secara densitometri.
Sedangkan bila standar yang digunakan adalah gabungan dari semua protein
sampel, atau adalah suatu sampel protein house-keeping yang telah diketahui
kuantitasnya, maka nilai relatif kadar protein spesifik tersebut dapat dihitung.
WB sangat sensitif secara kuantitatif dan dapat mendeteksi jumlah protein
yang sangat kecil. Sebaliknya, manfaat IHC adalah dalam konteks jaringan yang
utuh. WB sering digunakan sebagai alat pelengkap untuk mengkonfirmasi
spesifisitas antibodi dan memberikan lebih banyak analisis kuantitatif kadar
protein. Namun, epitop yang dikenali oleh antibodi primer mungkin tidak tersedia
secara identik dalam tes WB dan IHC.