MAKALAH

STUDI LAPANGAN BIOPROSES

Isolasi Bakteri Lactococcus lactis pada Kefir

Disusun oleh:

Fitriyana Rahmi Wibowo (1741420040)

Khoridho Putra Firdana (1741420063)

Yuniar Eka Prastica (1741420053)

Politeknik Negeri Malang

Jl.Soekarno Hatta No.9 Malang 65141

Telp (0341)404424, 404425 Fax (0341)404420

www.polinema.ac.id
 KATA PENGANTAR

Puji syukur atas kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan kasih sayang
sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah yang berjudul “Isolasi Bakteri Lactococcus
casei pada Kefir ” tepat pada waktunya.

Tidak dapat dipungkiri bahwa dalam penyusunan makalah ini masih terdapat kesalahan

dan kekeliruan karena keterbatasan penulis sebagai manusia biasa, oleh karena itu saran dan kritik

yang bersifat membangun sangat diharapkan demi perbaikan di masa yang akan datang.

Kami menyadari sepenuhnya bahwa makalah ini barulah merupakan langkah awal yang

masih jauh dari tujuan semestinya yang ingin dicapai, atau dapat dikatakan bahwa kami menyusun

makalah ini masih dalam bentuk sederhana, mengingat luasnya permasalahan yang dibahas

dibandingkan dengan kemampuan yang kami miliki.

Berbagai kesulitan yang kami alami selama penyusunan makalah ini, namun semuanya itu

dapat kami atasi berkat bantuan dan dukungan dari beberapa pihak disertai doa kehadirat Tuhan

Yang Maha Kuasa.

Malang, 23 Januari 2018

Penulis
 DAFTAR ISI
Kata Pengantar …………………………………………..…..………… i

Daftar Isi …………………………………………………..…..………… ii

Bab I Pendahuluan

1.1 Latar Belakang…………………………….………………… 1

1.2 Rumusan Masalah………………………………….….…….. 2

1.3 Tujuan…………………………………….…………….…… 3

Bab II Tinjauan Pustaka

2.1 Bakteri ..................................................................................... 3

2.1.1 Bakteri Coccus (Bulat) ……………………...…… 3
2.1.2 Bakteri Basil (Batang) ……………………….…... 4
2.1.3 Bakteri Spiral (Lengkung) ……………………...... 4
2.2 Bakteri Asam Laktat ……………............................................ 5
2.2.1 Bakteri Lactococcus Bulgaricus ........................... 6
2.2.2 Bakteri Streptococcus thermophilus ...................... 7
2.3 Yoghurt .................................................................................... 9
2.4 Isolasi ……………………....................................................... 10
2.4.1 Metode Cawan Tuang ………………………...…. 11
2.4.2 Metode Cawan Gores ………………………..…... 12
2.5 Pewarnaan Gram ...................................................................... 12

Bab III Metodologi

3.1 Waktu dan Tempat ................................................................... 15

3.2 Alat dan Bahan ........................................................................ 16

3.3 Prosedur Kerja ……………………………………………..... 18

3.3.1 Pembuatan Media dari NA ………………………. 18
3.3.2 Sterilisasi Alat dan Bahan ……………………….. 19
3.3.3 Penanaman Mikroba Metode Cawan Tuang …….. 20
3.3.4 Perhitungan Hemasitometer ………………...……. 21
 3.3.5 Perhitungan Colony Counter ………………….…. 23
3.3.6 Penanaman Mikroba Metode Cawan Gores ……... 23
3.3.7 Pewarnaan Gram ……………………………...….. 24
3.3.8 Penanaman Mikroba Metode Agar Miring …….… 25

Bab IV Hasil dan Pembahasan

4.1 Hasil Pengamatan ……………………………………………. . 26

4.1.1 Hasil Isolasi Metode Cawan Tuang ………………..... 26

4.1.2 Hasil Pengamatan Mikroskop Metode Cawan Tuang.. 27

4.1.3 Hasil Isolasi Metode Cawan Gores …………………. 27

4.1.4 Hasil Pengamatan Mikroskop Metode Cawan Gores.. 29

4.1.5 Hasil Pewarnaan Bakteri ……………………………. 29

4.1.6 Hasil Mikroskopis Agar Miring …………………….. 30

4.2 Pembahasan …………………………………………………. 31

Daftar Pustaka............................................................................................. 40
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan
menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Prinsip dari isolasi
mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni yang tetap pada tempatnya.

Mengisolasi bakteri dapat dilakukan pada suatu bahan pangan yang berupa produk
fermentasi susu kambing etawa yang biasa kita sebut dengan kefir. Kefir merupakan kumpulan
dari bakteri dan khamir yang sangat banyak jumlah strainya. Di indonesia, kefir dikenal dengan
nama dagang kristal alga Jepang.

Kefir ini diproduksi di negara-negara di Rusia dan hanya sedikit diproduksi di negara-
negara Eropa. Kefir mengandung 0.5 – 1,0 % alkohol dan 0,9 – 1,1 % asam laktat. Produk ini
sangat populer di Uni Soviet, dimana konsumsi kefir mencapai 4,5 kg per kapita per tahun. Kefir
lebih encer dibandingkan yoghurt, namun gumpalan susunya lebih lembut dan mengandung gas
CO2 . Kefir susu dibuat dari susu sapi, susu kambing atau susu domba yang ditambahkan starter
kefir berupa granula kefir atau biji kefir, sedangkan kefir air dibuat dari campuran air, buah-buahan
kering seperti kismis, potongan kecil dari lemon, dan gula pasir.

Kefir memiliki sangat banyak kandungan mineral, vitamin, asam amino, pottasium,
sodium, klorida, vitamin A, B2, B6, C, D, E, karoten, thiamin, asam folat, niacin, dan lain-lain.
Selain itu, kefir juga mengandung beberapa bakteri menguntungkan, diantaranya Sterptococcus
thermophilus, Streptococcus lactis, Lactobacillus casei dan Lactobacillus acidophilus dan masih
banyak bakteri lainnya.

Selain itu manfaat Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei dan Lactobacillus

acidophilus tergolong dalam bakteri asam laktat (BAL) yang dapat digunakan untuk
memfermentasi air susu. BAL akan menurunkan kadar laktosa sebanyak 25-30%, sehingga susu
fermentasi aman dikonsumsi oleh orang lactose intolerant. Sedangkan Streptococcus lactis adalah
salah satu bakteri yang terlibat dalam pembuatan yoghurt, keju dan mentega. Bahkan bakteri inilah
yang membedakan yoghurt dengan produk olahan susu jenis lain. Bakteri ini akan bekerja sama
dengan bakteri Lactobacillus bulgaricus dalam memfermentasi susu segar untuk mengubahnya
menjadi yoghurt. Bakteri Lactobacillus bulgaricus akan berperan dalam pembentukan aroma
yoghurt, sedangkan Streptoccus lactis berperan dalam pembentukan rasa dari yoghurt.

Dari cara pemanfaatan bakteri-bakteri diatas, kali ini kami akan mencoba mengisolasi
bakteri Lactobacillus casei dalam kefir.

1.2 RUMUSAN MASALAH

1.2.1 Bagaimana cara mengisolasi bakteri Lactococcus lactis dengan

metode cawan tuang?
1.2.2 Bagaimana cara mengisolasi bakteri Lactococcus lactis dengan
metode cawan gores?
1.2.3 Bagaimana perhitungan jumlah bakteri Lactococcus lactis
menggunakan Colony Counter?
1.2.4 Bagaimana morfologi bakteri Lactococcus lactis hasil metode
cawan tuang dan cawan gores secara makroskopis?
1.2.5 Bagaimana morfologi bakteri Lactococcus lactis hasil metode
cawan tuang dan cawan gores secara mikroskopis?
1.2.6 Bagaimana cara penumbuhan kultur murni Lactococcus lactis pada
agar miring?
1.2.7 Bagaimana perhitungan jumlah bakteri Lactococcus lactis
menggunakan hemasitometer?
1.2.8 Bagaimana morfologi bakteri berdasarkan sifatnya terhadap
pewarnaan negatif, pewarnaan sederhana, dan pewarnaan gram?
1.3 TUJUAN

1.3.1 Untuk mengetahui cara mengisolasi bakteri Lactococcus lactis

dengan metode cawan tuang.

1.3.2 Untuk mengetahui cara mengisolasi bakteri Lactococcus lactis

dengan metode cawan gores.

1.3.3 Untuk mengetahui perhitungan jumlah bakteri Lactococcus lactis

menggunakan Colony Counter.

1.3.4 Untuk mengetahui morfologi bakteri Lactococcus lactis hasil

metode cawan tuang dan cawan gores secara makroskopis.

1.3.5 Untuk mengetahui morfologi bakteri Lactococcus lactis hasil

metode cawan tuang dan cawan gores secara mikroskopis.

1.3.6 Untuk mengetahui cara penumbuhan kultur murni Lactococcus lactis

pada agar miring.

1.3.7 Untuk mengetahui perhitungan jumlah bakteri Lactococcus lactis

menggunakan hemasitometer.

1.3.8 Untuk mengetahui morfologi bakteri berdasarkan sifatnya terhadap

pewarnaan negatif, pewarnaan sederhana, dan pewarnaan gram.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 ISOLASI

Isolasi mikroorganisme mengandung arti proses pengambilan mikroorganisme dari

lingkungannya untuk kemudian ditumbuhkan dalam suatu medium di laboratorium. Proses isolasi
ini menjadi penting dalam mempelajari identifikasi mikrobia, uji morfologi, fisiologi,
dan serologi. Sedangkan pengujian sifat-sifat tersebut di alam terbuka sangat mustahil untuk
dilakukan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba
lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada
tempatnya (Pelczar, 1986).
Prinsip kerja isolasi bakteri cukup sederhana yakni dengan menginokulasikan sejumlah
kecil bakteri pada suatu medium tertentu yang dapat menyusung kehidupan bakteria. Sejumlah
kecil bakteri ini didapat dari bermacam-macam tempat tergantung dari tujuan inokulasi. Dalam
kajian mikrobiologi yang berhubungan dengan sumber bakteri adalah mikrobia tanah, air,
makanan dan udara (Talaro, 1999).
Tujuan dari pemindahan biakan untuk menguasai teknik pemindahan biakan bakteri dari
satu wadah ke wadah lain secara aseptik, sehingga hanya biakan murni yang diharapkan yang
tumbuh. Hal ini sangat penting dalam tahap awal pekerjaan isolasi mikroba terutama yang berasal
dari stok kultur (bukan dari substrat). Kegagalan dalam hal pemindahan biakan dapat
menyebabkan kontaminasi dari pertumbuhan mikroba yang tidak diharapkan (Dwidjoseputro,
1990).

Beberapa cara atau metode yang dikenal untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan
campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode
cawan tuang. Metode tersebut didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk
memperoleh spesies individu, dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis
sel yang dapat diamati (Dwidjoseputro, 1990).
 1. Teknik Piringan Goresan (Streak plate method)
Medium agar dicairkan, didinginkan pada suhu 450C, dituang ke dalam cawan petri steril
(cawan gelas dengan garis tengah sekitar tiga inci) dan dibiarkan sampai menjadi padat. Kemudian
menginokulasi biakan dilakukan dengan jarum ose pada permukaan atas agar yang penuh dengan
biakan campuran (misalnya specimen ludah atau bahan lain). Ada beberapa metode penggoresan
yang berbeda, namun kesemua metode bertujuan untuk meletakkan sebagian besar organisme pada
beberapa goresan pertama. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakkan jarum ose bergantian
dari satu bagian ke bagian lain cawan petri, bakteri yang tertinggal pada jarum ose semakin
berkurang. Jika dilakukan secara sempurna, goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual
cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami pertumbuhan, koloni yang berasal dari
bakteri individual akan benar-benar terpisah satu sama lain. Kemudian koloni tunggal dapat
ditinggalkan kemedium steril, dan akan tumbuhlah biakan murni (Hadioetomo, 1993).

Gambar 2.1 Metode Streak Plate (Colome, 2001).

Ada beberapa teknik goresan yang biasa dipakai yaitu:

a. Goresan Sinambung
Prosedur kerjanya adalah inokulum loop (ose) disentuhkan pada koloni bakteri dan
gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Lalu petridish diputar 180odan
dilanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk
mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
 b. Goresan T
Prosedur kerjanya adalah petridish dibagi menjadi 3 bagian menggunakan spidol dan
daerah tersebut diinokulasi dengan streak zig-zag. Ose dipanaskan dan didinginkan, lalu distreak
zig-zag pada daerah berikutnya.

c. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi
empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisma. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

2. Metode Tuang (pour-plate method)

Terdiri atas penginokulasian biakan campuran kedalam tabung uji yang mengandung agar
cair yang telah didinginkan pada suhu 450 C isinya diaduk untuk memencarkan bakteri keseluruh
medium. Campuran itu kemudian ditungkan kedalam cawan petri steril dan dibiarkan padat
pertumbuhan koloni terjadi baik dalam medium tujuan pada kedua proses ialah untuk memisahkan
bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu akan tumbuh menjadi koloni-koloni yang terpisah
didalam medium yang padat. Kemudian dapat diambil sel-sel dari satu koloni untuk mendapatkan
biakan murni. Piringan kedua dalam praktek sering digores kembali dengan organisme yang
berasal dari koloni yang diidolasi untuk menjamin bahwa hasil yang diperoleh adalah biakan
murni (Hadioetomo, 1993).
 Gambar 2.2 Metode Pour Plate

3. Teknik Pengenceran (dilution method)

Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies
diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Hasil pengenceran ini kemudian diambil kira-kira
1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk
disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni
yang akan tumbuh dalam medium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh
satu koloni saja. Hal yang demikian ini dapat kita jadikan biakan murni. Jika kita belum yakin,
bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat
mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Trianda, 2011).
 Gambar 2.3 Metode Dilusi

2.2 PERHITUNGAN MIKROORGANISME

Pengukuran kuantitatif populasi mikroba seringkali amat diperlukan di dalam berbagai

macam pelaahan mikrobiologi. Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel, antar lain
dengan hitungan cawan (plate count), hitungan mikroskopis langsung (direct microscopic count)
yang menggunakan mikroskop serta ruang hitung (haemositometer) atau secara elektonis dengan
bantuan alat yang disebut penghitung coulter (coulter counter) (Hutagaol, 2011).
Haemocytometer ialah perangkat atau alat yang berfungsi untuk menghitung jumlah sel
serta partikel mikroskopis lainnya. Haemocytometer memiliki kelemahan dan kelebihan dan
penggunaannya, saat proses perhitungan bakteri secara langsung. Kelebihannya antara lain ialah
lebih cepat dalam menghasilkan data dan tidak perlu menunggu lama, serta datanya atau jumlah
sel mikroba langsung di peroleh saat itu juga setelah menghitung menggunakan rumusnya dan
menghemat biaya. Sedangkan kelemahannya ialah tidak dapat membedakan sel yang hidup dan
mati karena perhitungan secara keseluruhan dan data yang dihasilkan tidak akurat (Waluyo, 2009).
Colony counter adalah alat yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni bakteri atau
mikroorganisme. Bakteri yang dihitung disini adalah dengan melakukan pengenceran dari medium
bakteri misalnya sampai tiga kali dalam tabung reaksi, kemudian ditanam dan diinkubasi
dalam incubator (Sanfa, 2011)
2.3 PEWARNAAN

2.3.1 Pewarnaan Negatif

2.3.2 Pewarnaan Sederhana

2.3.3 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri
gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi
oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
 Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria,
2009).

2.4 KEFIR

Kefir merupakan produk susu fermentasi dapat dibuat dari bahan baku susu sapi. Kefir
diperoleh melalui proses fermentasi susu pasteurisasi menggunakan starter berupa butir atau biji
kefir (kefir grain/kefir granule), yaitu butiran-butiran putih atau cream dari kumpulan bakteri
antara lain streptococcus sp., lactobacilli, dan beberapa jenis ragi khamir non patogen. Bakteri
berperan menghasilkan asam laktat dan komponen flavor, sedangkan ragi menghasilkan gas asam,
arang, atau karbon dioksida, dan sedikit alkohol. (Usmiati, 2007)

Mikroorganisme yang ada dalam starter kefir menghasilkan asam dan alkohol oleh bakteri
asam laktat dan khamir yang hidup bersimbiosis dan tumbuh dalam granula kefir. Bakteri asam
laktat yang berbentuk batang akan menempati lapisan perifer (luar) biji, sedangkan ragi ada di
dalam intinya. Granula kefir berbentuk seperti kembang kol berwarna putih atau kekuningan,
diameter granula antara 2-15 mm dengan berat beberapa gram.

Kefir memiliki kadar asam laktat 0,8-1%, alkohol 0,5-2,5%, CO2, kelompok vitamin B, dan
rasio diasetil-asetal dehid 3,1. Komposisi dan kadar nutrisi kefir adalah air 89,5%, lemak 1,5%,
protein 3,5%, abu 0,6%, laktosa 4,5%, dan pH 4,6. Komponen dan komposisi kimia kefir
bervariasi, bergantung pada jenis mikrobia starter, suhu, lama fermentasi, serta bahan baku yang
digunakan.

Butir kefir mengandung:

1. Streptococcus lactis, yang menghasilkan asam laktat, membantu pencernaan,

menghambat mikroorganisme berbahaya, dan menghasilkan bakteriolisis.

2. Lactobacillus plantaturum, yang membuat asam laktat, perkelahian melawan Listria

monoctegenes dan membuat plantaricin yang menghambat mikroorganisme yang
menyebabkan pembusukan.

3. Streptococcus cremoris, yang memiliki sifat yang mirip S. lactis.

 4. Lactobacillus casei, yang menghasilkan sejumlah besar L (+)asam laktat, berkolonisasi
dengan baik di saluran pencernaan, menciptakan medium yang menguntungkan bagi
bakteri lain untuk tumbuh, menghambat pembusukan, meningkatkan fungsi kekebalan
tubuh, dan menghambat bakteri patogen dan membantu melindungi terhadap infeksi
bakteri.

5. Streptococcus diacetylacti, menghasilkan CO2 dalam kefir, membuat diasetil, yang

memberi aroma khas kefir, dan memiliki sifat umum dengan S. lactis.

Manfaat yang diperoleh bagi siapa saja yang mengonsumsi kefir adalah meningkatkan sistem
pertahanan tubuh karena kandungan antimikrobia yang terdapat di dalamnya. Antimikrobia yang
dapat dijumpai pada kefir adalah asam laktat, asam asetat, asam format, hidrogen peroksida,
diasetil, asetal dehid, karbon dioksida, alkohol, dan bakteriosin. (Maheswari dan Setiawan, 2009)

2.5 Lactococcus lactis

Lactococcus lactis merupakan bakteri gram positif, bersifat mesofilik dan fakultatif

anaerob. Bakteri ini tidak membentuk spora, tidak motil, selnya berbentuk bulat atau ovoid

dengan ukuran 0.5 – 1.5 µm serta susunan selnya berpasangan atau berantai. Lactococcus lactis

melakukan metabolisme karbohidrat secara homofermentatif dan menghasilkan L(+)-asam

laktat dari glukosa.

Lactococcus lactis mempunyai dua subspesies yang sangat berperan dalam fermentasi susu

diantaranya L. Lactis subsp. lactis dan cremoris. Subspesies L. lactis mempunyai perbedaan

pada karakteristik phenotypic. L. lactis subsp. lactis tumbuh pada suhu 40 °C dan 4% NaCl

serta menghasilkan amonia dari arginin sedangkan L. lactis subsp. cremoris tidak dapat

tumbuh pada suhu 40 °C dan 4% NaCl serta tidak menghasilkan amonia dari arginin.

Lactococcus lactis telah banyak digunakan secara luas sebagai kultur starter pada

fermentasi susu di seluruh dunia. Strain L. Lactis digunakan untuk menghasilkan produk
 makanan seperti keju, kefir, sour cream dan buttermilk. L. Lactis tidak hanya berperan dalam

memberikan karakteristik rasa, aroma dan tekstur dari produk tetapi juga membantu

pengawetan produk dengan menghasilkan asam organik, bakteriosin dan hidrogen peroksida.

Klasifikasi Lactococcus lactis :

Kingdom : Monera

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Lactobacialles

Family : Streptococcaceae

Genus : Lactococcus

Species : Lactococcus lactis

2.6 MEDIA PERTUMBUHAN Lactococcus lactis

Lactococcus lactis dapat ditumbuhkan pada media NA (Nutrient Agar), karena media NA
(Nutrient Agar) merupakan media yang umum digunakan untuk menumbuhkan macam-macam
bakteri termasuk bakteri Lactococcus lactis.
 BAB III

METODOLOGI

3.1 WAKTU DAN TEMPAT

Praktikum Bioproses studi lapangan isolasi Lactococcus lactis dilaksanakan pada hari
Selasa tanggal 2, 9, dan 16 Januari 2017 di Laboratorium Bioproses Politeknik Negeri Malang.

3.2 ALAT DAN BAHAN

No Alat Jumlah
1 Cawan Petri 8 buah
2 Kertas Pembungkus Cawan Petri 8 buah
3 Tabung Reaksi 11 buah
4 Mikropipet 1 buah
5 Klip Mikropipet Secukupnya
6 Autoclave 1 buah
7 Tutup Tabung Reaksi 11 buah
8 Jarum Ose 3 buah
9 Kaca Preparat 3 buah
10 Cover glass 3 buah
11 Penjepit Kayu 1 buah
12 Hot Plate 1 buah
13 Pembakar Bunsen 1 buah
14 Mikroskop 1 buah
15 Spidol 1 buah
16 Label 9 buah
17 Vortex Mixer 1 buah
18 Incubator oven 1 buah
19 Oven 1 buah
 20 Kulkas 1 buah
21 Kaca Arloji 1 buah
22 Neraca Analitik 1 buah
23 Spatula 1 buah
24 Botol Aquades 1 buah
25 Pipet Ukur 25 ml 1 buah
26 Bulb Pipet 1 buah

No Bahan Jumlah
1 Aquades Seperlunya
2 Etanol 70% Seperlunya
3 Nutrient Agar 4 Gram
4 Kefir 55 cc

3.3 CARA KERJA

3.3.1 Persiapan dan Sterilisasi Alat Bahan

1. Cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang telah
ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil
destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan yang akan disterilisasi kedalam autoklaf.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf.

4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 30 menit pada suhu 121 °C.
5. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan
terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian kran pengaman ditutup
(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 30 menit tekanan
mencapai 2 atm.
 6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan turun hingga sama dengan
tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol).
Kemudian kran pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

3.3.2 Pembuatan Nutrient Agar

1. Timbang Nutrient Agar (NA) sebanyak 4 gram.
2. Masukkan kedalam Erlenmeyer.
3. Tambahkan aquadest hingga 200 ml.
4. Larutkan pada hotplate.
5. Setelah agar larut, medium disteril pada autoklaf pada tekanan 1,5 atm dan suhu
121˚C selama kurang lebih 15 menit.
6. Setelah sterilisasi, medium dapat dituang secara aseptis pada cawan petri untuk
penggunaan.(suhu ± 40˚C/suam suam kuku).
7. Untuk membuat medium miring, NA yang telah dipanaskan langsung dituang pada
tabung reaksi sebanyak ±5ml dan disumbat dengan kapas berbalut kasa sebelum
disterilkan.

3.3.3 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Tuang

1. Tuliskan kode kelompok dan tanggal pada permukaan luar dasar cawan petri. Beri
nomer dibagia atasnya.
2. Ambil 7 tabung reaksi berisi air steril masing –masing 9 ml, letakkan di rak tabung
reaksi dan beri penomoran.
3. Kocok tabung reaksi berisi suspensi campuran bakteri (disediakan) dengan gerakan
kesamping, jangan sampai sumbatnya basah.
4. Ambil 1 ml campuran biakan secara aseptis dengan pipit mikro, pindahkan ke tabung
reaksi 1, kocok.
5. Ambil 1 ml dari tabung reaksi 1 campuran biakan secara aseptis dan pindahkan ke
tabung reksi 2, kocok. Lakukan hal yang sama sampai kelima tabung reaksi berisi
bakteri.
6. Dari masing-masing tabung, pindahkan 1ml campuran biakan secara aseptis ke 7
petridish steril (beri penomoran dan keterangan pengenceran pada petridish sesuai
dengan asal biakan tabung)
7. Tambahkan agar cair bersuhu kurang lebih 40oC secukupya kedalam petridish secara
aseptik. Dengan posisi cawan petri di meja kerja, putar-putarkan cawan petri searah
jarum jam sebanyak 5 kali kemudian berlawanan arah jarum jam juga sebanyak 5
kali. Selanjutnya putarkan cawan petri hingga membentuk angka delapan sebanyak 5
 kali. Kemudian biarkan beku. Bungkus dengan kertas pembungkus dan inkubasi
selama 2 x 24 jam dalam incubator oven dalam keadaan terbalik (tutup cawan di
bawah) pada suhu yang sesuai.
8. Amati diameter (mm), warna, ketinggian koloni, tepian, bentuk, konsistensi, serta
bau.

3.3.4 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Gores

1. Siapkan cawan petri kering dan steril
2. Nyalakan pembakar spirtus, bekerjalah pada spirtus pada radius 30 cm maksimal
dari api.
3. Panaskan bibir cawan beberapa kali di api pembakar spirtus.
4. Letakkan di meja dan buka tutup cawan petri. Jangan terlalu lebar, cukup untuk
menuangkan media agar cair bersuhu kurang lebih 60oC kedalamnya.
5. Isikan kurang lebih ½ bagian dari kedalaman cawan petri.
6. Biarkan cawan terbuka sedikit untuk mendinginkan media agar dan uap panas
tidak mengembun ditutup cawan. Patikan bekerja di radius 30 cm dari nyala api
spirtus.
7. Bila sudah beku, berarti cawan sudah siap di gores.
8. Tuliskan kode kelompok dan tanggal pada permukaan luar dasar cawan petri. Beri
nomor di bagian atasnya.
9. Balikah cawan petri dan buatlah sketsa area penggoresan dengan spidol.

Dengan berpedoman gambar di atas lakukan langkah-lagkah berikut:

10. Letakkan cawan petri diatas meja dengan posisi tutup terletak di sisi atas dan
sector 0 disisi kiri.
11. Kocoklah tabung reaksi berisi campuran suspensi mikroba dengan gerakkan ke
samping. Jaga agar sumbat kapas tidak basah. Atau gunakan biakan yang sudah
anda dapat dariisolasi dengan metode cawan tuang. Pilih koloni yang bukan
 kontaminan, konsultasikan dengan dosen pembimbing.panaskan bibir cawan petri
dengan pembakar spirtus kurang lebih 3 putaran.
12. Denga lup inokulasi, pindahkan secara aseptik satu lup penuh biakan mikroba pada
sektor 0 dan goreskan membentuk pola zig-zag. Perhatikan agar tutup cawan petri
tidak terbuk terlalu lebar. Karena permukaan agar dapat terlukai oleh lup, maka
goresan yang dilakukan tanpa tekana berlebih. Lingkaran di ujung lup harus
terletak datar dan horizontal terhadap permukaan agar. Bila biakan campuran
tersedia dalam bentuk padat, jaga agar inokulum yang dipindahkan tidak teralu
banyak, cukup sentuhkan lup pada biakan yang akan digoreskan.
13. Pijarkan kembali lup dan biarkan dingin. Suhu kup dapat diperksa dengan
menyentuhkannya ke pinggiran media agar dan bila mendesis berarti masih panas.
Pemijaran lup yang kedua kali ini akan mematikansel-sel yang masih tersisa
sehingga membantu pengenceran jumah sel.
14. Goreskan lup ke sektor 0 satu sampai tiga kali saja dan lanjutkan dengan goresan
ke arah tepi luar sektor 1. Lanjutkan dengan goresan zig-zag pada sektor 1 dan
tidak tumpang tindih.
15. Putar cawan petri hingga sektor 1 terletak di sisi kiri anda, ulangi langkah tersebut
untuk mengencekan biakan dari sektor 1 ke sektor 2.
16. Putar cawan petri hingga sektor 2 terletak disisi kiri anda, ulangi untuk
mengencerkan biakan dari sektor 2 ke sektor 3.
17. Pijarkan lup setiap kali berpindah sektor.
18. Panaskan sekali lagi bibir cawan petri dengan pembakar spirtus kemudian bungkus
dengan rapi.
19. Inkubasikan cawan petri terbalik dalam inkubator oven pada suhu yang sesuai
selama 2 x 24 jam.
20. Amati diameter (mm), warna, ketinngian koloni, tepian, bentuk, konsistensi serta
bau.

3.3.5 Hemasitometer
1. Bersihkan permukaan hemasitometer dengan tissue dan setetes etnol 70%. Jangan
digosok terlalu kuat kerena kaca hemasitometer mudah tergores.. bersihkan kaca
penutup sampai bersih.
2. Letakkan kaca penutup hemasitometer di atas permukaan hitung hemasitometer.
3. Kocoklah suspensi biakan mikroba yang akan dihitung agar rata jangan sampai
sumbatan basah. Kemudian gunakan mikro pipet untuk mengambil suspensi.
4. Dengan cerat tarulah ujung pipet pada lekukan berbrntuk huruf V pada tepi tutup
kaca hemasitometer dan biarkan ruang hitung terpenuhi suspensi secara kapiler.
Gunakan telunjuk anda untuk mengatur laju aliran suspensi agar bagian bawah
kaca tutup tidak terisi oleh cairan berlebih. Usahakan agar tidak ada cairan yang
masuk di antara kaca tutup dan penyangga kaca tutup.
5. Letakkan hemasitometer di atas pentas mikroskop dengan hati-hati. Amatilah
dengan lensa obyektif berkekuatan rendah (40 x) dan hitngalh jumlah sel yang
 terdapat pada 80 buah kotak kecil yang terletak di dalam kotak bagian tegah yang
berukuran 1mm2 .
6. Pembagian ruang hitung hemasitometer. Seluruhnya ada 9 area, masing-masing
berukuran 1mm2 . Kotak yang di tengah, yang kesemua sisinya dibatasi garis ganda
juga berukuran sama, dibagi menjadi 25 kotak besar. Setiap kotak besar ini dibagi
lagi menjadi 16 kotak kecil. Sehingga di dalam kotak tenga tersebut seuruhnya
terdapat 25 x 16 kotak atau 400 kotak kecil yang merupakan ruag hitung.
7. Tempat yang merupakan tempat sampling hitungan adalah 4 kotak besar di ujung
dan 1 kotak besar di tengah. Tiap kotak ini terdiri atas 16 kotak kecil, hingga
totalnya adalah 80 kotak kecil.
8. Bila di temukan sel mikroba di garis batas, maka yang boleh di hitung hanyalah
yang terletak di sudut kiri atas kotak.

3.3.6 Pewarnaan Negatif

1. Bersihkan kaca objek dengan sabun, bilas lalu seka, dengan alkohol sehingga bebas
lemak, kemudian panggang diatas api pembakar spiritus.
2. Setelah dingin ambil suspensi biakan murni bakteri atau hasil isolasi anda dengan
lup inokulasi secara aseptis, dan letakkan diatas gelas preparat.
3. Kemudian ambil nigrosine dengan lup inokulasi dan campurkan dengan suspensi
bakteri yang telah diletakkan diatas gelas objektif. Ratakan suspensi ini sehingga
mambentuk apisan yang tipis.
4. Selanjutnya preparat dikeringanginkan, jaga kesterilan area kerja anda.
5. Amatilah dengan mikroskop menggunakan pembesaran kuat (100X).

3.3.7 Pewarnaan sederhana

A. Pembuatan Preparat
1. Bersihkan dan cuci gelas benda dengan baik sehingga bebas lemak dan kotoran.
2. Dengan kaca objek di tangan kiri basahi telunjuk dan jari tengah tangan kanan anda.
3. Gosokkan kedua jari yang basah itu pada sabun pembersih.
4. Gosok kedua permukaan gelas benda dengan kedua jari yang basah tadi.
5. Bilas gelas benda dengan air hingga bersih dan tidak ada lagi sisa sabun.
6. Bila gelas benda yang akan dipakai bekas diwarnai maka ulangi langkah 1 hingga
5 hingga bersih betul.
7. Bilas gelas benda dengan alkohol, tiriskan dan biarkan kering.
 8. Setelah bersih pegang gelas benda hanya di bagian pinggirnya.
9. Buat gambar lingkaran di tengah gelas benda dengan pinsil kaca berdiameter ±2cm
a. Mikroba dalam media padat
1. Letakkan sejumlah air steril di permukaan gelas benda, sisihkan.
2. Pegang biakan mikroba di tangan kiri dan lup inokulasi di tangan kanan.
3. Pijarkan lup inokulasi hingga memerah, panaskan bibir tabung reaksi atau cawan
petri dalam beberapa putaran di api.
4. Buka tutup tabung reaksi atau cawan petri, ambil sejumlah biakan dengan lup steril.
5. Campurkan biakan dengan air steril di permukaan gelas benda hingga rata.
6. Biarkan olesan kering udara, lalu fiksasi dengan api pembakar spiritus hingga terasa
agak panas bila ditempelkan di punggung tangan. Proses ini disebut fiksasi panas
dan dimaksud untuk mematikan organisme dan membuatnya menempel pada kaca
objek.
b.Mikroba dari media cair
1. Kocok terlebih dahulu tabung reaksi dengan cara memutar-mutar tabung diantara
dua sisi tangan yang berisi biakan, jangan sampai sumbatnya basah.
2. Pegang biakan mikroba di tangan kiri dan lup inokulasi di tangan kanan.
3. Pijarkan lup inokulasi hingga memerah, panaskan bibir tabung reaksi dalam
beberapa putaran di api.
4. Buka tutup tabung reaksi, ambil sejumlah biakan dengan lup steril.
5. Oleskan biakan di permukaan gelas benda hingga rata.
6. Biarkan olesan kering di udara, karena berupa cairan maka membutuhkan waktu
sekitar 30 menit.
7. Lalu fiksasi dengan api pembakar spiritus hingga terasa agak panas bila
ditempelkan di punggung tangan. Proses ini disebut fiksasi panas dan dimaksud
untuk mematikan organisme dan membuatnya menempel pada kaca objek.

3.3.8 Pewarnaan Gram

1. Ambillah sebuah gelas benda, bersihkan dengan tissue.
2. Supaya debunya hilang, kenudian panaskan kira-kira 10-20 kali diatas nyala api
sehingga lemaknya hilang.
3. Letakkan kaca obyek, dengan sisinya yang tidak berlemak pada bagian atas rak
tabung reaksi dan biarkan sampai dingin.
4. Kemudian, tarulah setetes air diatasnya (tetesan ini harus menyebar sama rata).
Jika tidak menyebar berarti lemaknya masih belum hilang dan pekerjaannya harus
diulang.
5. Bakar lup inokulasi hingga pijar. Dengan jarum ini, ambil sedikit bakteri dari
biakanya dan letakkan dipinggir tetesan tersebut.
6. Kemudian campurkan bakteri dalam tetesan air dengan menggosokkan lup
inokulasi dalam suspensi tersebut hingga terdapat suatu lingkaran dengan garis
tegah kira-kira 1 cm.
7. Jumlah bakteri yang ditunjukkan jumlah bakteri yang tepat keruh.
8. Pijarkan jarum yang telah dipakai. Keringkan suspensi bakteri tersebut, sebaiknya
jangan dipanaskan. Tetapi jangan mempercepat keringnya suspensi
tersebut,preparat boleh dipanaskan dengan hati-hati dengan menggoyangkan
selama 30 menit di atas nyala api kecil.
9. Buatlah dua garis tebal dikanan dan kiri preparat dengan sebuat potlot kaca. Hal
ini berguna untuk menahan aliran larutan zat warna keluar dan sebagaipenandaan.
10. Fikser-kan preparat tersebut dengan menggerakan kaca obyek, dengan bagian atas
yang ada preparatnya. Hal ini dilakukan beberapa kali melalui api pembakar
spirtus.
11. Warnailah dengan karbon kristal violet, diamkan selama 20 detik .
12. Cuci dengan air.
13. Teteskan larutan lugol (iodium) pada preparat dan deiamkan selama 1 menit
14. Cuci dengan alkohol 95% selama 10-20 detik dengan menggoyangkan preparat di
dalam gelas kimia yang berisi alkohol.
15. Bilas degan air sebentar saja.
16. Terulah preparat dengan tegak lurus diatas kertas serap/tissue, sehingga sebagai
besar airnya diserap.
17. Warnailah dengan larutan safranine selama 20 detik.
18. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas serap/tissue.
19. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat tanpa gelas penutup.
20. Catat jenis mikroba yang diamati,dan bedakan antara gram positif dan negatif.
3.4 SKEMA KERJA
3.4.1 Pembuatan Media
200mL 4 gram
aquadest Nutrient Agar

Pembuatan larutan

Pemanasan media

Pemindahan media ke dalam

erlenmeyer

Sterilisasi media
3.4.2 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Tuang

9mL air steril

Mengambil 6 Tabung Reaksi

Mengocok Suspensi

Pengenceran
Agar Cair
bersuhu 40oC

Menuang kedalam Petridish

Memutar Cawan Petri membentuk

angka 8

Membiarkan Agar memadat

Membungkus Agar

Menginkubasi Media selama 2x24

jam

Mengamati Koloni
4.3.3 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Gores

Penuangan media ke cawan petri

Membiarkan media memadat

Menggambar sektor di balik cawan petri

Inokulasi

Inkubasi

4.3.4 Penyimpanan Kultur Murni di Agar Miring

Memanaskan bibir cawan petri

Mengambil satu lup biakan murni

Menggoreskan dalam tabung reaksi pola zig

- zag

Menginkubasi selama 2x24 jam

4.3.5 Perhitungan Mikroorganisme

Membersihkan hemasitometer

Mengocok suspensi

suspensi 0,1mL
Meletakkan cover glass

Mengamati dengan mikroskop

4.3.6 Pewarnaan Negatif

Nigrosin
Biakan murni
Membersihkan kaca obyek

Mengeringkan preparat

Mengamati dengan mikroskop

4.3.6 Pewarnaan Sederhana

Membersihkan kaca obyek

Meletakkan air steril pada gelas benda

Meletakkan suspensi padat

Mengeringkan suspensi

biru metilen/karbol fuchsin

Suspensi kering

Mengeringkan suspensi

Mengamati dengan mikroskop

4.3.7 Pewarnaan Gram

aquadest steril 9mL air steril

Preparat steril
crystal violet

Fiksasi 20 detik
iodium

Bilas dengan air 1 menit

10-20 detik
Bilas dengan alkohol
safranin

Menegakkan preparat 20 detik

Bilas dengan air

Mengeringkan preparat

Mengamati di mikroskop