10/16/2013

Materi Kuliah
Protoplasma
Bioteknologi Pertanian
• Sel tanpa dinding sel
• Dapat digunakan sebagai eksplan
TEKNIK FUSI SEL: • Digunakan untuk rekayasa genetika
– Paling sering untuk ekspresi transien
Isolasi Protoplasma – transformasi konifer
Fusi protoplasma • Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik

Fusi Protoplas:
Mengapa menggunakan ini?
• Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan
• Mengatasi tanaman yang incompatibilitas
• Dimungkinkan untuk persilangan secara luas
• Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan
kualitas
• Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin
memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini
• Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .

1
 10/16/2013

Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual :

Terminologi dalam teknik fusi sel
Hibrida Somatik Hibrida Seksual
• Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg
berbeda jenisnya 1.Mempunyai organel dr Berisi organel yang
kedua sel tetua yang berasal dari tetua betina
• Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel bersatu dalam satu sel
protoplasma 2.Hasil fusi terdapat Genom ½ berasal dr tetua
genom inti dari kedua sel betina dan ½ dari tetua
• Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih tetua jantan
3. Menghasilkan tan ploidi Ploidi sama dengan
2 X lipat tetuanya

Hibridisasi somatik

2
 10/16/2013

Produksi Hibrida Melalui Fusi

Protoplas
Empat tahap untuk produksi hibrida:
• Isolasi Protoplas
• FusiProtoplas
• Seleksi Hibrida
• Regenerasi tanaman

Tahapan Fusi Protoplas

1. Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi
protoplas
2. Mencari prosedur yang tepat untuk
mendapatkan hasil fusi yang mempunyai
persentase tinggi dalam menghasilkan
heterokarion binukleat
3. Seleksi heterokarion setelah fusi
Persyaratan fusi :
 Carlson et al. (1972), Power et al. (1975) – persyaratan
tumbuh diferensial hibrida untuk menghilangkan
protoplas 2 (dua) dua donor spesies
 Ahli lain – menggunakan senyawa kimia untuk
menyeleksi protoplas hibrida atau menghilangkan
protoplas tetua

4. Kultur heterokarion dengan persentase Metode seleksi :

pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi
5. Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi secara visual (defisiensi klorofil)
genetik dari tanaman yang dihasilkan

3

Metode Fusi Protoplas :
1. Pemilihan protoplas tetua
2. Induksi fusi secara kimia
3. Fusi secara elektrik
4. Praktek elektrofusi
5. Mikrofusi
Isolasi Protoplas secara enzimatik
• Daun: lapisan epidermis dibuang
• Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum)
– Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan
– Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500-
600 mM/L
• Tambahkan enzim
– Selulase, hemiselulase, pektinase
– Terjadi degradasi dinding sel
• Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi
• Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel
10/16/2013
1. Protoplas Tetua
• Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas kultur in vitro atau
kultur suspensi sel umur 3-5 hari
• Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai kapasitas
regenerasi lebih baik
• Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi dari pektinase
(untuk pemisahan sel) dan selulase (penghancuran
dinding sel)
• Pemilihan enzim dan lamanya penghancuran dinding sel
mempengaruhi viabilitas protoplas dan fusogenik
Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma
•20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya
•Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish
• Inkubasikan 28o C 6 jam, saring dg saringan 50-100 μm
•Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg
menambahkan 5ml washing medium melalui filter
•Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit
•Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float
medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit
•Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi
•Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan
protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml
•Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab
•Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah
7-10 hari
4
 10/16/2013

Media kultur protoplasma Hasil isolasi protoplasma

• Umumnya menggunakan media MS atau B5
dan modifikasinya
• Diberi larutan osmotikum: manitol atau
sorbitol 500-600 mM/L Protoplas
ma dalam
• Penambahan 1 mM/L CaCl2 meningkatkan larutan

pembelahan sel
• ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi
• Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA
• Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P Daun plantlet kentang sbg
sumber protoplasma

2. Induksi Fusi secara Kimiawi FUSI PROTOPLAS:

• Membran protoplas bermuatan negatif dan
protoplas menjadi saling tolak menolak 
berdekatan  mengubah pH medium dg
polikation atau efek dehidrasi
• PEG – menyebabkan aglutinasi
(penggumpalan), tergantung suhu medium,
BM PEG, konsentrasi dan lama perlakuan PEG
• Galur sel mempengaruhi optimasi fusi.
• Tidak terjadi secara spontan
• Selain bisa diinduksi dengan menambah
promotor fusi berupa senyawa kimia PEG, juga
bisa diinduksi secara elektrik atau diberi virus
• Tiga kemungkinan produk hasil fusi:
– Sel A=Sel A
– Sel B=Sel B
– Sel A=Sel B

Protoplas dg vakuola kecil lebih mudah fusi • Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion)
dibandingkan dg bervakuola besar

5
 10/16/2013

Sel A

Tambahkan Enzim

Sel B

PROTOPLASMA HASIL FUSI

Tambah Promotor Fusi DILIHAT DI BAWAH PROTOPLASMA
MIKROSKOP

6
 10/16/2013

Seleksi dan kultur heterokarion Regenerasi Protoplasma

1. Penanda yang dapat dilihat menjadi plantlet
Misal : •Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media
fluorochrome – klorofil berwarna merah (mesofil) kultur

fluorescein diaceate – kloroplas hijau kekuningan
(kloroplas)
2. Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih
sel yang diaktifkan dengan fluoresen)
3. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai
sumber nitrogen  planlet yang tumbuh sebagai
hibrid
• Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah
meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri
• Tekanan osmose media perlahan-lahan diubah dg cara
meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol
• Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan
osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel

4. Kultur heterokarion  sangat tergantung materi

yang difusikan

• Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom

• Menghasilkan tanaman bebas patogen
KULTUR
PROTOPLASMA
Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik
UNTUK MERAKIT
TANAMAN
HIBRIDA Wortel X Aegopdium Kedelai X Alfalfa
Wortel X Barlei Kedelai X Barlei
Wortel X Petunia Kedelai X Jagung
Wortel X Tembakau Kedelai X Meadow Saffron
Jagung X Oat Kedelai X Pea
Regenerasi Jagung X Sorghum Kedelai X Tembakau
protoplasma menjadi Petunia X Fava Bean Kedelai X Rape
plantlet bersifat Petunia X Parthenocissus Tomat X Kentang
hibrida

7
 10/16/2013

Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik

LATIHAN
Dacus carota X D. capillifplius
• Jelaskan pengertian hibridisasi somatik, fusi protoplas, variasi
Datura innoxia X D. discolor somaklonal, kultur heterokarion!
Datura innoxia X D. stramonium • Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh aplikasinya!
• Sebutkan beberapa cara dalam seleksi heterokarion!
Nicotiana glauca X N. langsdorffii • Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi pada
hibridisasi somatik!
Nicotiana sylvertris X N. knightiana • Mengapa dalam kultur anther diperlukan konfirmasi jumlah
kromosom?
Nicotiana tabacum X N. debneyi
• Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual, hibridisasi
Nicotiana tabacum X N. sylvestris somatik, dan tanaman sibrid! Lengkapi dengan gambar!

Petunia hybrida X P. parodii