Modul Praktikum PR Spektrofotometri 2019

MODUL PRAKTIKUM
TEKNIK ANALISIS
SPEKTROFOTOMETRI
TAHUN AKADEMIK
2019/2020
NAMA
NIM
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG
Spirit to Achieve Your Future
JL. Barito No. 5 Malang; Telp (0341) 491132, 492052 Fax (0341) 485411
www.putraindonesiamalang.or.id, e-mail : akafarma.pi
Kode Dokumen
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN

PUTRA INDONESIA MALANG
RENCANA PEMBELAJARAN SEMESTER

MATA KULIAH (MK) KODE Rumpun MK BOBOT (sks) SEMESTER Tgl
Penyusunan
Pr. TA Spektrofotometri T=0 P=2 3 7 September
2019
OTORISASI Pengembang RPS Koordinator RMK Ketua PRODI
Capaian CPL-PRODI yang dibebankan pada MK

Pembelajaran (CP) S Menunjukkan sikap bertanggungjawab atas pekerjaan di bidang keahliannya secara mandiri
KU 1. Mampu menunjukkan kinerja bermutu dan terukur
2. Mampu memecahkan masalah pekerjaan dengan sifat dan konteks yang sesuai dengan bidang keahlian terapannya didasarkan
pada pemikiran logis, inovatif, dan bertanggungjawab atas hasilnya secara mandiri
3. Mampu bekerjasama, berkomunikasi, dan berinovasi dalam pekerjaannya
KK Mampu melaksanakan analisis sediaan farmasi, makanan dan minuman baik secara instrumental sesuai protap
P Menguasai keilmuan analisis farmasi dan makanan yang meliputi bidang : pengelolaan laboratorium dan Good Laboratory Practice (GLP),
teknik analisis kualitatif dan kuantitatif , teknik analisis mikrobiologi, dan instrumentasi, untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan
teknologi
Capaian Pembelajaran Mata Kuliah (CPMK)
CPMK 1. Mahasiswa mampu menjelaskan dengan benar substansi dan karakteristik senyawa yang dapat dianalisis dengan metode
spektrofotometer (C2, A2)
2. Mahasiswa mampu merumuskan dengan benar konsep dan prinsip instrumentasi spektrofotometer UV-VIS (C3, A3)
3. Mahasiswa mampu menganalisis senyawa menggunakan metode spektrofotometri dalam kerjasama tim (C3, P2, A4)
CPL  Sub-CPMK
CPL-1 1. Mampu menjelaskan analisis berbagai senyawa kimia, sediaan farmasi dan bahan alam dengan spektrofotometri UV
2. Mampu menjelaskan analisis berbagai senyawa kimia, sediaan farmasi dan bahan alam dengan spektrofotometri VIS
2
CPL-2 1. Mampu menjelaskan dengan tepat konsep instrumentasi dalam spektrofotometri UV-VIS
2. Mampu merumuskan dengan benar konfigurasi dan instrumentasi dalam spektrofotometri UV-VIS
CPL-3 1. Mampu melakukan analisis berbagai senyawa kimia, sediaan farmasi dan bahan alam dengan spektrofotometri UV
2. Mampu melakukan analisis berbagai senyawa kimia, sediaan farmasi dan bahan alam dengan spektrofotometri VIS
Deskripsi Singkat Konsep dasar dan prinsip spectrum elektromagnetik, sumber-sumber energy radiasi dan pengukuran absorpsi; prinsip antaraksi energy cahaya
MK dengan molekul; serta hukum Lambert-Beer; konsep teori orbital, jenis gugus kromofor dan spectra; konsep dasar dan prinsip-prinsip spectra vibrasi
molekul, teknik elusidasi struktur dalam spektra infra merah; konsep dasar dan prinssip emisi dan absorpsi di dalam nyala, proes atomisasi dan
ionisasi, jenis-jenis interfferensi dalam analisis spektroskopi serapan atom. Konsep dan prinsip serta bagian-bagian instrumentasi spektrofotometer.
Konsep dasar perhitungan dalam analisis spektrofotometri.
Bahan Kajian / Teknik Analisis Spektrofotometri, meliputi :
Materi - Spektrofotometri UV
Pembelajaran - Spektrofotometri Visibel
Pustaka Utama :
 Analisis Instrumental (Mulja M.1995.Airlangga University)
 Introduction To Spectrosopy (Pavia DL.Saunders College)
 Spektroskopi (Sastrohamidjojo H. 1985.Liberty.Yogyakarta)
 Instrumental Methods Analysis 7th edition (Wilard HH et al.1988.Wadsworth Publ.Belmont)
Pendukung :
 Elusidasi Struktur Senyawa Organik (Supratman, Unang.2010.Widyapadjajaran.Bandung)
 Analisis Farmasi edisi Mutakhir (Watson DG.2010.EGC.Jakarta)
 Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi (Harmita.2006.Departemen Farmasi FMIPA UI)
Dosen Pengampu Ayu Ristamaya Yusuf, Andini, Meiria Istiana Sari, Ambar Fidyasari
Matakuliah syarat Pr. Kimia Analisis Kuantitatif
Bantuk Pembelajaran,
Sub-CPMK Metode Pembelajaran, Bobot
Penilaian Materi Pembelajaran
Mg Ke- (Kemampuan akhir Penugasan Mahasiswa, Penilaian
[ Estimasi Waktu] [ Pustaka ]
tiap tahapan belajar) (%)
Indikator Kriteria & Bentuk Luring (offline) Daring (online)
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)
1 1. Mampu 1. Mahasiswa Ketepatan dalam Kuliah & Brainstorming, Video learning teknik 1. Konsep-
menjelaskan mampu mendeskripsikan dan smallgroup discussion analisis dengan konsep dasar
analisis mendeskripsi menjelaskan. Dosen : spektrofotometri UV- radiasi
berbagai kan dan Penilaian melalui Memberikan tutorial dan VIS elektromagneti
senyawa kimia, menjelaskan kegiatan pre test motivasi terkait k meliputi :
sediaan farmasi dengan maupun post test penyelesaian suatu Sifat radiasi
dan bahan alam contoh kasus yang berkaitan elektromagneti
dengan pengertian dengan topik, k, Absorpsi
3
spektrofotometri spectrum mengajukan dan
UV elektromagn menjawab pertanyaan
2. Mampu etik dan Mahasiswa :
menjelaskan sumber- Menyimak dengan baik,
analisis sumber mengajukan dan
berbagai energy menjawab pertanyaan
senyawa kimia, radiasi untuk serta aktif berdiskusi
sediaan farmasi pengukuran [TM 1x(2x50’)]
dan emisi
dan bahan alam absorpsi [BT+BM (1+1)x(2x50’)]
radiasi
dengan 2. Mahasiswa [PS 1x(4x50’)]
2. Konsep-
spektrofotometri mampu
konsep dasar
VIS menjelaskan
antaraksi
prinsip
energy cahaya
antaraksi
dan molekul
energy
3. Konsep-
cahaya
konsep dasar
dengan
hukum
molekul
Lambert-beer
3. Mahasiswa
dan
mampu
penyimpangan
mendefinisik
nya
an kembali
pengertian
hukum
Lambert-
beer beserta
contoh-
contoh
penyimpang
annya
2,3 1. Mampu 1. Mahasiswa Ketepatan dalam Kuliah & Brainstorming, Video learning INSTRUMENTASI
menjelaskan mampu mendeskripsikan dan smallgroup discussion instrumentasi dalam SPEKTROMETRI
dengan tepat menjelaskan menjelaskan. Dosen : spektrofotometri UV- o Penga
konsep dengan rinci Penilaian melalui Memberikan tutorial dan VIS ntar Instrumentasi
instrumentasi komponen kegiatan pre test motivasi terkait o Monok
dalam utama maupun post test penyelesaian suatu romator
spektrofotometri instrumentasi kasus yang berkaitan o Prepar
UV-VIS untuk dengan topik, asi Sampel
2. Mampu spektrofotom mengajukan dan
4
merumuskan etri UV-VIS menjawab pertanyaan
dengan benar 2. Mahasiswa Mahasiswa :
konfigurasi dan mampu Menyimak dengan baik, o Detekt
instrumentasi menjelaskan mengajukan dan or
dalam konsep Teori menjawab pertanyaan Berkas Sinar Tunggal
spektrofotometri Orbital serta aktif berdiskusi dan Ganda
UV-VIS Molekul, [TM 1x(2x50’)]
jenis gugus [BT+BM (1+1)x(2x50’)] SPEKTROMETRI
kromofor [PS 1x(4x50’)] SINAR UV-VIS
3. Mahasiswa o Teori
mampu Orbital Molekul
menginterpre o Kromo
tasi spektra for dalam UV
UV-VIS Interpretasi Spektra
dalam
analisis obat
4 Mampu melakukan Mampu menetapkan 1. Ketepatan Small Group Discussion, 1. Teknik pemilihan
analisis berbagai dan scanning dalam praktikum panjang
senyawa kimia, sediaan panjang gelomabang memilih alat Dosen : gelombang
farmasi dan bahan alam maksimal senyawa dan bahan Memberikan tutorial dan 2. Teknik penetapan
dengan spektrofotometri yang motivasi terkait panjang
UV dibutuhkan penyelesaian suatu gelombang
(efektif dan kasus yang berkaitan maksimal
efisien) dengan topik,
2. Ketepatan mengajukan dan
dan menjawab pertanyaan
kecepatan Mahasiswa :
dalam Menyimak dengan baik,
menyiapkan mengajukan dan
dan menjawab pertanyaan
mengoperasi serta aktif berdiskusi.
akn Melaksanakan
spektrootom praktikum sesuai modul
etri belajar
3. Kecepatan [BT+BM (1+1)x(2x50’)]
dan ketelitian [PL 2x(4x50’)]
dalam
menyiapkan
sampel
5
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
5 Mampu melakukan Mahasiswa mampu 1. Ketepatan Small Group Discussion, 1. Teknik 5
analisis berbagai melakukan dalam praktikum pemilihan
senyawa kimia, sediaan penetapan Kadar memilih alat Dosen : panjang
farmasi dan bahan alam Asetosal dalam dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri Tablet Aspilet secara yang motivasi terkait 2. Teknik
UV Spektrofotomeri UV dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
(berdasarkan nilai (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
1%
E1 cm) efisien) dengan topik, gelombang
2. Ketepatan mengajukan dan maksimal
dan menjawab pertanyaan 3. Teknik
kecepatan Mahasiswa : pengamatan
dalam Menyimak dengan baik, serapan pada
menyiapkan mengajukan dan panjang
dan menjawab pertanyaan gelombang
mengoperasi serta aktif berdiskusi. maksimal
akn Melaksanakan 4. Melakukan
spektrootom praktikum sesuai modul perhitungan
etri belajar kadar sampel
3. Kecepatan [BT+BM (1+1)x(2x50’)] berdasarkan
6
dan ketelitian [PL 2x(4x50’)] nilai
1%
E1 cm
dalam
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
farmasi dan bahan Asetosal dalam dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
alam dengan Tablet Aspilet secara yang motivasi terkait 2. Teknik
spektrofotometri UV Spektrofotomeri UV dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
(dengan kurva baku (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
standar) efisien) dengan topik, gelombang
7
3. Kecepatan [BT+BM (1+1)x(2x50’)] dengan kurva
dan ketelitian [PL 2x(4x50’)] baku
dalam
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingka
n standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui
rubrik
penilaian
psikomotorik.
farmasi dan bahan alam Vitamin C dalam dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri Tablet Vitamin C yang motivasi terkait 2. Teknik
UV secara dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
Spektrofotomeri UV (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
(dengan A-T-C efisien) dengan topik, gelombang
komparatif) 2. Ketepatan mengajukan dan maksimal
8
3. Kecepatan [BT+BM (1+1)x(2x50’)] dengan teknik
dan ketelitian [PL 2x(4x50’)] A-T-C
dalam komparatif
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
8 Evaluasi Tengah Semester / Ujian Tengan Semester (Praktikum) bobot 25%
farmasi dan bahan alam Vitamin C dalam dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri Tablet Vitamin C yang motivasi terkait 2. Teknik
9
VIS dengan metode 2,6D dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
secara (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
Spektrofotomeri VIS efisien) dengan topik, gelombang
(dengan A-T-C 2. Ketepatan mengajukan dan maksimal
komparatif) dan menjawab pertanyaan 3. Teknik
3. Kecepatan [BT+BM (1+1)x(2x50’)] dengan teknik
dan ketelitian [PL 2x(4x50’)] A-T-C
dalam komparatif
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
10
farmasi dan bahan alam silica dalam air dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri dengan reagen yang motivasi terkait 2. Teknik
VIS molibdat dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
Spektrofotomeri VIS (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
(dengan kurva baku) efisien) dengan topik, gelombang
dalam
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
11
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
farmasi dan bahan alam silica dalam air dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri dengan reagen yang motivasi terkait 2. Teknik
VIS molibdat dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
Spektrofotomeri VIS (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
(dengan kurva baku) efisien) dengan topik, gelombang
dalam
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
12
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
12,13 Mampu melakukan Mahasiswa mampu 1. Ketepatan Small Group Discussion, 5. Teknik 5
senyawa kimia, sediaan penetapan polifenol memilih alat Dosen : panjang
farmasi dan bahan alam dan flavonoid pada dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri bahan alam yang motivasi terkait 6. Teknik
VIS Spektrofotomeri VIS dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
(dengan kurva baku) (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
efisien) dengan topik, gelombang
akn Melaksanakan Melakukan
spektrootom praktikum sesuai modul perhitungan kadar
etri belajar sampel dengan kurva
3. Kecepatan [BT+BM (1+1)x(2x50’)] baku
dan ketelitian [PL 2x(4x50’)]
dalam
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
13
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
14,15 Mampu melakukan Mahasiswa mampu 1. Ketepatan Small Group Discussion, 1. Teknik 5
senyawa kimia, sediaan penetapan aktivitas memilih alat Dosen : panjang
farmasi dan bahan alam antioksidan pada dan bahan Memberikan tutorial dan gelombang
dengan spektrofotometri bahan alam yang motivasi terkait 2. Teknik
VIS Spektrofotomeri VIS dibutuhkan penyelesaian suatu penetapan
(dengan kurva baku) (efektif dan kasus yang berkaitan panjang
efisien) dengan topik, gelombang
dalam
menyiapkan
sampel
4. Ketepatan
panjang
gelombang
dibandingkan
standart
14
reference
5. Kecepatan
dalam
melakukan
pengukuran
serapan
6. Ketepatan
dan ketelitian
dalam
melakukan
perhitungan
7. Penilaian
melalui rubrik
penilaian
psikomotorik.
16 Evaluasi Akhir Semester / Ujian Akhir Semester (Tulis) bobot 35%
Keterangan :
TM : Tatap Muka (kuliah)
BT : Belajar Terstruktur
BM : Belajar Mandiri
PS : Praktikum Simulasi
PL : Praktikum Laboratorium
15
KONTRAK PERKULIAHAN
Peraturan Umum
1. Kehadiran dalam praktikum minimal 80% dari total 16 kali pertemuan. Sehingga peserta praktikum hanya boleh tidak hadir 3 kali dalam satu
semester.
2. Ketidakhadiran harus disertai dengan surat keterangan yang dapat dipertanggungjawabkan. Tidak diperkenankan ijin melalui sms/telepon dengan
sesama peserta praktikum. Jika tidak dapat menyertakan surat keterangan pada saat tersebut dapat menghubungi tim praktikum melalui sms/telepon
kemudian pada saat masuk, surat keterangan dapat disertakan.
3. Mahasiswa masuk tepat waktu dan toleransi keterlambatan yang diperbolehkan hanya 15 menit. Jika lebih dari itu maka peserta praktikum boleh
mengikuti kelas setelah ada penugasan tambahan
4. Selama proses pembelajaran, mahasiswa wajib mematuhi aturan yang berlaku di laboratorium.
5. Tidak diperkenankan memakai kaos, sandal atau sepatu sandal.
Pokok Bahasan Keterangan
Pengantar berupa penyampaian RPS dan Kontrak pembelajaran. Pendahuluan berupa gambaran
Pengantar dan Pendahuluan (TM ke-1)
umum tentang spektrofotometri.
Teknik analisis dan instrumentasi Spektrofotometri (TM Pengenalan instrumentasi spektrofotometri, analisis kualitatif dan kuantitatif secara spektrofotometri
ke-2 sd TM ke-3)
Penetapan dan scanning panjang gelombang maksimal Rivanol, kloramfenikol, kurkumin
senyawa (TM ke-4)
Penetapan kadar asetosal (TM ke-5 sd TM ke-6) Metode kapasitas molar () dan kurva baku
Penetapan kadar vitamin C (TM ke-7) Metode spektrofotometri UV
UTS (TM ke-8) Tes tulis (perhitungan kuantitatif)
Penetapan kadar vitamin C (TM ke-9) Metode spektrofotometri Vis dengan reagen 2.6D
Penetapan kadar silika dalam air (TM ke-10) Metode spektrofotometri Vis dengan reagen ammonium molibdat
Penetapan kadar fosfat dalam air (TM ke-11) Metode spektrofotometri Vis dengan reagen ammonium molibdat
Penetapan kadar polifenol dalam produk teh Metode spektrofotometri Vis dengan reagen folin coucalteu
(TM ke-12 sd TM ke-13)
Penetapan aktivitas antioksidan dalam produk teh Metode spektrofotometri Vis dengan reagen DPPH
(TM ke-14 sd TM ke-15)
UAS (TM ke-16) Tes Tulis (MCQ)
16
PENGANTAR SPEKTROFOTOMETRI
Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan

spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi secara
relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang
gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau yang diabsorpsi.
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai
sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak
(380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan
kualitatif.
Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi electron-
electron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi
berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau
tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet
meningkatkan energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh
foton-foton memungkinkan electron-electron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar
ke orbital baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam
daerah UV-tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri,
yang dapat dieksitasi ketingkat energi yang lebih tinggi.
Absorbsi untuk transisi electron seharusnya tampak pada panjang gelombang diskrit
sebagai suatu spectrum garis atau peak tajam namun ternyata berbeda. Spektrum UV
maupun tampak terdiri dari pita absorbsi, lebar pada daerah panjang gelombang yang
lebar.Ini disebabkan terbaginya keadaan dasar dan keadaan eksitasi sebuah molekul dalam
subtingkat-subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi elektronik dapat terjadi dari subtingkat apa
saja dari keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi. Karena pelbagitransisi
ini berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang absorpsinya juga berbeda
sedikit dan menimbulkan pita lebar yang tampak dalam spectrum itu.
Di samping pita-pita spectrum visible disebabkan terjadinya tumpang tindih energi
elektronik dengan energi lainnya (translasi, rotasi, vibrasi) jugadisebabkan ada faktor lain
sebagai faktor lingkungan kimia yang diberikan oleh pelarut yang dipakai. Pelarut akan
sangat berpengaruh mengurangi kebebbasan transisi elektronik pada molekul yang
dikenakan radiasi elektromagnetik. Oleh karenaitu, spektrum zat dalam keadaan uap akan
memberikan pita spectrum yang sempit.
Panjang gelombang dimana terjadi eksitasielektronik yang memberikan absorban
maksimum disebut sebagai panjang gelombang maksimum ( )(maks λ . Penentuan panjang
gelombang maksimum yang pasti (tetap) dapat dipakai untuk identifikasi molekul yang
bersifat karakteristik-karakteristik sebagai data sekunder. Dengan demikian spektrum visibel
dapat dipakai untuk tujuan analisis kualitatif (data sekunder) dan kuatitatif. Molekul-molekul
yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron akan menyerap cahaya pada
panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang menyerap energi lebih sedikit akan
menyerap cahaya pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap
caha dalam daerah tampak memiliki electron yang lebih mudah dipromosikan daripada
senyawa yang menyerap cahaya pada panjang gelombang UV yang lebih pendek.
Pemisahan tenaga yang paling tinggi diperoleh bila elektron-elektron dalam ikatan
tereksitasi yang menimbulkan serapan dalam daerah dari 120-200nm. Daerah ini dikenal
sebagai daerah Ultra Violet(UV) vakum dan relative tidak banyak menimbulkan keterangan.
Diatas 200 nm eksitasi elektron. Dari orbital-orbital p dan d, dan orbital π terutama sistem
konjugasi π segera dapat diukur, dan spektra yang diperoleh memberikan banyak
keterangan.
17
Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai untuk data
sekunder atau data pendukung. Pada analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-
Vis yang dapat ditentukan ada 2 yaitu :
1) Pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis.
2) Penentuan panjang gelombang maximum.
Pada penentuan panjang gelombang maksimum didasarkan atas perhitungan pergeseran
panjang gelombang maximum karena adanya penambahan gugus pada sistem kromofor
induk.
Kaidah Woodward dan Fieser membahas secara terinci tentang pergeseran panjang
gelombang maximum yang disebabkan substitusi berbagai gugus ke dalam, diena
terkonjugasi, aromatic karbonil, keton tak jenuh dan poliena. Dengan demikian setiap
substitusi kimia akan dapat diperhitungkan terlebih dahulu berapa panjang gelombang
maksimumnya dengan memakai tabel yang disusun atas dasar kaidah Woodward dan
Fieser. Kemungkinan memang ada perbedaan harga panjang gelombang maximum antara
hasil perhitungan dengan tabel Wooward-Fieser terhadap harga panjang gelombang
maksimum hasil perhitungan dengan panjang gelombang maximum darihasil pengamatan.
Besarnya perbedaan panjang gelombang maximum hasil perhitungan dengan panjang
gelombang maximum hasil pengamatan biasanya bergeser antara 0 sampai 4 nm.
Kuantitasnya energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding terbalik dengan panjang
gelombang radiasi :
Radiasi elektromagnetik (REM)

Radiasi elektromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam
bentuk gelombang-gelombang. Untuk menggambarkan sifat-sifat REM, digunakan 2 teori
yang saling melengkapi yaitu teori panjang gelombang dan teori korpuskuler. Teori panjang
gelombang digunakan untuk menerangkan beberapa parameter REM yang berupa
kecepatan, frekuensi, panjang gelombang, dan amplitude, dan tidak dapat menerangkan
fenomena-fenomena yang berkaitan dengan serapan atau emisi dari tenaga radiasi. Untuk
proses ini, maka diperlukan teori korpuskuler yang menyatakan bahwa radiasi
elektromagnetik sebagai partikel yang bertenaga yang disebut foton. Tenaga foton
berbangding langsung dengan frekuensi radiasi.
Ada 2 teori yang digunakan :
1. Teori panjang gelombang dan kecepatan
REM juga dicirikan dengan frekuensi (banyaknya daur.lingkar lengkap tiap detik). Radiasi
dengan frekuensi lebih tinggi mengandung gelombang lebih banyak per detik. Hubungan
antara panjang gelombang dan frekuensi adalah sbb:
18
2. Teori partikel atau foton
- Cahaya adalah sumber energi
- REM dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang menyerupai partikel yang
disebut foton atau kuantum. Energi suatu foton memiliki hubungan sebagi berikut :
Suatu molekul memiliki panjang gelombang sendiri-sendiri. Panjang gelombang suatu

molekul memiliki panjang gelombang yang tetap untuk terjadinya absorbansi yang
maksimum.
Kromofor
Berasal dari kata Chromophorus yang berarti pembawa warna. Dalam pengertian yang
dikembangkan, kromofor merupakan suatu gugus fungsi yang menyerap radiasi
elektromagnetik apakah gugus itu berwarna atau tidak. Kromofor digunakan untuk
menyatakan gugus tidak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah-daerah
ultraviolet dan visible.
Auksokrom
Suatu subtituen pada kromofor yang menghasilkan pergeseran merah. Ciri auksokrom
adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor, misalnya : -OCH3, -Cl, -OH, NH2.
Contoh : pada konjugasi pasangan electron bebas pada atom nitrogen dari enamina akan
mengeser serapan maksimum dari harga ikatan ganda terisolasi pada 190nm ke230nm.
Subtituen nitrogen adalah auksokrom. Suatu auksokrom akan memperpanjang kromofor dan
menghasilkan suatu kromofor baru.
Pergeseran merah atau efek batokromik merupakan pergeseran serapan maksimum ke

panjang gelombang lebih panjang. Hal ini dapat disebabkan oleh perubahan pelarut atau
adanya suatu auksokrom. Geseran ke panjang gelombang yang lebih panjang
mencerminkan fakta bahwa electron dalam suatui system tergabung (terkonjugasi) kurang
kuat terikat daripada dalam suatu system tak tergabung.
Pergeseran biru atau efek hipokromik merupakan pergeseran ke panjang gelombang lebih
pendek. Hal ini disebabkan oleh perubahan pelarut atau adanya konjugasi dari electron
pasangan bebas pada atomnitrogen anilia dengan system ikatan πcincin benzene
dihilangkan dengan adanya protonasi. Anilia menyerap pada 230nm ( ε8600) tetapi dalam
larutan asam puncak utamanya hamper sama dengan benzene yaitu 203nm ( ε7500), terjadi
pergeseran biru.
Efek hiperkromik→kenaikan dalam intensitas serapan
Efek hipokromik→penurunan dalam intensitas serapan
Berkas radiasi dikenakan pada cuplikan dan intensitas radiasi yang ditransmisikan diukur.
Radiasi yang diserap oleh cuplikanditentukan dengan membandingkan intensitas dari
berkas radiasi yang ditransmisikan bila spesies penyerap tidak ada dengan intensitas yang
ditransmisikan bila spesies penyerap ada. Kekuatan radiasi dari berkas cahaya sebanding
dengan jumlah foton per detik yang melalui satu satuan luas penampang. Jika foton yang
mengenai cuplikan tenaga yang sama dengan yang dibutuhkan untuk menyebabkan
terjadinya perubahan tenaga, maka serapan dapat terjadi.
Tingkat kejadian absorbsi tergantung pada :
 Jarak yang diarungi radiasi melewati larutan itu
 Panjang gelombang radiasi
 Sifat dasar spesies molekul dalam larutan
Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis dapat digolongkan atas tiga
macam pelaksanaan pekerjaan yaitu :
1. Analisis kuantitatif zat tunggal (analisis satu komponen)
2. Analisis kuantitatif campuran 2 macam zat (analisis 2 komponen)
19
3. Analisis kuantitatif campuran 3 macam zat (analisis multi komponen)
Analisis kuantitatif zat tunggal dilakukan dengan pengukuran harga A pada panjang
gelombang maksimum atau dilakukan pengukuran%T pada panjang gelombang minimum.
Dilakukan pengukuran pada panjang gelombang maksimum karena perubahan absorban
untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar pada panjang gelombang maksimal,
sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Selain itu pita serapan di sekitar
panjang gelombang maksimal datar dan pengukuran ulang dengan kesalahan yang kecil
dengan demikian akan memenuhi hokum Lambert-Beer.
Ada 4 cara pelaksanaan analisis kuantitatif zat tunggal yaitu :

1. Membandingkan absorban atau persen transmitan zat yang dianalisis dengan
reference standard pada panjang gelombang maksimal.
A(S). C(S)= A(R.S). C(R.S)
Dimana :
A(S)= absorban larutan sample
C(S)= konsentrasi larutan sample
A(R.S)= absorban reference standard
C(R.S)= kosentrasi larutan reference standard
2. Memakai kurva baku dari larutan refence standard dengan pelarut tertentu pada
panjang gelombang maksimum. Dibuat grafik system koordinat Cartesian di mana
sebagai ordinat adalah absorban dan sebagai absis adalah konsentrasi.
3. Menghitung harga absorbansi larutan sample pada pelarut tertentu dan

dibandingkan denga absorbansi zat yang dianalisis yang tertera pada buku resmi.
4. Memakai perhitungan nilai ekstingsi molar (absorbansi molar ε) sama dengan cara
yang ketiga hanya saja pada perhitungan absorbansi molar lebih tepat karena
melibatkan massa molekul relative (Mr)
Analisis kuantitatif campuran dua komponen merupakan teknik pengembangan analisis

kuantitatif komponen tunggal. Prinsip pelaksanaannyaadalah mencari absorban atau beda
absorban tiap-tiap kimponen yang memberikan korelasi yang linier terhadap konsentrasi,
sehingga akan dapt dihitung masing-masing kadar campuran zat tersebut secara serentak
atau salah satu komponen dalam campurannya dengan komponen lainnya.
Instrumentasi
Instrument yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik
sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut “spectrometer” atau spektrofotometer.
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkamsinar dari spectrum dengan panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau
yang diarbsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika
energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang
gelombang dari sinar putih dapt lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai
seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filte, sinar dengan panjang
gelombang yang diinginkandiperoleh dengan berbagai filter dengan berbagai warna yang
mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer
filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis,
melainkan suatu trayekpanjang gelomabang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer,
panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat
20
pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spectrum
tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengarbsorbsi untuk larutan sample dan blangko
ataupun pembanding.
1. Sumber
Sumber yang biasa digunakan pada spektroskopi absorbsi adalah lampu wolfram.
Arus cahaya tergantung pada tegangan lampu, i=KV n , i= arus cahaya, V = tegangan, n =
eksponen (3-4 pada lampu wolfram), variasi tegangan masih dapat diterima 0,2% pada
suatu sumber DC, misalkan : baterai. Lampu hydrogen atau lampu deuterium digunakan
untuk sumber pada daerah UV. Kebaikan lampu wolfram adalah energi radiasi yang
dibebaskan tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang.Untuk memperoleh tegangan
yang stabil dapat digunakan transformator. Jika potensial tidak stabil, kita akan
mendapatkan energi yang bervariasi. Untuk mengkonpensasi hal ini maka dilakukan
pengukuran transmitan larutan sample selalu disertai larutan pembanding.
2. Monokromator
Digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya dapat
berupa prisma ataupun grating. Untuk mengarahkan sinar monokromatis yang
diinginkan dari hasil penguraian ini dapat digunakan celah. Jika celah posisinya
tetap, maka prisma atau gratingnya yang dirotasikan untuk mendapatkan λyang
diinginkan. Ada dua tipe prisma seperti ditunjukkan di bawah ini, yaitu susunan
Cornu dan susunan Littrow.
Secara umum tipe Cornu menggunakan sudut 60º, sedangkan tipe Littrow
menggunakan prisma di mana pada sisinya tegak lurus dengan arah sinar yang
berlapis alumunium serta mempunyai sudut optic 30º. Kekuatan dispersedinyatakan
dengan persamaan :
21
3. Sel absorbsi
Pada pengukuran di daerah tampak kurvet kaca atau kurvet kaca corex dapat
digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerahUV kita harus menggunakan sel
kuarsa karena gelas tidak tembus daerah cahaya pada daerah ini. Umumnya tebal
kurvetnya adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat
digunakan. Sel yang digunakan biasanya berbentuk persegi , tetapibentuk silinder
dapat juga digunakan. Kita harus dapat menggunakan kurvet yang bertutup untuk
pelarut organic. Sel yang baik adalah kuarsa atau gelas hasil leburan serta seragam
keseluruhannya.
Sel untuk spektroskopi UV terbuat dari kuarsa, gelas atau plastik. Meskipun kuarsa
transparan pada seluruh daerah antara 200 -700 nm, akan tetapi gelas dan plastik
terpotongdi daerah antara 350 dan 300 nm, tidak tempus sinar pada daerah panjang
gelombang yang lebih pendek dari itu, dan hanya digunakan dalam daerah spektrum
sinar tampak. Oleh karena itu, untuk analisis pada daerah ultraviolet maka
spektrsokopi harus menggunakan sel kuarsa. Ada beberapa kekurangan sel kuarsa,
yaitu mudah pecah dan sangat mahal daripada gelas dan plastik, dan harus
ditangani dengan sangat hati -hati. Meskipun sel plastik lebih murah, akan tetapi sel
plastik hanya dapat digunakan dengan pelarut tertentu biasanya air atau alkohol.
Apapun bahannya, sel UV yang baku berbentuk kubus dengan ketebalan 1 cm dan
tinggi 3 cm (Gambar 8.1). Permukaan yang dihadapkan kepada berkas sinar, dan sel
dibuat sedemikian rupa sehingga panjang lintasan yang dilalui oleh sinar tepat 1 cm.
Permukaan lain dibuat kasar untuk membedakan dengan permukaan yang halus,
dan permukaan kasar tersebut yang pegang bila memegang sel. Untuk mengurangi
volume dan panjang sel tersebut dapat dilakukan dengan memasang filler plugs.
Sel-sel bervolume kecil dengan panjang 1 cm juga telah tersedia. Jika volume
larutan yang ada sangat sedikit maka dapat digunakan mikrosel. Mikrosel adalah
suatu sel dengan luas penampang internal 2 mm dan panjang sependek 0,1 mm.
Berbagai macam sel kuarsa yang dapat digunakan untuk menentukan spektra
senyawa dalam fase gas juga telah tersedia. Sel-sel tersebut dilengkapi dengan
pipa aliran gas masuk dan keluar, serta mempunyai panjang antara 1,0 sampai 100
mm. Telah tersedia pula sel berjaket yang dapat dilalui cairan bersiskulasi untuk
mengontrol temperatur.
22
Cara kerja spektrofotometer
Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan
pembanding, misalnya blangko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis
pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok 200nm-650nm (650nm-1100nm) agar
daerah λyang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup “nol”
galvanometer didapat dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan,
buka fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blangko dan “nol” galvanometer didapat
dengan memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakan tombol transmitansi, kemudian
atur besarnya pada 100%. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan
dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliptui:
1) Sumber tenaga radiasi yang stabil
2) Sistem yang terdiri dari lensa-lensa,cermin, celah-celah, dan lain-lain
3) Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang
gelombang tunggal
4) Tempat culikan yang transparan
5) Detektor radiasi yang dihubungkan dengan system meter atau pencatat
Diagram sederhana dari spektrofotometer adalah sebagai berikut

(1) Sumber Tenaga Radiasi
Sumber tenaga radiasi terdiri dari bendayang tereksitasi hingga ke tingkat tenaga yang
tinggi oleh sumber listrik bertegangan tinggi atau oleh pemanasan listrik. Benda atau materi
yang kembali ke tingkat tenaga yang lebih rendah atau ke tingkat dasarnya, melepaskan
foton dengan tenaga-tenaga yang karakteristik yang sesuai dengan ΔE, yaitu perbedaan
tenaga antara tingkat tereksitasi dan tingkat dasar rendah. Sumber radiasi yang ideal untuk
pengukuran serapan harus menghasilkan spektrum kotinu dengan intensitas yang seragam
pada keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang dipelajari.
a. Sumber Radiasi Ultraviolet
Sumber-sumber radiasi ultraviolet yang kebanyakan digunakan adalah lampu
hydrogen dan lampu deuterium. Mereka terdiri dari sepasang elektroda yang
terslubung dalam tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada
tekanan yang rendah. Bila tegangan yang tinggi dikenakan pada elektroda-elektroda,
maka akan dihasilkan electron-elektron yang mengeksitasikan electron-elektron lain
dalam molekul gas ke tingkatan tenaga yang tinggi. Bila electron-elektron kembali ke
tingkat dasar mereka melepaskan radiasi dalam daerah sekitar 180 dan 350 nm.
Sumber radiasi UV yang lain adalah lampu xenon, tetapi dia tidak sestabil lampu
hydrogen.
b. Sumber Radiasi Terlihat
Sumber radiasi terlihat dan radiasi infra merah dekat yang biasa digunakan adalah
lampu filament tungsten. Filament dipanaskan oleh sumber arus searah (DC), atau
oleh baterai. Filament tungsten menghasilkan radiasi kontinu dalam daerah antara
350 dan 2500 nm.
(2). Monokromator
Seperti kita ketahui bahwa sumber radiasi yang umum digunakan menghasilkan radiasi
kontinu dalam kisaran panjang gelombang yang lebar. Dalam spektrofotometer, radiasi yang
polikromatik ini harus diubah menjadi radiasi monokromatik. Ada 2 jenis alat yang digunakan
untuk mengurai radiasi polikromatik menjadi radiasi monokromatik yaitu penyaring dan
monokromator. Penyaring dibuat dari benda khusus yang hanya meneruskan radiasi pada
daerah panjang gelombang tertentu dan menyerap radiasi dari panjang gelombang yang
lain. Monokromator merupakan serangkaian alat optic yang menguraikan radiasi
polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif/panjang gelombang-gelombang tunggalnya dan
memisahkan panjang gelombang-gelombang tersebut menjadi jalur-jalur yang sangat
sempit.
(3). Tempat cuplikan
23
Cuplikan yang akan dipelajari pada daerah ultraviolet atau terlihat yang biasanya berupa gas
atau larutan ditempatkan dalam sel atau cuvet. Untuk daerah ultraviolet biasanya digunakan
Quartz atau sel dari silika yang dilebur, sedangkan untuk daerah terlihat digunakan gelas
biasa atau Quartz. Sel yang digunakan untuk cuplikan yang berupa gas mempunyai panjang
dari 0,1 hingga 100 nm, sedang sel untuk larutan mempunyai panjang lintasan tertentu dari
1 hingga 10 mm, sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air, atau jika dikehendaki
dapat dicuci dengan larutan deterjen atau asam nitrat panas.
*Pelarut
Pelarut-pelarut yang digunakan spektrofotometri harus:
1) Melarutkan cuplikan
2) Meneruskan radiasi dalam daerah panjang gelombang yang sedang dipelajari.
3) Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya dan tidak berwarna
4) Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis.
5) Kemurniannya harus tinggi, atau derajat untuk analisis tinggi.
Hal lain yang perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah polaritas pelarut, karena
akan sangat mempengaruhi pergeseranspectrum yang dianalisis. Beberapa pelarut yang
bisa digunakan dalam daerah-daerah ultraviolet dan terlihat adalah seperti : aseton,
benzena, karbon tetraklorida, kloroform, dioksan, sikloheksan, isopropanol, diklorometan,
96% etanol, etil, eter, methanol, air, dan sebagainya.
Pembuatan Larutan
Larutan selalu dibuat dengan cermat : larutan standar dibuat dalam labu ukur, konsentrasi
biasanya sekitar 0,1%. Untuk pekerjaan yang memerlukan ketelitian semua gelas-gelas
standar dan sebagainya harus mempunyai kualitas analitis yang tinggi, dan jika
pengenceran dilakukan harus dikerjakan dalam volume yang dapat diukur dengan teliti;
karena perbedaan volume yang sangat kecil akan dapat menyebabkan kesalahan.
Di dalam menyiapkan larutan, contoh harus ditimbang dengan teliti dan volumenya harus
diukur dengan labu ukur. Pengenceran dapat dilakukan sampai konsentrasi yang
dikehendaki tercapai. Kebersihan sel adalah suatu hal yang sangat penting. Sel harus
dibilas beberapa kali dengan pelarut dan diperiksa absorpsinya. Pembilasan sel dapat
dilakukan pula dengan menggunakan deterjen atau asam nitrat panas untuk meng
hilangkan sisa-sisa contoh sebelumnya.
Absorbansi suatu contoh adalah sebanding dengan konsentrasi dan panjang sel yang dilalui
sinar, sesuai dengan pernyataan
A=Cl
Jika menggunakan sel UV standar, l = 1, maka
A=C
Oleh karena harga maksimum A yang biasa dapat dijangkau oleh spektrometer adalah 2
maka perlu memilih konsentrasi yang akan memberikan harga A tetap berada dalam
cakupan tersebut. Meskipun harga koefisien ekstinsi  relatif sulit diketahui, tapi hal ini
dapat diakali karena tidaklah lazim bagi senyawa organik mempunyai  dengan nilai
10.000 atau lebih. Untuk menerapkan harga l = 1 dan  = 10.000 ke dalam hukum
BeerLambert agar menghasilkan harga A = 1 maka perlu suatu larutan yang konsentrasinya
10-4M (0,0001 M). Jadi apabila di dalam suatu analisis dengan spektroskopi UV memberikan
harga A yang sangat besar maka jalan keluarnya adalah melakukan pengenceran terhadap
contoh yang dianalisis.
Masalah lain yang mungkin ditemui dalam spektra UV adalah senyawa yang dianalisis
mempunyai dua kromofor dengan koefisien ekstinsi lebar. Sebagai contoh, senyawa
mungkin mempunyai sebuah kromofor dengan koefisien ekstinsi 10.000 pada penyerapan
250 nm, dan senyawa ini mungkin pula memiliki penyerapan dengan intensitas yang lebih
lemah ( = 100) yang disebabkan oleh kromofor lain, katakanlah pada 350 nm. Jika
spektrometer dijalankan pada konsentrasi 0,0001 M maka mungkin kita dapat melihat
24
puncak yang lebar (A = 1) pada 250 nm, tapi kromofor kedua akan mempunyai serapan
0,01; yakni sebuah puncak yang sangat kecil dan mungkin saja hilang. Masalah ini dapat
disiasati dengan melakukan analisis pada dua konsentrasi yang berbeda dengan faktor
perbedaan 100. Pertama buatlah konsentrasi yang lebih pekat dan jalankan spektrumnya,
kemudian encerkan contoh tersebut dan jalankan spektrumnya.
(4). Detektor
Peranan detector penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang. Pada spektrofotometer, tabung pengganda electron yang digunakan
prinsip kerjanya telah diuraikan. Setiap detector menyerap tenaga foton yang mengennainya
dan mengubah tenaga tersebut untuk dapat diukur secarakuantitatif seperti sebagai arus
listrik atau perubahan-perubahan panas. Kebanyakan detector menghasilkan sinyal listrik
yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat. Setiap pencatat harus menghasilkan sinyal
yang secara kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang mengenainya. Persyaratan-
persyaratn penting untuk detector meliputi :
1) Sensitivitas tinggi hingga dapat mendeteksi tenaga cahaya yang mempunyai
tingkatan rendah sekalipun
2) Waktu respon pendek
3) Stabilitas yang panjang/lama untuk menjamin respon secara kuantitatif
4) Sinyal elektronik yang mudah diperjelas.
25
MANUAL PROSEDUR PENGGUNAAN SPEKTROFOTOMETER
(Genesys 10S Spectrophotometer)
26
27
28
Pengukuran A dan %T (basic ATC measurement)
1. Setting a wavelength
a. Press Set nm or any number key to set wavelength
b. Enter the wavelength for taking measurement and press Set nm again
29
2. Measuring a blank
a. Place the blank in the cell holder. Place the blank in the B position
b. To enter an absorbance or transmittance value for the blank, press a number
key and ener desired value in the entry field
c. Press measure blank
3. Measuring sample
If a 6-position cell changer is installed, place the sample in the cell positions and
press the corresponding cell position button to move the cell holder to the
measuring position. The absorbance (abs) or percent transmittance (%T)
measurement appears on the display
30
31
32
33
34
Topik 1 Pengukuran dan scanning panjang gelombang maksimal berbagai
sampel
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar pengukuran panjang

gelombang maksimal untuk keperluan analisis kualitatif maupun
kuantitatif
2. Mahasisa mampu melakukan proses pengukuran dan scanning
panjang gelombang maksimal parasetamol, rivanol, dan
kurkumin
Ringkasan Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau

Teori absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang, sedangkan
pengukuran menggunakan spektrofotometer, metoda yang digunakan
sering disebut dengan spektrofotometri. Dalam ilmu kefarmasiaan
spektrofotometri digunakan untuk menganalisis kadar obat.
Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode
ini memberikan metode yang cepat, sederhana, spesifik, sensitive, dan
dapat dipakai untuk analisis zat uji dalam jumlah/kadar yang kecil.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan
visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi.
Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang
gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan
spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.

Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :
A=abc
A = log (Io/It) = a b c
Keterangan :
Io = Intensitas sinar datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
Spektofotometer memiliki spesifikasi yang bermacam-macam, dan
yang sering digunakan dalam metode analisis adalah spektrofotometri
UV dan sinar tampak atau visible.
Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV
dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber
cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih
canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber
UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan
paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat
digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak
berwarna.
Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu
larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang serap. Semakin pekat
35
warna, semakin banyak cahaya yang di serap.
Analisis Kualitatif
Panjang gelombang dimana suatu larutan zat uji memiliki serapan
maksimum (disebut panjang gelombang serapan maksimum)
merupakan ciri khas dari zat uji tersebut dalam metode
spektrofotometri. Panjang gelombang serapan maksimum dapat
ditentukan dengan cara membuat spectrum penyerapan dari larutan zat
uji. Dari spectrum yang penyerapan yang diperoleh, panjang
gelombang serapan maksimum larutan zat uji dibandingkan dengan
panjang gelombang serapan maksimum larutan baku pembanding
(larutan standar yang terkandung senyawa uji yang konsentrasinya
sudah diketahui). Bila sama, maka zat uji sama dengan baku
pembanding. Tinggi rendahnya konsentrasi larutan, akan
mempengaruhi intensitas serapan, namun tidak mempengaruhi
panjang gelombang. Oleh karena itu, jika terdapat dua larutan
terkandung senyawa yang sama akan menghasilkan panjang
gelombang maksimum yang sama.
Analisis Kuantitatif
Analisa kuantitatif umumnya didasarkan atas pengukuran serapan dari
larutan zat uji pada panjang gelombang serapan dengan konsentrasi
larutan. Prosedur kerja pada analisa kuantitatif meliputi:
1) Penyiapan Larutan Uji.
Dalam penyiapan larutan uji perlu diperhatikan kadar larutan. Kadar
larutan diduat sedemikian agar diperoleh serapan antara 0,2-0,8
sehingga memenuhi hokum Beer. Pada rentang serapan tersebut
persentase kesalahan analisis masih dalam batas yang dapat diterima,
yaitu 0,5-1%. Diluar rentang tersebut, dapat menyebabkan terjadinya
kesalahan fotometrik yang dapat mempengaruhi keakuratan metode
fotometrik.
2) Pencarian Operating Time.
Cara ini biasanya dilakukan jika digunakan pengukuran hasil reaksi
atau pembentukan warna. Waktu operasional atau operating
time merupakan waktu yang dibutuhkan suatu senyawa untuk bereaksi
dengan senyawa lain hingga terbentuk senyawa produk yang stabil.
Kestabilan senyawa produk diketahui dengan mengamati absorbansi
mulai dari saat direaksikan hingga tercapai serapan yang stabil.
Pengukuran serapan ini dilakukan pada panjang gelombang maksimal
teoritis.
3) Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum.
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah
panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Ada
beberapa alasan mengapa harus dilakukan pada panjang gelombang
maksimal:
Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal
karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan
absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi larutan adalah yang paling
besar
Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi linier,
36
sehingga memenuhi hukum lambert-beer
Jika dilakukan pengukuran ulang, akan menghasilkan hasil yang cukup
konstan
4) Pembuatan Kurva Baku.
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai
konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan
antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum lambert-beer
terpenuhi, maka kurva baku berupa garis lurus. Dengan adanya kuva
baku, maka dapat digunakan untuk mencari absorbtifity atau
persamaan regresi linier sehingga dapat digunakan dalam pencarian
suatu kadar yang absorbansinya sudah diukur.
5) Pengukuran Serapan Larutan.
Pada analisis zat tunggal, serapan larutan zat uji dan serapan larutan
baku diukur pada panjang gelombang maksimum. Pada analisis zat
campuran, serapan zat uji diukur pada lebih dari satu panjang
gelombang, dimana setiap komponen campuran memiliki perbedaan
serapan maksimum. Pada setiap pengukuran serapan larutan zat uji
atau baku pembanding, harus selalu dibandingkan dengan larutan
blangko, yaitu pelarut yang digunakan untuk melarutkan zat uji
Prosedur CHLORAMFENIKOL
(kapsul)
Methoda : Spektrofotometri
Pustaka : FI Edisi III Th.1979
Syarat : 92,5 – 107,5%
Prosedur :
- Setara 200 mg Kloramfenikol + 6 ml alkohol
absolut, kocok larut. + air ad 100,0 ml. Kocok
homogeny, saring.
- 1,0 ml filtrat + air ad 100 ml
- Amati pada 278 nm
Hasil perhitungan konsentrasi larutan sampel kloramfenikol

200 mg 200 mg 2000 mg
= = =2000 ppm
100 mL 0.1 L L
1mL
× 2000 ppm=20 ppm
100 mL
Pembuatan Larutan Baku Kloramfenikol

1. Menimbang dengan seksama 200mg standar kloramfenikol
menggunakan botol timbang
2. Melarutkan dengan 10mL etanol 96% dan ditambah air sampai
100.0mL (larutan dengan konsentrasi 2000ppm)
3. Sebanyak 1.0mL larutan baku 2000ppm dipipet dan dimasukkan
dalam labu ukur 100.0mL
4. Larutan ditambah air sampai tanda batas (diperoleh larutan dengan
konsentrasi 20ppm)
37
5. Menyiapkan larutan blanko berupa aquadest
RIVANOL
(tablet)
Pustaka : MA PPOM (10/OB/89)
Syarat : 90,0 – 110,0%
Prosedur :
- 1,0 ml sampel + air ad 50,0 ml
- Amati pada 363 nm
Hasil perhitungan konsentrasi larutan sampel rivanol

Diketahui dalam sediaan rivanol mengandung 0.1% bahan aktif
0.1%b/v = 0.1g bahan aktif dalam 100mL larutan
0.1 g 1g 1000 mg
= = =1000ppm
100 mL 1000mL 1L
1mL
× 1000 ppm=20 ppm
50 mL
Pembuatan Larutan Baku Rivanol

1. Menimbang dengan seksama 100mg standar rivanol menggunakan
botol timbang
2. Melarutkan dengan air sampai 100.0mL (larutan dengan konsentrasi
1000ppm)
konsentrasi 20ppm)
Pengamatan max dan spectra UV-Vis

1. Siapkan spektrofotometer dengan cara menyalakan alat sesuai
manual prosedur alat minimal selama 20menit sebelum digunakan
2. Bersihkan kuvet yang akan digunakan dengan cara merendam
dalam larutan deterjen selama 10menit, kemudian dibilas dengan
air. Rendam dalam alcohol 70% selama 10 menit kemudian bilas
dengan aquadest dan keringkan.
3. Sebelum digunakan bilas kuvet dengan larutan yang akan
digunakan untuk pengukuran dengan spektrofotometer
4. Isi kuvet dengan aquadest dan larutan baku yang akan dibaca
minimal 2/3 volume kuvet
5. Letakkan kuvet yang berisi blanko pada cell holder dengan kode B
dan larutan baku pada cell holder 1
6. Lakukan pengukuran panjang gelombang sesuai dengan manual
prosedur setting wavelength dan scanning
38
Hasil Aspek Kloramfenikol Rivanol
Wadah : Wadah :
Penimbangan Wadah+zat : Wadah+zat :
Zat : Zat :
Konsentrasi
274nm : 359nm :
276nm : 361nm :
Pengamatan A
278nm : 363nm :
pada max
280nm : 365nm :
282nm : 367nm :
Pengamatan
spectra (selisih 
1nm dengan
rentang 10nm
dari max)
Pembahasan
39
Kesimpulan
40
Topik 2 Penetapan Kadar Asetosal dalam Tablet Aspilet secara
Spektrofotomeri UV
(berdasarkan nilai E11 %cm)
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar asetosal

secara spektrofotometri UV dengan nilai E11 %cm
2. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar asetosal secara
spektrofotometri UV dengan nilai E11 %cm
Ringkasan Asam asetilsalisilat mempunyai nama sinonim asetosal, asam salisilat

Teori asetat dan yang paling terkenal adalah aspirin. Serbuk asam asetil
salisilat dari tidak berwarna atau kristal putih atau serbuk granul kristal
yang berwarna putih. Nilai titik lebur dari asam asetil salisilat adalah
135oC. Asam asetilsalisilat larut dalam air (1:300), etanol (1:5),
kloroform (1:17) dan eter (1:10-15), Asam asetilsalilsilat larut dalam
larutan hidroksida dan karbonat (Dirjen POM, 1979).
Secara struktur, nama asetosal adalah 2-(acetyloxy)-benzoic acid.

Asam asetilsalisilat dosis rendah telah banyak digunakan sebagai agen
antiplatelet untuk pencegahan gangguan kardiovaskular, infark
miokard, dan stroke pada pasien yang berisiko tinggi terjangkit penyakit
vaskular. Di antara berbagai antiplatelet lainnya, asam asetilsalisilat
merupakan senyawa tertua, termurah, dan paling banyak beredar
sehingga menjadikannya obat standar untuk membandingkan obat
antiplatelet.
Aspilet mengandung 80mg asam asetil salisilat.

Indikasi:
Untuk menurunkan demam, meringankan sakit kepala, sakit gigi dan
nyeri otot.
Kontra Indikasi:
Penderita hipersensitif (termasuk asma). Penderita tukak lambung
(maag), pernah atau sering mengalami perdarahan di bawah kulit
(konsultasikan dengan dokter). Penderita hemofilia dan
trombositopenia, karena dapat meningkatkan risiko terjadinya
perdarahan. Penderita yang sedang terapi dengan antikoagulan
(konsultasikan dengan dokter).
Cara Kerja Obat:
Bekerja dengan mempengaruhi pusat pengatur suhu di hipotalamus
sehingga dapat menurunkan demam, dan menghambat pembentukan
prostaglandin sehingga dapat menurunkan rasa sakit.
Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari
41
sekian banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa
suatu senyawa kimia. Spektrofotometer umum digunakan karena
kemampuannya dalam menganalisa begitu banyak senyawa kimia
serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan
dengan beberapa metode analisa
Pengukuran menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis ini didasarkan

pada hubungan antara berkas radiasi elektromagnetik yang
ditransmisikan (diteruskan) atau yang diabsorpsi dengan tebalnya
cuplikan dan konsentrasi dari komponen penyerap.
Daya dari suatu berkas radiasi akan berkurang sehubungan dengan

jarak yang ditempuhnya melalui medium penyerap. Daya tersebut juga
akan berkurang sehubungan dengan kadar molekul atau ion yang
terserap dalam medium tersebut. Kedua faktor tersebut menentukan
proporsi dari kejadian total energi yang timbul. Penurunan daya radiasi
monokromatis yang melalui medium penyerap yang homogen
dinyatakan secara kuantitatif oleh Hukum Lambeer-Beer.
Log 10 (1/T) = A = abc
Istilah tersebut didefinisikan sebagai berikut :

Serapan (simbol : A ) logaritma dasar 10 dari kebalikan transmitan (T)
(istilah yang digunakan sebelumnya densitas optik ; absorbansi dan
ekstingsi).
Serapan Jenis (simbol : E11 %cm ) adalah serapan dari larutan 1% zat
terlarut dalam sel dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada
panjang gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat dari
zat terlarut.
Daya serap (simbol : a ) adalah hasil bagi serapan (A) dibagi dengan
hasil perkalian kadar yang dinyatakan dalam g per liter zat (c) dan
panjang sel dalam cm (b).
A
a = -----
b c
(tidak boleh dirancukan dengan indeks absorbansi; ekstingsi spesifik

atau koefisien ekstingsi).
Daya serap molar (simbol : ε ) hasil bagi serapan (A) dengan perkalian
zat, dinyatakan dalam mol per liter, dan panjang serapan dalam cm
(istilah yang digunakan sebelumnya meliputi indeks serapan molar,
koefisien ekstingsi molar dan koefisien serapan molar). Untuk sebagian
besar sistem yang digunakan dalam spektrofotometer serapan,
serapan jenis suatu zat merupakan konstanta yang tidak tergantung
dari intensitas radiasi datang, panjang sel bagian dalam kadar, dengan
demikian kadar dapat ditetapkan secara fotometri.
Spektrum serapan suatu penampilan dalam bentuk grafik dari serapan
atau fungsi dari serapan terhadap panjang gelombang atau suatu
fungsi dari panjang gelombang.
Transmitan (simbol : T) hasil bagi daya radiasi yang ditransmisikan oleh
42
spesimen dengan daya radiasi yang jatuh pada spsimen tersebut
(istilah yang digunakan sebelumnya termasuk transmitansi dan
transmisi).
Hukum Beer tidak menunjukkan adanya pengaruh suhu, panjang

gelombang atau jenis pelarut. Untuk sebagian besar analisis pengaruh
variasi suhu yang normal dapat diabaikan. Penyimpangan dari Hukum
Beer dapat disebabkan oleh variabel kimia atau instrumen. Kegagalan
Hukum Beer dapat disebabkan oleh perubahan kadar molekul terlarut
sebagai akibat asosiasi molekul terlarut atau asosiasi antara molekul
terlarut dan molekul pelarut atau disosiasi atau ionisasi. Penyimpangan
lain dapat disebabkan oleh pengaruh instrumen seperti radiasi
polokromatis, pengaruh lebar celah atau cahaya yang menyimpang.
Bahkan pada suhu tertentu dalam pelarut yang tertentu, serapan jenis
tidak benar-benar konstan. Walaupun demikian dalam hal spesimen
hanya mempunyai satu komponen yang menyerap, tidak perlu sistem
serapan tersebut memenuhi Hukum Beer untuk digunakan dalam
analisis kuantitatif
Prosedur Nilai E11 %cm asam asetil salisilat dalam 0.1N HCl 485 pada 228nm; 65
pada 275nm
Perhitungan konsentrasi asetosal :

Pada 228nm
Nilai E11 %cm artinya pada konsentrasi sampel 1% (1g zat daam 100mL
larutan) dan tebal kuvet/panjang sampel 1cm mempunyai serapan jenis
sebesar 485
Untuk memenuhi hukum Lambert-Beer maka serapan sebaiknya pada
rentang kurang dari 2, dengan nilai optimum serapan pada 0.2-0.8
Jika demikian maka nilai E11 %cm 485 sebaiknya dibagi 1000 supaya
menjadi 0.485 dan memenuhi kaidah Lambert-Beer
Dengan asumsi tebal kuvet tetap maka, konsentrasi sampel harus pula
menjadi 10-3, sehingga :
1g 1000mg
1% = = =10000 ppm
100 mL 0.1 mL
10000ppm x 10-3 = 10ppm
Pada 275nm
Nilai E11 %cm artinya pada konsentrasi sampel 1% (1g zat daam 100mL
larutan) dan tebal kuvet/panjang sampel 1cm mempunyai serapan jenis
sebesar 65
Untuk memenuhi hukum Lambert-Beer maka serapan sebaiknya pada
rentang kurang dari 2, dengan nilai optimum serapan pada 0.2-0.8
Jika demikian maka nilai E11 %cm 65 sebaiknya dibagi 100 supaya menjadi
0.65 dan memenuhi kaidah Lambert-Beer
Dengan asumsi tebal kuvet tetap maka, konsentrasi sampel harus pula
menjadi 10-2, sehingga :
1g 1000mg
1% = = =10000 ppm
100 mL 0.1 mL
10000ppm x 10-2 = 100ppm
43
Pembuatan larutan sampel asetosal (10ppm diukur pada  228nm)
1. Mengambil sebanyak 5 tablet aspilet kemudian ditimbang pada
neraca analitik
2. Tablet digerus dengan hati-hati di atas mortar sampai homogen
3. Menimbang dengan seksama setara 50mg asetosal menggunakan
botol timbang
4. Melarutkan dengan HCl 0.1N sampai 50.0mL (larutan dengan
konsentrasi 1000ppm), dikocok kemudian disaring
5. Sebanyak 1.0mL filtrat larutan baku 1000ppm dipipet dan
dimasukkan dalam labu ukur 100.0mL
6. Larutan ditambah HCl 0.1N sampai tanda batas (diperoleh larutan
dengan konsentrasi 10ppm)
7. Prosedur no 1-6 direplikasi sampai 3kali
Pembuatan larutan sampel asetosal (100ppm diukur pada 

275nm)
neraca analitik
botol timbang
konsentrasi 1000ppm), dikocok kemudian disaring
Pembuatan larutan baku asetosal (10ppm atau 100ppm)

1. Menimbang dengan seksama 25mg standar asetosal menggunakan
botol timbang
konsentrasi 500ppm)
7. Menyiapkan larutan blanko berupa HCl 0.1N
Pengukuran max dan absorbansi larutan baku dan sampel

Sesuai dengan manual prosedur setting wavelength, measuring a
blank, measuring sample
Hasil Diketahui bahwa kandungan 1 tablet aspilet adalah 80mg asetosal,
44
sehingga dalam 5 tablet aspilet mengandung 400mg asetosal
Hasil penimbangan 5 tablet :………………..g :………………mg
…………………mg tablet setara dengan 400mg asetosal
Untuk memperoleh setara 50mg asetosal, maka :
Hasil penimbangan sampel dan perhitungan konsentrasinya:

S1 S2 S3
Wadah : Wadah : Wadah :
Wadah+zat : Wadah+zat : Wadah+zat :
Zat : Zat : Zat :
Kesetaraan zat aktif Kesetaraan zat aktif Kesetaraan zat aktif
Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel
Perencanaan konsentrasi larutan baku

Hasil penimbangan baku :…………….g :…………………..mg
Konsentrasi larutan baku :
Pengamatan max dengan menggunakan baku kerja……ppm

 (nm) %T A
Pengamatan serapan larutan baku dan sampel pada max……….nm

Konsentras
Laruta
i %T A
n
(ppm)
Baku
45
S1
S2
S3
Kadar sampel :
S1 :
S2 :
S3 :
Pembahasan
46
Kesimpulan
47
Topik 3 Penetapan Kadar Asetosal dalam Tablet Aspilet secara
Spektrofotomeri UV
(dengan kurva baku standar)
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar asetosal

secara spektrofotometri UV dengan kurva baku standar
2. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar asetosal secara
spektrofotometri UV dengan kurva baku
Ringkasan Asam asetilsalisilat mempunyai nama sinonim asetosal, asam salisilat

Teori asetat dan yang paling terkenal adalah aspirin. Serbuk asam asetil
salisilat dari tidak berwarna atau kristal putih atau serbuk granul kristal
yang berwarna putih. Nilai titik lebur dari asam asetil salisilat adalah
135oC. Asam asetilsalisilat larut dalam air (1:300), etanol (1:5),
kloroform (1:17) dan eter (1:10-15), Asam asetilsalilsilat larut dalam
larutan hidroksida dan karbonat (Dirjen POM, 1979).
Secara struktur, nama asetosal adalah 2-(acetyloxy)-benzoic acid.

Asam asetilsalisilat dosis rendah telah banyak digunakan sebagai agen
antiplatelet untuk pencegahan gangguan kardiovaskular, infark
miokard, dan stroke pada pasien yang berisiko tinggi terjangkit penyakit
vaskular. Di antara berbagai antiplatelet lainnya, asam asetilsalisilat
merupakan senyawa tertua, termurah, dan paling banyak beredar
sehingga menjadikannya obat standar untuk membandingkan obat
antiplatelet.
Aspilet mengandung 80mg asam asetil salisilat.

Indikasi:
Untuk menurunkan demam, meringankan sakit kepala, sakit gigi dan
nyeri otot.
Kontra Indikasi:
Penderita hipersensitif (termasuk asma). Penderita tukak lambung
(maag), pernah atau sering mengalami perdarahan di bawah kulit
(konsultasikan dengan dokter). Penderita hemofilia dan
trombositopenia, karena dapat meningkatkan risiko terjadinya
perdarahan. Penderita yang sedang terapi dengan antikoagulan
(konsultasikan dengan dokter).
Cara Kerja Obat:
Bekerja dengan mempengaruhi pusat pengatur suhu di hipotalamus
sehingga dapat menurunkan demam, dan menghambat pembentukan
prostaglandin sehingga dapat menurunkan rasa sakit.
Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari

sekian banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa
48
suatu senyawa kimia. Spektrofotometer umum digunakan karena
kemampuannya dalam menganalisa begitu banyak senyawa kimia
serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan
dengan beberapa metode analisa

cuplikan dan konsentrasi dari komponen penyerap. Berdasarkan hal
inilah maka untuk dapat mengetahui konsentrasi sampel berdasarkan
data serapan (A) sampel, perlu dibuat suatu kurva kalibrasi yang
menyatakan hubungan antara berkas radiasi yang diabsorpsi (A)
dengan konsentrasi (C) dari serangkaian zat standar yang telah
diketahui. Beberapa metode analitik telah dilakukan untuk menentukan
kadar asetosal dalam tablet (Gandhi et al.,2003) menggunakan teknik
analisis
(Harris, 2003).
Metode analisis kuantitatif yang umum digunakan untuk mengukur

unsur dengan spektrofotometer adalah teknik kurva kalibrasi. Sederet
konsentrasi larutan baku atau standar dibuat untuk kurva kalibarasi.
Serapan sampel dan standar kemudian diukur dengan spektrofotometri.
Konsentrasi sampel dihitung dengan persamaan regersi linier dengan
mengubungkan nilai konsentrasi sebagai sumbu dan serapan sebagai
sumbu y.
Prosedur ASETOSAL
(tab.)
Pustaka : MA. PPOM. (20/OB/93)
Syarat : 95,0 – 105,0%
Prosedur :
- Setara 50 mg Asetosal + Ethanol absolut ad 50,0
ml. kocok, saring.
- 5,0 ml filtrat + Ethanol absolut ad 100,0 ml.
- Amati pada 275 nm.
Perhitungan konsentrasi sampel asetosal

50 mg 50 mg
= =1000 ppm
50 mL 0.05 L
5 mL
× 1000 ppm=50 ppm
100 mL
Pembuatan larutan sampel Asetosal (tablet aspilet)

neraca analitik
49
botol timbang
4. Melarutkan dengan etanol 96% sampai 50.0mL (larutan dengan
konsentrasi 1000ppm), dikocok dan disaring
5. Sebanyak 5.0mL filtrate larutan baku 1000ppm dipipet dan
6. Larutan ditambah etanol 96% sampai tanda batas (diperoleh larutan
8. Menyiapkan larutan blanko berupa etanol 96%
Pembuatan larutan baku induk dan kerja asetosal (250-500ppm)

1. Menimbang dengan seksama 25-50mg standar asetosal
2. Melarutkan dengan etanol 96% sampai volume yang diinginkan
(larutan dengan konsentrasi 250-500ppm)
3. Dilakukan pengenceran sehingga diperoleh minimal 5 seri
konsentrasi baku kerja
Pengukuran max dan absorbansi larutan baku dan sampel

Hasil Diketahui bahwa kandungan 1 tablet aspilet adalah 80mg asetosal,

sehingga dalam 5 tablet aspilet mengandung 400mg asetosal
…………………mg tablet setara dengan 400mg asetosal
Untuk memperoleh setara 50mg asetosal, maka :

S1 S2 S3
Zat : Zat : Zat :
50
Perencanaan konsentrasi baku induk dan kerja
Baku induk konsentrasi :………….ppm
Deret konsentrasi baku kerja
Hasil penimbangan standar :………….g :…………mg

Konsentrasi baku induk :
Konsentrasi baku kerja :

 (nm) %T A
Pengamatan serapan baku kerja dan sampel pada max……….nm

51
Konsentras Konsentrasi sbg x
i %T A dan A sbg y
(ppm)
a:
b:
Baku r:
kerja persamaan linier
S1 x^ =
S2 ^x =
S3 ^x =
Kadar sampel :
S1 :
S2 :
S3 :
Pembahasan
52
Kesimpulan
53
Topik 4 Penetapan Kadar Vitamin C dalam Tablet secara Spektrofotomeri UV
(dengan A-T komparatif)
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar vitamin C

secara spektrofotometri UV dengan A-T komparatif
2. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar vitamin C
secara spektrofotometri UV dengan A-T komparatif
Ringkasan Vitamin C adalah salah satu zat gizi yang berperan sebagai antioksidan
Teori dan efektif mengatasi radikal bebas yang dapat merusak sel atau
jaringan, termasuk melindungi lensa dari kerusakan oksidatif yang
ditimbulkan oleh radiasi. Status vitamin C seseorang sangat tergantung
dari usia, jenis kelamin, asupan vitamin C harian, kemampuan absorpsi
dan ekskresi, serta adanya penyakit tertentu. Rendahnya asupan serat
dapat mempengaruhi asupan vitamin C karena bahan makanan
sumber serat dan buah-buahan juga merupakan sumber vitamin C.
Dosis Vitamin C
Dosis vitamin C yang dikonsumsi harus disesuaikan dengan kondisi.
Untuk mengatasi defisiensi vitamin C, dosis biasanya berkisar antara
25-300 mg per hari. Sedangkan untuk mencegah defisiensi vitamin C,
dosis biasanya berkisar antara 25-75 mg per hari.
Interaksi obat
Vitamin C dengan dosis yang tinggi bisa menimbulkan suatu reaksi jika
dikonsumsi bersamaan dengan obat-obatan tertentu, di antaranya:
 Obat-obatan pengencer darah, seperti aspirin, warfarin, kumarin
dan clopidogrel. Vitamin C menyebabkan efek pengencer darah
berkurang.
 Paracetamol. Menyebabkan efek pereda nyeri berkurang.
 Obat-obatan untuk kanker, asma, gangguan jantung, paru-paru,
usus, gigi, mata, kulit, dan produk yang mengandung nikotin.
 Aspirin, menurunkan penyerapan vitamin C oleh tubuh dan
meningkatkan pembuangan vitamin C dari tubuh.
 Kontrasepsi oral (pil KB) dan fluphenazine dalam darah. Vitamin
C dapat menurunkan kadar obat-obatan tersebut di dalam darah.
 Desferrioxamine. Memperburuk efek toksisitas zat besi terhadap
jantung.
 Karena vitamin C mempengaruhi kadar gula darah dan tekanan
darah, disarankan agar orang yang sedang dalam pengobatan
diabetes atau hipertensi untuk berkonsultasi dengan dokter,
guna penyesuaian dosis terapi.
 Jika dikonsumsi bersamaan dengan obat herbal dan suplemen,
vitamin C dengan dosis tinggi juga bisa menimbulkan suatu
reaksi yang berbeda-beda.
Vitamin C atau asam askorbat mempunyai rumus molekul C 6H8O6,

dengan rumus struktur
54
Ada beberapa metode yang dikembangkan untuk penentuan kadar
vitamin C diantaranya adalah metode spektrofotometri UV-Vis dan
metode iodimetri. Metode spektrofotometri dapat digunakan untuk
penetapan kadar campuran dengan spektrum yang tumpang tindih
tanpa pemisahan terlebih dahulu. Karena perangkat lunaknya mudah
digunakan untuk instrumentasi analisis dan mikrokomputer,
spektrofotometri banyak digunakan di berbagai bidang analisis kimia
terutama farmasi.

cuplikan dan konsentrasi dari komponen penyerap. Berdasarkan hal
inilah maka untuk dapat mengetahui konsentrasi sampel berdasarkan
data serapan (A) sampel, yang menyatakan hubungan antara berkas
radiasi yang diabsorpsi (A) dengan konsentrasi (C) dari zat standar
yang telah diketahui.
Salah satu etode analisis kuantitatif yang umum digunakan untuk

mengukur konsentrasi dengan spektrofotometer adalah teknik A-T
komparatif. Teknik ini dilakukan dengan membandingkan absorban
atau persen transmitan zat yang dianalisis dengan reference standard
55
pada panjang gelombang maksimal.
A(S). C(S)= A(R.S). C(R.S)
Dimana :
A(S)= absorban larutan sample
C(S)= konsentrasi larutan sample
A(R.S)= absorban reference standard
C(R.S)= kosentrasi larutan reference standard
Prosedur Pembuatan larutan sampel vitamin C (10ppm)

1. Mengambil sebanyak 5 tablet vitamin C kemudian ditimbang pada
neraca analitik
3. Menimbang dengan seksama setara 50mg vitamin C menggunakan
botol timbang
4. Melarutkan dengan air sampai 50.0mL (larutan dengan konsentrasi
1000ppm), dikocok kemudian disaring
konsentrasi 10ppm)
Pembuatan larutan baku asam askorbat (10ppm atau 100ppm)

1. Menimbang dengan seksama 25mg standar asam askorbat
2. Melarutkan dengan aquadest sampai 50.0mL (larutan dengan
konsentrasi 500ppm)
4. Larutan ditambah aquadest sampai tanda batas (diperoleh larutan
Pengukuran max (265nm) dan absorbansi larutan baku dan

sampel
Hasil Diketahui bahwa kandungan 1 tablet vitamin C adalah 50mg asam

askorbat, sehingga dalam 5 tablet vitamin C mengandung 250mg asam
askorbat
…………………mg tablet setara dengan 250mg asam askorbat
Untuk memperoleh setara 50mg asam askorbat, maka :
56
S1 S2 S3
Zat : Zat : Zat :
Perencanaan konsentrasi larutan baku

Hasil penimbangan baku :…………….g :…………………..mg

 (nm) %T A
57
Pengamatan serapan larutan baku dan sampel pada max……….nm
Konsentras
Laruta
i %T A
n
(ppm)
Baku
S1
S2
S3
Kadar sampel :
S1 :
S2 :
S3 :
Pembahasan
58
Kesimpulan
59
Topik 5 Penetapan Kadar Vitamin C dalam Minuman secara Spektrofotomeri
Vis dengan reagen 2,6 D
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar vitamin C

secara spektrofotometri Vis dengan reagen 2,6D
2. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar vitamin C
secara spektrofotometri Vis dengan reagen 2,6D
Ringkasan Vitamin C disebut pula asam askorbat karena tanpa adanya vitamin C
Teori dalam tubuh akan menimbulkan skorbut, yaitu perubahan patologis
pada gigi dan gusi. Vitamin ini memiliki berat molekul 176 dan rumus
molekul C6H8O6. Vitamin C dalam bentuk kristal tidak berwarna, dengan
titik cair pada suhu 190-192oC. Sifat asam ditentukan oleh ionisasi enol-
group pada atom C nomor tiga. Pada pH rendah vitamin C lebih stabil
daripada pada keadaan dengan pH tinggi. Vitamin C cukup stabil pada
pH 4-6 dan dapat disintesa dari D-glukosa.
Metode yang dapat digunakan untuk mengukur kadar vitamin c yaitu

dengan cara titrasi maupun spektrofotometri menggunakan larutan 2,6-
Dichloroindophenol. Metode ini diperkenalkan oleh Tillmanss pada
tahun 1930. Larutan 2.6 D akan direduksi oleh L-asam askorbat
sehingga warna larutan semula akan berubah membentuk dye. Dye
akan berubah warna menjadi pink (jika kondisinya asam) dan berwarna
biru jika kondisinya basa, terbentuknya warna menandai berakhirnya
titrasi. Penentuan vit C dengan menggunakan 2,6 D mempunyai
kelemahan, metode ini hanya bisa mendeteksi adanya L- asam
askorbat, namun tidak bisa mendeteksi adanya asam L-
dehidroaskorbat yang mana masih memilki 80% kemampuan asam
askorbat.
Pemilihan metode titrasi 2,6 D (2,6 Na-diklorofenol indofenol) ini

dikarenakan metode 2,6 D merupakan metode yang banyak digunakan
dan lebih baik bila dibandingkan dengan metode iodimetri karena
larutan 2,6-diklorofenol indofenol hanya dapat tereduksi dengan
Vitamin C saja sehingga dapat terjadi perubahan warna. Larutan 2,6D
dalam suasana netral akan berwarna biru dan dalam suasana asam
akan berwarna merah muda. Sedangkan apabila menggunakan
metode titrasi iodimetri maka tidak hanya Vitamin C saja dalam suatu
bahan pangan yang dapat mereduksi akan tetapi terdapat komponen
lain yang dapat ikut mereduksi seperti gula fruktosa, sehingga dapat
memepengaruhi hasil pengamatan. Pada saat proses titrasi 2,6D di
reduksi oleh asam askorbat maka akan menjadi terjadi tidak berwarna,
dan bila semua asam askorbat sudah mereduksi 2,6D maka kelebihan
larutan 2,6D sedikit saja sudah akan terlihat dengan terjadinya
pewarnaan.
Perlakuan dilakukan dengan cepat karena banyak faktor yang

menyebabkan oksidasi vitamin C misalnya pada saat penyiapan
sampel atau penggilingan. Oksidasi ini dapat dicegah dengan
menggunakan asam metafosfat, asam asetat, asam trikloroasetat, dan
60
asam oksalat sebagai pengekstraksi. Pengukuran harus selesai dalam
waktu 2 menit. Suasana larutan yang asam akan memberikan hasil
yang lebih akurat dibandingkan dalam suasana netral atau basa.
Penggunaan asam-asam di atas juga berguna untuk mengurangi
oksidasi vitamin C oleh enzim-enzim oksidasi yang terdapat dalam
jaringan tanaman. Selain itu, larutan asam metafosfat-asetat juga
berguna untuk pangan yang mengandung protein karena asam
metafosfat dapat memisahkan vitamin C yang terikat dengan protein.
Kadar vitamin C ditetapkan berdasarkan serapan hasil reaksi dengan

2,6-diklorofenol indofenol dimana terjadi reaksi reduksi 2,6- diklorofenol
indofenol dengan adanya vitamin C dalam larutan asam. Sebagai
reduktor, asam askorbat akan mendonorkan satu elektron membentuk
semidehidroaskorbat yang tidak bersifat reaktif dan selanjutnya
mengalami reaksi disproporsionasi membentuk dehidroaskorbat yang
bersifat tidak stabil. Dehidroaskorbat akan terdegradasi membentuk
asam oksalat dan asam treonat.
Asam askorbat akan mereduksi indikator dye (2,6-diklorofenol

indofenol) dalam suatu larutan yang tidak berwarna. Serapan asam
askorbat yang terkandung dalam sampel yang telah ditambahkan dye
ditandai dengan adanya kelebilhan dye yang tidak tereduksi dan akan
merubah warna larutan menjadi warna merah muda dalam kondisi
asam.
Prosedur Pembuatan Reagen

1. Larutan Baku Vitamin C; Timbanglah dengan tepat 25mg asam
askorbat. Larutkan dalam 100mL air suling (konsentrasi laruan
250mg/L). Encerkan sampai diperoleh konsentrasi 10mg/L
(10µg/mL). Simpan dalam botol gelap ditempat yang dingin. Larutan
ini sangat tidak stabil dan harus dibuat segar.
2. Larutan Asam Metafosfat 3%; Pipet kira-kira 6-7.5mL asam
metafosfat kemdian laruttkan sampai 100mL dengan air suling.
Simpanlah dalam lemari pendingin selama 8 hari.
3. Larutan Natrium sitrat dihidrat 4.5%; Larutkan 4.5g natrium sitrat
dihidrat, kemudian tambahkan 100L air suling.
4. Larutan 2,6D ; Timbanglah dengan tepat 50mg asam askorbat.
Larutkan dalam 50mL air suling. Simpan dalam botol gelap ditempat
yang dingin. Simpanlah dalam lemari pendingin selama 7 hari.
Prosedur Pengujian
1. Tambahkan 3mL asam metafosfat ke dalam 2mg sampel. Campur
baik-baik, saring, disentrifuge dulu bila diperlukan, lalu filtrate
dipisahkan.
2. Siapkan 3 tabung untuk pemeriksaan sebuah sampel. Tabung 1
untuk blanko, tabung 2 untuk standar dan tabung 3 untuk sampel.
3. Ke dalam tabung 1, masukkan 1.2mL asam metafosfat, 0.8mL air
bebas mineral, 0.5mL natrium sitrat dihidrat lalu kocok.
4. Ke dalam tabung 2, masukkan 2mL larutan baku vitamin C
(mengandung 20µg asam askorbat) dan 0.5mL natrium sitrat
61
dihidrat lalu kocok.
5. Ke dalam tabung 3, masukkan sampel yang sudah dipreparasi dan
0.5mL natrium sitrat dihidrat lalu kocok
6. Ke dalam masing-masing tabung, ditambahkan seksama 1mL
reagen 2,6D, kocok sampai homogen.
7. Cepat-cepat dilakukan pembacaan serapan pada spektrofotometer
pada max 520nm. Pembacaan dilakukan 30detik setelah
pemberian reagen 2,6D. Misal hasil serapan sebagai berikut :
Absorbansi blanko : Ab
Absorbansi standar : ASt
Absorbansi sampel : ASp
8. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan 0.5mL larutan baku
vitamin C untuk meghilangkan warna dye yang berlebihan. Kocok
baik-baik, kemudian baca lagi absoransinya. Misal hasil serapan
sebagai berikut :
Absorbansi blanko : Abb

Absorbansi standar : AStb
Absorbansi sampel : ASpb
Perhitungan :
mg vitamin C dalam 100mmg sampel :
( Ab−Abb ) −( ASp− ASpb) 100 mg
×0.02 × sampel
( Ab− Abb )−(ASt − ASb) 100 mg
( Ab−Abb ) −( ASp− ASpb) 2 mg

× sampel
( Ab− Abb )−(ASt − ASb) 100 mg

sampel
Hasil Hasil penimbangan baku vitamin C :…………………g :

…………………….mg
Hasil pengamatan serapan pada max 520nm

Sebelum Sesudah
Larutan %T A Larutan %T A
Blanko Blanko
(Ab) (Abb)
Standar Standar
62
(ASt) (AStb)
Sampel Sampel
(Asp) (Aspb)
Kadar Sampel :
Pembahasan
63
Kesimpulan
Topik 6 Penetapan Kadar Phospat dalam Air secara Spektofotometri Vis

dengan Reagen Molibdat
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar phospat

dalam air secara Spektrofotometri Vis dengan reagen molibdat
2. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar phospat dalam
air secara Spektrofotometri Vis dengan reagen molibdat
Ringkasan Fosfat adalah senyawa fosfor yang anionnya mempunyai atom fosfor
Teori yang dilengkapi dengan empat aom oksigen yang terletak pada sudut
tetrahedron. Fosfat total dapat diukur langsung dengan cara
kolorimeter, dengan melalui proses digesti lebih dahulu sebelum
pengukuran sampel.
Secara umum ada 3 jenis asam fosfat yang dikenal, antara lain :
1) Asam ortofosfat (H3PO4)
2) Asam pirofosfat (H4P2O7)
3) Asam metafosfat (HPO3)
Ortofosfat adalah bentuk yang paling stabil dan paling penting, lebih
sering disebut dengan fosfat saja. Larutan pirofosfat dan metafosfat
berubah menjadi ortofosfat perlahan-lahan dalam suhu ruang, dan lebih
64
cepat dengan adanya pemanasan.
Setiap senyawa fosfat terdapat dalam bentuk terlarut, tersuspensi atau

terikat dalam sel organisme dalam air. Dalam air limbah senyawa fosfat
dapat berasal dari limba penduduk, indusri dan pertanian. Di pertanian,
ortofosfat berasal dari bahan pupuk yang masuk ke sungai melalui
drainase dan air hujan. Polifosfat dapat masuk ke aliran sungai melalui
buangan penduduk dan industry yang menggunakan bahan deterjen
yang mengandung fosfat, seperti industry pencucian, logam dsb.
Macam-macam jenis fosfat juga dipakai dalam pengolahan antikarat
dan antikerak pada pemanasan air.
Pemeriksaan kuantitatif untuk fosfat dilakukan secara spektrofotometri

sinar tampak dengan menggunakan reagen amonium molibdat, asam
sulfat pekat, asam askorbat dan timah klorida yang membentuk larutan
biru dan dapat diukur pada panjang gelombang maksimal 700nm.
Secara garis besar fosfat bereaksi dengan ammonium molibdat
membentuk asa fosfomolibdat yang bila tereduksi oleh timah klorida
akan berwarna biru, yang intensitasnya berbanding lurus dengan
jumlah fosfat yang ada. Dalam medium asam, ortofosfat membentuk
kompleks kuning dengan ion molibdat. Dengan adanya asam askorbat
dan timah klorida, kompleks fosfomolibdat yang berwarna biru
terbentuk. Warna biru dapat bervariasi tergantung dari kondisi redoks
dan pH.
Intensitas warna hasil reaksi diukur berdasarkan teori hubungan

serapan kekuatan warna, sebagai berikut :
Prosedur Pembuatan Reagen

1. Larutan Induk Fosfat ; Timbanglah dengan tepat 0,7164 gram
kalium hydrogen fosfat (KH2PO4). Larutkan dalam 1 liter air suling.
Simpan dalam botol gelap ditempat yang dingin.
2. Larutan Standar Fosfat; Encerkan 10 ml larutan induk fosfat menjadi
100 ml dengan air suling . Sebanyak 1 ml larutan ini mengandung
0,05 mg fosfor.
3. Larutan Amonium Molibdat; Larutkan 6,25 gram ammonium
molibdat dalam sekitar 100 ml air suling. Dalam bejana yang
65
terpisah, ambillah 100 ml air suling dan tambahkan kepadanya
secara bertahap 20 – 75 ml asam sulfat pekar. Biarkan benjana
dingin selama penambahan asam keair. Tambahkan asam sulfat
encer kepada larutan ammonium molibdat. Buatlah menjadi 250 ml
dengan air suling. Simpanlah dalam tempat yang gelap dan dingin.
4. Larutan Timah Klorida 0,25 %; Larutkan 0,25 gram timah klorida
dalam 1 ml asam klorida pekat. Tambahkan 100 ml air suling untuk
melarutkan timah klorida secara sempurna. Larutan ini sangat tidak
stabil dan harus dibuat segar sesering mungkin.
5. Asam Sulfat ; Tambahkan secara hati-hati 120 ml asam sulfat pekat
kepada 750 ml air suling dalam tabung volumetric 1 liter. Biarkan
tabung dingin selama penambahan asam. Buatlah larutan menjadi 1
liter dengan air suling.
Pembuatan Kurva Standar

1. Pipetlah dalam tabung-tabung penguji yang terpisah : 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ;
0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 dan 1 ml larutan fosfor standar.
2. Buatlah larutan dalam setiap tabung menjadi 2 ml dengan
penambahan air suling.
3. Kepada setiap tabung tambahkan 1 ml amonium molibdat dan 0,4
ml larutan timah klorida 0,25 %. Jagalah suhu tabung antara 20 –
300C selama penambahan pereaksi.
4. Campulah dengan baik dan Diamkan. Warna biru akan muncul
dalam waktu kira-kira 15 menit.
5. Buatlah blanko pereaksi dengan menggunakan 2 ml air suling
sebagai ganti larutan standar.
6. Buatlah kurva standar yang menghubungkan konsentrasi fosfat
dalam standar terhadap serapannya.
Preparasi sampel
1. Ambillah 2 ml larutan sampel yang jernih dalam tabung pengujian.
2. Bila ada warna timbul hilangkan dengan penambahan 1 atau 2
tetes asam sulfat.
3. Tambahkan 1 ml larutan ammonium molibdat dan 0,4 ml larutan
timah klorida 0,25 %. Jagalah suhu antara 20 – 30 oC dalam tabung.
Biarkan selama 15 menit.
4. Perlakuan direplikasi sebanyak 3 kali.
5. Tentukan jumlah fosfat yang ada dari kurva standar.

sampel
Hasil Larutan induk fosfat

Hasil penimbangan :……………………..g :……………………mg
Konsentrasi larutan induk :
66
Konsentrasi larutan standar fosfat :
Konsentrasi larutan kurva standar :

 (nm) %T A

i %T A dan A sbg y
(ppm)
Baku a:
67
b:
r:
persamaan linier
kerja
S1 x^ =
S2 ^x =
S3 ^x =
Kadar sampel
Pembahasan
68
Kesimpulan
69
Topik 7 Penetapan Kadar Silika dalam Air secara Spektofotometri Vis dengan
Reagen Molibdat
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar silika

dalam air secara Spektrofotometri Vis dengan reagen molibdat
2. Mahasiswa mampu melakukan penetapan kadar silika dalam air
secara Spektrofotometri Vis dengan reagen molibdat
Ringkasan Silikon (Si) tidak terdapat bebas di alam, melainkan sebagai silikat
Teori (SiO2) dalam bentuk kristal kasar (kuarsa, batu kristal, amethyst, dan
lain-lain) dan mikrokristal kuarsa (flint, chert, jasper, dan lain-lain) yang
merupakan komponen utama penyusun pasir dan batu pasir. Si
ditemukan dalam bentuk kombinasi dengan unsur-unsur lain dalam
silikat seperti feldspar, hornblende, mika, asbes, dan mineral liat
lainnya. Silikat juga terikat pada batu seperti granit, basalt, dan shale.
Dalam analisis sedimen, tanah, dan air, Si umumnya dilaporkan
sebagai SiO2. Kelimpahan silika pada batuan bervariasi mulai dari 7-80
%, di tanah 50-80 %, dan pada air permukaan atau air tanah
kelimpahan silika mencapai 14 mg/L.
Silika terlarut umumnya dalam bentuk H 4SiO4 dan H3SiO4-. Garam

tersebut dapat bereaksi dengan magnesium (Mg) membentuk endapan
pada mesin boiler atau turbin uap. Silika merupakan unsur yang tidak
terlalu penting bagi tanaman tetapi sangat penting bagi sebagian besar
hewan. Paparan kronis debu silika sangat beracun bagi tubuh. US EPA
mensyaratkan agar air minum tidak boleh mengandung silika.
Prosedur ini memberikan penjelasan mengenai analisis silika

menggunakan amonium molibdat. Metode ini direkomendasikan untuk
air murni/perairan alami yang mengandung 0,4-25 mgSiO 2/L. Rentang
metode dapat diperluas dengan menggunakan teknik pengenceran
sampel atau penggunaan kuvet yang lebih besar.
Metode analisis ini cukup sederhana dan cepat, namun, warna kuning
yang dihasilkan dari metode ini memiliki stabilitas yang rendah. Metode
ini juga dipengaruhi oleh gangguan tanin, warna, dan kekeruhan.
Amonium molibdat pada pH 1,2 bereaksi dengan silika dan fosfat

membentuk asam heteropoli (asam molibdofosfat dan asam
molibdosilikat). Penambahan asam oksalat dapat menghancurkan
senyawa asam molibdofosfat dan tidak menghancurkan asam
molibdosilikat. Intensitas warna kuning yang terbentuk berbanding lurus
dengan konsentrasi molibdosilikat reaktif. Untuk mengubah
70
molibdosilikat tidak reaktif membentuk molibdosilikat reaktif dapat
dilakukan dengan teknik pemanasan menggunakan NaHCO 3 atau
oksidasi menggunakan senyawa alkali.
Metode ini menganjurkan untuk menggunakan alat dan bahan yang

tidak mengandung silica. Metode ini menyarankan untuk melakukan
analisis blanko sebagai kontrol silika. Gangguan fosfat, tanin, sulfida,
dan besi dapat dihilangkan dengan penambahan asam oksalat.
Gangguan warna dan kekeruhan dapat dihilangkan dengan
penyaringan atau analisis background. Analisis background dapat
dilakukan dengan jalan menyiapkan satu wadah berisi sampel yang
ditambahkan pereaksi HCl dan asam oksalat tetapi tidak ditambahkan
amonium molibdat. Larutan ini digunakan untuk mengkalibrasi
(mengenolkan) spektrofotometer.
Intensitas warna hasil reaksi diukur berdasarkan teori hubungan

serapan kekuatan warna, sebagai berikut :
Prosedur Natri Pembuatan Reagen

1. Natrium Bikarbonat (NaHCO3)
2. Asam Sulfat (H2SO4 0.1N)
3. Asam Askorbat
Ditimbang 1.76 gram asam askorbat kemudian dilarutkan dalam
100mL air suling. Larutan harus dibuat segar sesaa sebelum
digunakan untuk analisis.
4. Amonium Molibdat
Ditimbang 1 gram (NH4)6Mo7O24 .4H2O kemudian dilarutkan
sampai 100mL dengan asam sulfat 0.1N. Proses pelarutan dapat
dibantu dengan menggunakan magnetic stirer, pemanasan (suhu
rendah), atau penyaringan. pH larutan diatur 7-8 dengan larutan
NH4OH atau NaOH bebas silika. Larutan dapat disimpan dalam
botol plastic selama 2 minggu.
5. Asam Oksalat
Ditimbang 5 gram H2C2O4 .H2O kemudian dilarutkan sampai
100mL dengan air suling. Larutan dihomogenkan dan disimpan
71
dalam botol plastic selama 3 bulan.
6. Larutan Stok Silika (1000 mgSiO 2/L)
Ditimbang 4,73 gram natrium metasilikat nonahidrat
(Na2SiO3 9H2O) kemudian dilarutkan sampai 1000mL dengan air
suling. Larutan dihomogenkan dan disimpan dalam botol plastik.
7. Larutan Standar Silika (10 mgSiO 2/L)
Dipipet 10mL larutan stok kemudian diencerkan hinggan 1000 mL
dengan air suling. Larutan dihomogenkan dan disimpan dalam
botol plastik.
8. Larutan Kerja
Dipipet 0 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; dan 50 mL larutan standar
silika 10 mgSiO2/L kemudian dimasukan ke dalam labu takar 100
mL. Diencerkan dengan air suling hingga tanda tera kemudian
dihomogenkan. Konsentrasi dari larutan tersebut adalah 0
mgSiO2/L, 0,5 mgSiO2/L, 1 mgSiO2/L, 2 mgSiO2/L, dan 5
mgSiO2/L.
Pembuatan Kurva Standar

1. Pipetlah dalam tabung-tabung penguji masing-masin 2mL lartan
standar
2. Kepada setiap tabung tambahkan 2.5mL amonium molibdat
kemudian kocok dengan vortex mixer
3. Tambahkan 1.8mL asam oksalat kemudian kocok campuran
4. Tambahkan 2.5mL asam askorbat, kocok sampai homogen, biarkan
selama 2 menit
5. Segera ukur serapan larutan pada panjang gelombang 660nm.
Larutan tidak boleh dibiarkan lama selama 15menit, karena warna
yang tidak stabil.
6. Buatlah blanko pereaksi dengan menggunakan 2 ml air suling
sebagai ganti larutan standar.
7. Buatlah kurva standar yang menghubungkan konsentrasi silika
dalam standar terhadap serapannya
Preparasi sampel
1. Pipetlah dalam tabung-tabung penguji masing-masin 2mL larutan
standar
2. Kepada setiap tabung tambahkan 2.5mL amonium molibdat
kemudian kocok dengan vortex mixer
3. Tambahkan 1.8mL asam oksalat kemudian kocok campuran
4. Tambahkan 2.5mL asam askorbat, kocok sampai homogen, biarkan
selama 2 menit
5. Segera ukur serapan larutan pada panjang gelombang 660nm.
Larutan tidak boleh dibiarkan lama selama 15menit, karena warna
yang tidak stabil.
6. Perlakuan direplikasi sebanyak 3 kali.
7. Tentukan jumlah silika yang ada dari kurva standar.

sampel
72
Hasil Larutan induk silica

Konsentrasi larutan standar silika :

 (nm) %T A

i %T A dan A sbg y
(ppm)
a:
b:
Baku r:
S1 x^ =
S2 ^x =
S3 ^x =
Kadar sampel
73
Pembahasan
74
Kesimpulan
75
Topik 8 Penentuan Kadar Fenolik Total pada Teh secara Spektrofotometri Vis
dengan Reagen Folin Ciocalteu
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penentuan kadar fenolik

total pada teh secara spektrofotometri vis dengan reagen folin
ciocalteu
2. Mahasiswa mampu melakukan penentuan kadar fenolik total
pada teh secara spektrofotometri vis dengan reagen folin
ciocalteu
Ringkasan Teh merupakan minuman yang dihasilkan dari pucuk daun tanaman
Teori Camellia sinensis. Saat ini, teh telah menjadi salah satu minuman
fungsional yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat Asia termasuk
Indonesia. Teh merupakan minuman fungsional karena kandungan
komponen bioaktif dalam teh, seperti polifenol yang berfungsi sebagai
antioksidan. Secara umum dikenal dua jenis teh berdasarkan ada
tidaknya fermentasi pada proses pembuatan teh yaitu teh hitam dan teh
hijau. Teh hitam adalah teh yang proses pembuatannya melalui proses
fermentasi, yaitu proses oksidasi enzimatis katekin oleh polifenol
oksidase. Sedangkan teh hijau adalah teh yang proses pembuatannya
tidak melalui proses fermentasi. Hal ini mengakibatkan senyawa
katekin yang merupakan antioksidan tidak dioksidasi oleh polifenol
oksidase.
Teh dilaporkan mengandung hampir 4000 senyawa bioaktif yang

sepertiganya berupa polifenol. Polifenol dapat berupa flavonoid atau
non-flavonoid, namun kebanyakan polifenol yang dikandung teh berupa
flavonoid. Meskipun terdapat banyak flavonoid, namun mereka dapat
dikelompokkan ke dalam 6 golongan, yaitu:
1) Catechin, misalnya EGCG, EG, ECG, dan catechin
2) Flavonols, misalnya Kaempferol dan Quercetin
3) Anthocyanidin, misalnya Malvidin, Cyanidin, dan Delphinidin
4) Flavones, misalnya Apigenin dan Rutin
5) Flavonones, misalnya Myricetin
6) Isoflavonoids, misalnya Genistein dan Biochanin A.
Polifenol merupakan suatu kelompok antioksidan yang secara alami
terdapat dalam teh dan katekin termasuk salah satu antioksidan
golongan flavanol dalam teh. Senyawa katekin yang tidak terfermentasi
pada teh hijau berperan sebagai antioksidan yang mampu mencegah
maupun menghambat serangan tidak terkendali pada kelompok sel
tubuh seperti membran sel, DNA, dan lemak oleh radikal bebas dan
senyawa oksigen reaktif.
Ada 2 cara untuk menentukan kandungan fenol suatu sampel, yaitu :

1) Metode Folin Ciocalteu
Merupakan metode yang paling umum digunakan untuk
menentukan fenol total. Hasil yang didapatkan adalah estimasi
kandungan fenol total
2) Metode Kromatografi
Hasil yang adalah jenis-jenis fenol yang dikandung, kuantitas
76
masing-masing komponen dan kadar totalnya
Nilai yang didapat dari meode kromatografi biasanya lebih rendah
daripada yang diestimasi oleh metode Folin Ciocalteu. Salah satu
alasannya adalah beberapa polifenol dapat lolos dalam diterminasi oleh
kolom kromaografi. Hal ini dapat berupa senyawa-senyawa yang tidak
diketahui atau senyawa yang tidak dapat dipisahkan oleh kromatografi,
seperti polimer proantosianidin dan polifenol teroksidasi.
Metode Folin Ciocalteu mmerupakan teknik yang lebih murah dan
sederhana prosedur analisisnya. Prinsipnya adalan reduksi reagen
Folin Ciocalteu dengan gugus hidroksil fenolik yang mengghasilkan
kompleks warna biru. Intensitas warna kemudian dikuantifikasi
berdasarkan serapannya pada spektrofotometer.
Prinsip metode Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi dan reduksi

kolorimetrik untuk mengukur semua senyawa fenolik dalam sampel uji.
Pereaksi Folin Ciocalteu merupakan larutan kompleks ion polimerik
yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam
heteropolifosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat,
natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromin
(Folin dan Ciocalteu, 1944). Pada kenyataannya reagen ini
mengandung rangkaian polimerik yang memiliki bentukan umum
dengan pusat unit tetrahedral fosfat (PO 4)3- yang dikelilingi oleh
beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur tungsten
dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum.
Prinsip metode Folin-Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil.

Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), mereduksi asam
heteropoli menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten (Mo-W).
Fenolat hanya terdapat pada larutan basa, tetapi pereaksi Folin-
Ciocalteu dan produknya tidak stabil pada kondisi basa. Selama reaksi
belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin
Ciocalteu, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna
biru dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi dengan
spektrofotometer. Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat
setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin
besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat
yang akan mereduksi asam heteropoli sehingga warna biru yang
dihasilkan semakin pekat (Singleton dan Rossi, 1965).
Sebagai pembanding (standar) digunakan asam galat yang merupakan

golongan asam fenola paling sederhana. Asam galat merupakan
senyawa yang umum digunakan sebagai standar selain asam
klorogenat. Asam galat dipilih karena merupakan substansi yang stabil
dan murni, serta harga yang relative lebih murah.
77
Nilai absorbansi yang diperoleh konsentrasi larutan dimasukkanke
dalam persamaan regresi larutan standar asam galat sehingga
diperoleh kadar fenol total yang ditunjukkan dengan miligram asam
galat ekuivalen per gram sampel (mg GAE/g)
Prosedur Pembuatan Larutan Baku Asam Galat
1. Menimbang 50mg asam galat kemudian dilarukan dalam
aquadest sampai olume 100mL, sehingga diperoleh larutan
dengan konsentrasi 500mg/L (500µg/mL)
2. Melakukan pengenceran larutan sampai diperoleh seri
konsentrasi untuk kurva standar sebanyak 5 konsentrasi dengan
range 10-100mg/L
3. Masing-masing laruan standar diambil sebanyak 1mL kemudian
dicampur dengan 1mL etanol 95% dan 5mL air suling, lalu
kemudian dikocok dengan vorteks.
4. Campuran tersebut didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit
larutan ditambahkan dengan 1mL Na 2CO3 5% dan 0.5mL reagen
Folin Ciocalteu kemudian dikocok dengan vorteks.
5. Setelah itu, larutan tersebut disimpan dalam ruang gelap selama
1 jam, lalu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 725 nm. Kadar fenol ditentukan berdasarkan
persamaan kurva standar
Pembuatan Larutan Sampel

1. Melarutkan 50mg sampel dalam 2.5mL etanol 95%, kemudian
dikocok dengan vortex.
2. Larutan tersebut disentrifus dengan kecepatan putaran 4000 rpm
selama 5 menit.
3. Supernatan diambil sebanyak 1mL kemudian dicampur dengan
1mL etanol 95% dan 5mL air suling, lalu kemudian dikocok
dengan vorteks.
4. Campuran tersebut didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit
larutan ditambahkan dengan 1mL Na 2CO3 5% dan 0.5mL reagen
Folin Ciocalteu kemudian dikocok dengan vorteks.
5. Setelah itu, larutan tersebut disimpan dalam ruang gelap selama
78
1 jam, lalu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 725 nm. Kadar fenol ditentukan berdasarkan
persamaan kurva standar.
6. Perlakuan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali

sampel
Hasil Larutan baku asam galat


 (nm) %T A

i %T A dan A sbg y
(ppm)
a:
b:
Baku r:
S1 x^ =
S2 ^x =
S3 ^x =
Kadar sampel
79
Pembahasan
80
Kesimpulan
81
Topik 9 Penentuan Aktivitas Antioksidan Teh secara Spektrofoometri Vis dengan
Reagen DPPH
Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penentuan aktivitas

antioksidan teh secara spektrofoometri vis dengan reagen DPPH
2. Mahasiswa mampu melakukan penentuan aktivitas antioksidan
teh secara spektrofoometri vis dengan reagen DPPH
Ringkasan Teh merupakan minuman yang dihasilkan dari pucuk daun tanaman
Teori Camellia sinensis. Saat ini, teh telah menjadi salah satu minuman
fungsional yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat Asia termasuk
Indonesia. Teh merupakan minuman fungsional karena kandungan
komponen bioaktif dalam teh, seperti polifenol yang berfungsi sebagai
antioksidan. Secara umum dikenal dua jenis teh berdasarkan ada
tidaknya fermentasi pada proses pembuatan teh yaitu teh hitam dan teh
hijau. Teh hitam adalah teh yang proses pembuatannya melalui proses
fermentasi, yaitu proses oksidasi enzimatis katekin oleh polifenol
oksidase. Sedangkan teh hijau adalah teh yang proses pembuatannya
tidak melalui proses fermentasi. Hal ini mengakibatkan senyawa katekin
yang merupakan antioksidan tidak dioksidasi oleh polifenol oksidase.
Teh dilaporkan mengandung hampir 4000 senyawa bioaktif yang

sepertiganya berupa polifenol. Polifenol dapat berupa flavonoid atau non-
flavonoid, namun kebanyakan polifenol yang dikandung teh berupa
flavonoid. Meskipun terdapat banyak flavonoid, namun mereka dapat
dikelompokkan ke dalam 6 golongan, yaitu:
1) Catechin, misalnya EGCG, EG, ECG, dan catechin
2) Flavonols, misalnya Kaempferol dan Quercetin
3) Anthocyanidin, misalnya Malvidin, Cyanidin, dan Delphinidin
4) Flavones, misalnya Apigenin dan Rutin
5) Flavonones, misalnya Myricetin
6) Isoflavonoids, misalnya Genistein dan Biochanin A.
Polifenol merupakan suatu kelompok antioksidan yang secara alami
terdapat dalam teh dan katekin termasuk salah satu antioksidan
golongan flavanol dalam teh. Senyawa katekin yang tidak terfermentasi
pada teh hijau berperan sebagai antioksidan yang mampu mencegah
maupun menghambat serangan tidak terkendali pada kelompok sel
tubuh seperti membran sel, DNA, dan lemak oleh radikal bebas dan
senyawa oksigen reaktif
Antioksidan merupakan senyawa yang terdapat secara alami dalam

hampir semua bahan pangan. Senyawa ini berfungsi untuk melindungi
bahan pangan dari kerusakan karena terjadinya reaksi oksidasi lemak
atau minyak yang menjadikan bahan pangan berasa dan beraroma
tengik. Menurut Wildman (2001) antioksidan merupakan agen yang
dapat membatasi efek dari reaksi oksidasi dalam tubuh. Efek yang
diberikan oleh antioksidan terhadap tubuh dapat secara langsung, yaitu
dengan mereduksi radikal bebas dalam tubuh, dan secara tidak
langsung, yaitu dengan mencegah terjadinya pembentukan efek radikal.
82
Secara umum antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat
menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam
arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah
terjadinya reaksi oksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Kochhar
dan Rosseli 1990 dalam Ananda, 2009).
Antioksidan diklasifikasikan (Hudson, 1999; Shahidi, 1999; Fardiaz,
2001; Pokorny et al., 2001) :
1. Antioksidan primer bekerja sebagai pemutus reaksi berantai, bereaksi
dengan radikal lipid mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil,
dan sebagai antioksidan preventif dengan mengurangi kecepatan
reaksi inisiasi, mencegah autooksidasi lipid melalui pemberian atom
hidrogen yang cepat kepada radikal lipid. Antioksidan yang termasuk
golongan ini adalah adalah fenolik seperti butylated hydroxyanisole
(BHA), tertiary butyl hydroquinone (TBHQ), butylated hydroxytoluene
(BHT), senyawa alami flavonoid.
ROO * + e ROO - H+
ROOH
ROO*+ AH ROOH + A*
RO* + AH ROH + A*
2. Antioksidan sekunder bekerja memperlambat laju autooksidasi
melalui berbagai mekanisme yaitu melalui pengikatan ion logam,
penangkapan oksigen, penguraian hiperoksida menjadi produk non
radikal, penyerapan radiasi UV, deaktivasi singlet oksigen. Yang
termasuk golongan ini adalah asam askorbat, askorbil palmitat, asam
eritorbat, natrium eritorbat sebagai antioksidan sekunder untuk
menstabilkan produk pangan dan pakan berlemak.
Menurut Halliwel dan Gutteridge (1999) mekanisme kerja antioksidan

flavonoid meliputi :
1. Menekan pembentukan radikal bebas atau ROS (Reactive Oxigen
Species) dengan cara menghambat enzim, pengkelatan ion logam
(metal ion chelating) yang terlibat produksi radikal bebas.
2. Meredam radikal bebas (free radicals scavengers) Peroksidasi lipid
dapat dicegah pada tahap inisiasi dengan radical scavengers,
sementara reaksi propagasi dapat dicegah dengan peroxy-radical
svengers diantaranya dengan antioksidan flavonoid (Shahidi, 1999)
Radikal bebas dapat diuji dengan reagen Diphenyl Picril Hydrazil Hydrat
(DPPH) yang diamati di spektrofotometri dengan hasil akhir perhitungan
% inhibisi. (Retnowati, 2010). Untuk uji aktivitas antiradical metode yang
paling umum digunkanan adalah metode DPPH (2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil). DPPH adalah radikal bebas stabil berwarna ungu yang
digunakan secara luas untuk pengujian kemampuan penangkapan
radikal bebas dari beberapa komponen alam seperti komponen fenolik,
antosianin atau ekstrak kasar. (Rahayu,2010)
DPPH larut dalam pelarut polar seperti methanol dan etanol. Menurut
beberapa literature panjang gelombang maksimum untuk DPPH antara
lain 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm, 520 nm (Molyneux,
2004). DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) adalah radikal bebas yang stabil
berwarna ungu. Ketika direduksi oleh radikal akan berwarna kuning
83
(Gordon, 2001). (Retnowati, 2010)
Metode DPPH berfungsi untuk mengukur electron tunggal seperti

transfer hydrogen sekaligus juga untuk mengukur aktivitas
penghambatan radikal bebas. Pada uji dengan DPPH, penangkapan
radikal diikuti dengan monitoring penurunan absorbansi yang terjadi
karena reduksi oleh radikal. Sebagai akibatnya makan penambahan
senyawa yang bereaksi sebagai antiradical akan menurunkan
konsentrasi DPPH ini. adanya penurunan konsentrasi DPPH akan
menyebabkan penurunan absorbansinya dibandingkan dengan
absorbansi bebas control yang tidak diberi dengan senyawa uji yang
diduga mempunyai aktivitas antiradical (Retnowati, 2010).
Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan

tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas
DPPH. Tujuan metode ini adalah mengetahui parameter konsentrasi
yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal ini
dapat dicapai dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari
metode tersebut. DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi
dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat
berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam
suatu ekstrak.
Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan

serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan
oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya
menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.
Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH
dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan
Mohammad, 2009). Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah
digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul
sebagai penangkap radikal bebas.
Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk
pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman
(Koleva, van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash,
Rigelhof, dan Miller, 2010).
84
Prosedur Pembuatan Reagen DPPH
1. Ditimbang serbuk DPPH sebanyak 10mg
2. Dilarutkan DPPH dengan etanol dalam labu ukur ad 250 ml sehingga
diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,004%
Penentuan maksimal DPPH

1. Dipipet sebanyak 2mL larutan DPPH 0,004%
2. Dimasukkan dalam tabung reaksi
3. Ke dalamnya ditambahkan 2mL air suling
4. Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 35-37 oC
5. Diukur serapan larutan DPPH menggunakan spektrofotometri UV-Vis
pada panjang gelombang 515-520nm
Preparasi Baku Vitamin C

1. Ditimbang 25mg asam askorbat dan dilarutkan dalam air suling
sampai 100mL
2. Dilakukan pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 5-50mg/L
sebnayak 5 seri konsentrasi
Preparasi Sampel
1. Sampel ditimbang sebanyak 5g dan dimasukkan ke dalam gelas
piala.
2. Ditambahkan air suling sebanyak 100mL ditambahkan ke dalam gelas
piala tersebut.
3. Kemudian larutan dididihkan hingga volume tinggal setengahnya.
Larutan yang tersisa disaring dengan kapas tipis.
4. Filtrat ditepatkan menjadi 100mL dengan air suling, larutan yang
terbentuk disebut larutan sampel
Penentuan Aktivitas Antioksidan

1. Diambil sebanyak 2mL dari masing-masing larutan baku dan sampel
2. Dimasukkan dalam tabung reaksi
3. Ditambahkan larutan DPPH sebanyak 2mL
6. Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 35-37 oC
85
4. Diukur absorbansi dari masing-masing larutan baku dan sampel pada
panjang gelombang yang telah didapat
5. Dicatat dan dihitung absorbansi yang telah diperoleh
6. Dilakukan replikasi pada sampel sebanyak 3 kali
7. Dihitung persen aktivitas antioksidan dari masing-masing perlakuan
8. Gunakan metode kurva baku untuk menetapkan IC 50
Perhitungan :
|DPPH|−|sampel|
%inhibisi (%aktivitas antioksidan)= x100%
|DPPH|
Hasil Hasil penimbangan sampel :……………g :…………………….mg

Konsentrasi sampel :
Hasil Penimbangan baku vit C :………………g :………………..mg

Konsentrasi baku :

 (nm) %T A
86
Konsentrasi Konsentrasi sbg x
(ppm) %T A %inhibisi
dan A sbg y
a:
b:
Baku r:
S1 x^ =
S2 ^x =
S3 ^x =
Pembahasan
87
Kesimpulan
88

Modul Praktikum PR Spektrofotometri 2019

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Modul Praktikum PR Spektrofotometri 2019

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

MODUL PRAKTIKUM

AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN

RENCANA PEMBELAJARAN SEMESTER

Capaian CPL-PRODI yang dibebankan pada MK

Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan

Radiasi elektromagnetik (REM)

Suatu molekul memiliki panjang gelombang sendiri-sendiri. Panjang gelombang suatu

Pergeseran merah atau efek batokromik merupakan pergeseran serapan maksimum ke

Ada 4 cara pelaksanaan analisis kuantitatif zat tunggal yaitu :

3. Menghitung harga absorbansi larutan sample pada pelarut tertentu dan

Analisis kuantitatif campuran dua komponen merupakan teknik pengembangan analisis

Diagram sederhana dari spektrofotometer adalah sebagai berikut

Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar pengukuran panjang

Ringkasan Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau

Hasil perhitungan konsentrasi larutan sampel kloramfenikol

Pembuatan Larutan Baku Kloramfenikol

Hasil perhitungan konsentrasi larutan sampel rivanol

Pembuatan Larutan Baku Rivanol

Pengamatan max dan spectra UV-Vis

Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar asetosal

Ringkasan Asam asetilsalisilat mempunyai nama sinonim asetosal, asam salisilat

Secara struktur, nama asetosal adalah 2-(acetyloxy)-benzoic acid.

Aspilet mengandung 80mg asam asetil salisilat.

Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari

Pengukuran menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis ini didasarkan

Daya dari suatu berkas radiasi akan berkurang sehubungan dengan

Log 10 (1/T) = A = abc

Istilah tersebut didefinisikan sebagai berikut :

(tidak boleh dirancukan dengan indeks absorbansi; ekstingsi spesifik

Hukum Beer tidak menunjukkan adanya pengaruh suhu, panjang

Perhitungan konsentrasi asetosal :

Pembuatan larutan sampel asetosal (100ppm diukur pada 

Pembuatan larutan baku asetosal (10ppm atau 100ppm)

Pengukuran max dan absorbansi larutan baku dan sampel

Hasil Diketahui bahwa kandungan 1 tablet aspilet adalah 80mg asetosal,

Hasil penimbangan sampel dan perhitungan konsentrasinya:

Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel

Perencanaan konsentrasi larutan baku

Pengamatan max dengan menggunakan baku kerja……ppm

Pengamatan serapan larutan baku dan sampel pada max……….nm

Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar asetosal

Ringkasan Asam asetilsalisilat mempunyai nama sinonim asetosal, asam salisilat

Secara struktur, nama asetosal adalah 2-(acetyloxy)-benzoic acid.

Aspilet mengandung 80mg asam asetil salisilat.

Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari

Pengukuran menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis ini didasarkan

Metode analisis kuantitatif yang umum digunakan untuk mengukur

Perhitungan konsentrasi sampel asetosal

Pembuatan larutan sampel Asetosal (tablet aspilet)

Pembuatan larutan baku induk dan kerja asetosal (250-500ppm)

Pengukuran max dan absorbansi larutan baku dan sampel

Hasil Diketahui bahwa kandungan 1 tablet aspilet adalah 80mg asetosal,

Hasil penimbangan sampel dan perhitungan konsentrasinya:

Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel Konsentrasi sampel

Deret konsentrasi baku kerja

Hasil penimbangan standar :………….g :…………mg

Konsentrasi baku kerja :

Pengamatan max dengan menggunakan baku kerja……ppm

Pengamatan serapan baku kerja dan sampel pada max……….nm

Tujuan 1. Mahasiswa memahami konsep dasar penetapan kadar vitamin C

Vitamin C atau asam askorbat mempunyai rumus molekul C 6H8O6,

Pengukuran menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis ini didasarkan

Salah satu etode analisis kuantitatif yang umum digunakan untuk