Skripsi Kelor

TESIS
EFEK KOMBINASI EKSTRAK DAUN KELOR (Moringa

oleifera L.) DENGAN DOKSORUBISIN TERHADAP
PENEKANAN EKSPRESI SIKLIN D1 DAN Bcl-2
PADA SEL KANKER PAYUDARA
OLEH:
SHERLY H. HUTAGAOL
NIM. 167014003
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2018
Universitas
Universitas Sumatera
Sumatera Utara
Utara
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

Gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
SHERLY H. HUTAGAOL
NIM. 167014003
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2018
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Universitas
Sumatera Utara
Utara
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Sherly H. Hutagaol
Nomor Induk Mahasiswa : 167014003
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Efek Kombinasi Ekstrak Daun Kelor (Moringa

oleifera L.) Dengan Doksorubisin Terhadap
Penekanan Ekspresi Siklin D1 dan Bcl-2 Pada
Sel Kanker Payudara
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Komisi Penguji Tesis pada
hari kamis tanggal dua puluh tiga bulan Agustus tahun dua ribu delapan belas.
Mengesahkan:
Komisi Penguji Tesis
Ketua Komisi Penguji : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
Sekretaris Komisi Penguji : Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
Anggota Komisi Penguji : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hasibuan, S.Si., Apt.
Yuandani, M.Si., Ph.D., Apt
Universitas
Sumatera Utara
Utara
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa : Sherly H. Hutagaol
Nomor Induk Mahasiswa : 167014003
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Efek Kombinasi Ekstrak Daun Kelor (Moringa

oleifera L.) Dengan Doksorubisin Terhadap
Penekanan Ekspresi Siklin D1 dan Bcl-2 Pada
Sel Kanker Payudara
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya
sendiri, bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut
plagiat karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun
oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikian surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan dalam
keadaan sehat.
Medan, September 2018

Yang membuat pernyataan,
Sherly H. Hutagaol
NIM 167014003
Universitas
Sumatera Utara
Utara
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmatNya yang tak
terhingga sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis
dengan judul “Efek Kombinasi Ekstrak Daun Kelor (Moringa oleifera L.) Dengan
Doksorubisin Terhadap Penekanan Ekspresi Siklin D1 Dan Bcl-2 Pada Sel
Kanker Payudara”, sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Selama
menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan
dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil, untuk itu penulis
ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, SH., M.Hum., selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara yang sekaligus sebagai pembimbing yang telah menyediakan
fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi
Magister Farmasi Fakultas Farmasi serta yang membimbing, mengarahkan,
memberikan dorongan dan semangat sehingga penulis dapat menyelesaikan
penelitian dan tesis ini.
3. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., selaku Ketua Program Studi Magister
Farmasi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera.
4. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Pembimbing yang selalu
membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat sehingga
penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
5. Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hasibuan, S.Si., M.Si., Apt., dan Ibu Yuandani,
M.Si., Ph.D., Apt., sebagai penguji yang telah banyak memberikan saran dan
masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini.
6. Bapak Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt., sebagai Kepala Laboratorium
Farmakognosi beserta staf.
7. Bapak Prof. Dr. Supargiyono, DTM&H., SU, Ph.D., Sp. Park., Kepala
Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
beserta staf.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada
hentinya kepada keluarga tercinta Marnaek D.V. Pangaribuan, Cahaya dan Lukas,
yang tiada hentinya berkorban dengan tulus ikhlas bagi kesuksesan penulis. Serta
buat Bapak Denny Satria dan rekan Grace, Trinova, Cut Riska dan semua pihak
yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak membantu
dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan memberikan balasan yang berlipat
ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan,
sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir
kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu
pengetahuan khususnya bidang farmasi.
Medan, September 2018

Penulis,
Sherly H. Hutagaol
NIM 167014003
Universitas
Sumatera Utara
Utara
ABSTRAK
Penggunaan kombinasi kemoterapi, yaitu senyawa kemoprevensi

dikombinasi dengan agen kemoterapi diketahui mampu meningkatkan sensitivitas
sel kanker serta efikasi kemoterapi dan penurunan toksisitasnya terhadap jaringan
normal. Daun Moringa oleifera L. berpotensi sebagai antikanker, pada penelitian
sebelumnya ekstrak etanolnya memberi efek sinergis meningkatkan sitotoksik
doksorubisin pada sel kanker hela namun untuk kanker payudara belum
dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dari EEADK,
indeks selektivitas (IS), efek kombinasi dengan doksorubisin, mekanisme
penghambatan siklus sel, mekanisme apoptosis serta penekanan ekspresi siklin
D1 dan Bcl-2 pada sel kanker payudara.
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi bertingkat
menggunakan pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, n-heksana, etil asetat dan
etanol serta dilakukan skrining fitokimia dan karakterisasi terhadap simplisia dan
ekstrak. Ekstrak diuji sitotoksiknya terhadap sel MCF-7 dan T47D dengan
menggunakan metode kolorimetri MTT (Microculture Tetrazolium Tehnique),
mekanisme penghambatan siklus sel dan apoptosis dengan metode flowsitometri
serta penekanan ekspresi siklin D1 dan Bcl-2 dengan metode imunositokimia.
Hasil skrining fitokimia ENDK mengandung senyawa alkaloid, steroid;
EEADK mengandung flavonoid, glikosida, saponin, tanin, steroid dan EEDK
mengandung flavonoid, glikosida, tanin. Hasil uji sitotoksik EEADK pada sel
kanker payudara MCF-7 dan sel T47D memberikan nilai IC50 sebesar 149,29 ±
24,41 µg/mL dan 186,56 ± 33,09 µg/mL. Pengujian sitotoksik terhadap sel normal
(sel Vero) menunjukkan EEADK selektif terhadap sel MCF-7 dan T47D (IS > 3).
Selanjutnya kombinasi EEADK dengan doksorubisin pada sel MCF-7
memberikan efek sinergis sangat kuat dengan konsentrasi optimal EEADK-
doksorubisin yaitu 18,66 µg/mL – 1,45 µg/mL, terhadap sel T47D memberikan
efek sinergis dengan konsentrasi optimal EEADK-doksorubisin 23,32 µg/mL –
0,35 µg/mL. EEADK dan kombinasinya dengan doksorubisin dilakukan uji
penghambatan siklus sel terhadap sel MCF-7, memberikan hasil penghambatan
siklus sel pada fase G0-G1 dengan persentase berturut-turut 69,89% dan 54,48%,
sedangkan terhadap sel T47D diperoleh hasil menghambat siklus sel pada fase
G0-G1 dengan persentase 55,04% dan 54,49%, serta dapat memacu apoptosis
awal terhadap sel MCF-7 dengan persentase 20,59% dan 41,47%, terhadap sel
T47D dengan persentase 17,76% dan 7,66% dan dapat menekan ekspresi siklin
D1 dan Bcl-2.
Berdasarkan hasil tersebut maka EEADK dapat dikombinasikan dengan
doksorubisin sebagai antikanker payudara karena adanya efek sinergis dan
terjadinya penghambatan siklus sel serta pemacuan apoptosis.
Kata kunci: Daun kelor, doksorubisin, T47D, MCF-7, sitotoksik, indeks

kombinasi, indeks selektivitas, imunositokimia.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
COMBINATION EFFECT OF EXTRACT KELOR LEAVES
Moringa oleifera L.) WITH DOXORUBICIN ON DECREASE
EXPRESSION OF CYCLIN D1 AND Bcl-2 AGAINST
BREAST CANCER CELL LINES
ABSTRACT
The application of a combination chemotherapy which chemoprevention

compounds combined with chemotherapeutic agents is known to increase the
sensitivity of cancer cells and the efficacy of chemotherapy and decreased toxicity
to normal tissue. Moringa oleifera L. leaf potentially as anticancer, in previous
studies of ethanol extract gave synergistic effect of cytotoxic with doxorubicin in
hela cancer cells but for breast cancer not yet done.This study aims to determine
the cytotoxic effects of EEADK, selectivity index (SI), the effect of combination
with doxorubicin, the mechanism of cell cycle inhibition, the mechanism of
apoptosis, suppression of the expression of cyclin D1 and Bcl-2 in breast cancer
cells.
Preparation of extracts was done by graded with solvents on the level of
polarity. The solvents were n-hexane, ethyl acetate and ethanol as well as
performed phytochemical screening and characterization of simplicia and extracts.
The extract tested its cytotoxicity against MCF-7 and T47D cells using the
method of colorimetric MTT (Microculture Tetrazolium Tehnique), effects
inhibition of cell cycle and apoptosis with flowcytometry method and suppression
of cyclin D1 and Bcl-2 expression with immunocytochemistry method.
Screening phytochemical results showed NEKL contain alkaloids, steroids;
EAEKL contains flavonoids, glycosides, saponins, tannins, steroids and EEKL
containing flavonoids, glycosides, tannins. The test results of EAEKL cytotoxic
against breast cancer cells MCF-7 and T47D cells giving IC50 value of 149.29 ±
24.41 g/mL and 186.56 ± 33.09 g/mL. Tests cytotoxic against normal (Vero)
cells showed selective EAEKL against MCF-7 and T47D (SI > 3). Furthermore,
the combination of EAEKL with doxorubicin in MCF-7 cells gave a very strong
synergistic effect with an optimal concentration of EAEKL -doxorubicin at 18.66
μg/mL-1.45 μg/mL, to T47D cells gave a synergistic effect with optimum
concentrations of EAEKL -doxorubicin 23.32 μg/mL - 0.35 μg/mL. EAEKL and
its combination with doxorubicin carried out cell cycle inhibitory test against
MCF-7 cells, giving results inhibitory the cell cycle at G0-G1 phase with a
percentage of 69.89% and 54.48% respectively, whereas against T47D cells
obtained results inhibiting the cell cycle in the phase G0-G1 with the percentage of
55.04% and 54.49%, and can stimulate early apoptosis by percentage 20.59%;
41.47% on MCF-7 cells and 17.76% ; 7.66% on T47D cells and can suppress the
expression of cyclin D1 and Bcl-2.
Based on these results, EAEKL can be combined with doxorubicin as a
breast anticancer because of the synergistic effect and the occurrence of cell cycle
inhibition and apoptotic stimulation.
Keywords: Kelor leaves, doxorubicin, T47D, MCF-7, cytotoxic, combination

index, selectivity index, immunocytochemistry.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ....................................................................................................... i
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ........................................................... iii
LEMBAR PENGESAHAN TESIS ............................................................ iv
SURAT PERNYATAAN ........................................................................... v
KATA PENGANTAR ................................................................................ vi
ABSTRAK ................................................................................................. vii
ABSTRACT ............................................................................................... ix
DAFTAR ISI .............................................................................................. x
DAFTAR TABEL ...................................................................................... xvi
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xvii
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xix
DAFTAR SINGKATAN ................................................................ ............ xxi
BAB I PENDAHULUAN ....................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ...................................................................... 1
1.2 Kerangka Pikir Penelitian ..................................................... 7
1.3 Perumusan Masalah .............................................................. 8
1.4 Hipotesis ............................................................................... 8
1.5 Tujuan Penelitian .................................................................. 9
1.6 Manfaat Penelitian ................................................................ 9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................... 11
2.1 Siklus Sel .............................................................................. 11
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.1.1 Rb Pathway ................................................................. 12
2.1.2 Checkpoint pada Siklus Sel .......................................... 15
2.1.3 P-53 Pathway .............................................................. 15
2.1.4 Nuclear Factor kappa B (NF-kB) Pathway ................ 17
2.1.5 Keseimbangan Apoptosis dan Proliferasi .................... 18
2.2 Kanker ................................................................................... 23
2.2.1 Karsinogenesis ............................................................. 27
2.2.2 Kanker Payudara .......................................................... 29
2.2.2.1 Sel T47D .......................................................... 31
2.2.2.2 Sel MCF-7 ....................................................... 32
2.2.3 Sel Vero ....................................................................... 33
2.2.4 P-glycoprotein .............................................................. 33
2.3 Penanganan Kanker .............................................................. 35
2.3.1 Terapi Kanker Payudara .............................................. 36
2.3.1.1 Doksorubisin ................................................... 39
2.3.1.2 Terapi Kombinasi ............................................ 41
2.4 Kelor ..................................................................................... 41
2.4.1 Uraian Umum .............................................................. 41
2.4.2 Sistematika Tumbuhan ................................................ 43
2.4.3 Daun Kelor ................................................................... 43
2.4.4 Kandungan Bahan Aktif dalam Daun Kelor ................ 45
2.4.5 Manfaat dan Efek Farmakologi Daun Kelor ................ 46
2.4.6 Penelitian terhadap Daun Kelor ................................... 47
2.5 Target Molekular Terapi Herbal untuk Prevensi dan

Terapi Kanker ...................................................................... 48
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.6 Metode Pengujian Aktivitas Antikanker dari Berbagai
Tanaman Obat ...................................................................... 49
2.6.1 Uji Sitotoksik ................................................................ 50
2.6.1.1 Uji Sitotoksik Menggunakan Metode MTT .... 51
2.6.2 Indeks Selektivitas ....................................................... 51
2.6.3 Indeks Terapi Kombinasi ............................................. 52
2.6.4 Flowcytometry ............................................................. 53
2.6.5 Imunositokimia ............................................................ 55
2.7 Metode Ekstraksi ................................................................. 56
2.8 Kerangka Teori Penelitian .................................................... 59
BAB III METODE PENELITIAN ............................................................. 60
3.1 Alat dan Bahan ...................................................................... 60
3.1.1 Alat-alat ...................................................................... 60
3.1.2 Bahan-bahan ............................................................... 61
3.2 Penyiapan Bahan Tumbuhan ................................................ 61
3.2.1 Pengumpulan Bahan .................................................... 61
3.2.2 Identifikasi Tumbuhan ................................................ 62
3.2.3 Pembuatan Simplisia Daun Kelor ............................... 62
3.3 Pembuatan Pereaksi .............................................................. 62
3.3.1 Besi (III) klorida 1% b/v ............................................. 62
3.3.2 Larutan asam klorida 2 N ........................................... 62
3.3.3 Timbal (II) asetat 0,4 M .............................................. 62
3.3.4 Pereaksi Mayer ............................................................ 63
3.3.5 Pereaksi Dragendorff ................................................... 63
3.3.6 Larutan kloralhidrat ..................................................... 63
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.3.7 Larutan asam sulfat 2 N ............................................... 63
3.3.8 Pereaksi Bouchardat .................................................... 63
3.3.10 Pereaksi Lieberman-Burchard ................................... 63
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia . .................................. 64
3.4.1 Pemeriksaan Makroskopik dan Mikroskopik .............. 64
3.4.2 Penetapan kadar air ..................................................... 64
3.4.3 Penetapan kadar sari larut dalam air ............................ 65
3.4.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol ............. 65
3.4.5 Penetapan kadar abu total ............................................ 66
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam ............... 66
3.5 Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia ..................................... 67
3.5.1 Pemeriksaan Alkaloid .................................................. 67
3.5.2 Pemeriksaan Flavonoid ................................................ 67
3.5.3 Pemeriksaan Glikosida ................................................ 68
3.5.4 Pemeriksaan Saponin ................................................... 68
3.5.5 Pemeriksaan Tanin ....................................................... 69
3.5.6 Pemeriksaan Steroid/triterpenoid ................................. 69
3.5.7 Pemeriksaan Antrakuinon ............................................ 69
3.6 Pembuatan Ekstrak Daun Kelor ............................................. 69
3.7 Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Kelor ............................... 70
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan ..................................................... 70
3.9 Pembuatan Media ................................................................. 70
3.9.1 Pembuatan media RPMI .............................................. 70
3.9.2 Pembuatan media komplit RPMI (MK RPMI) ........... 71
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.9.3 Pembuatan media DMEM ........................................... 71
3.9.4 Pembuatan media komplit DMEM (MK DMEM) ...... 72
3.9.5 Pembuatan media M199 .............................................. 72
3.9.6 Pembuatan media komplit M199 (MK M199) ............ 73
3.10 Penumbuhan Sel .................................................................... 73
3.10.1 Penumbuhan Sel T47D .............................................. 73
3.10.2 Subkultur Sel T47D ................................................... 74
3.10.3 Panen Sel T47D ......................................................... 74
3.10.4 Penumbuhan Sel MCF-7 ............................................ 74
3.10.5 Penumbuhan Sel Vero ............................................... 75
3.10.6 Subkultur Sel Vero ..................................................... 75
3.10.7 Panen Sel Vero ........................................................... 75
3.10.8 Penghitungan Sel T47D, Sel MCF-7 dan Sel Vero ... 76
3.10.9 Pembuatan Larutan Uji .............................................. 77
3.11 Pengujian Sitotoksik ........................................................... 77
3.11.1 Pengujian Sitotoksik terhadap Sel Vero ................... 77
3.11.2 Pengujian Sitotoksik terhadap Sel T47D .................. 78
3.11.3 Pengujian Sitotoksik terhadap Sel MCF-7 ................ 78
3.12 Analisis Hasil ....................................................................... 78
3.13 Indeks Selektivitas ............................................................... 79
3.14 Uji Kombinasi Ekstrak Etilasetat Daun Kelor dengan

Doksorubin terhadap Sel T47D dan Sel MCF-7 .................. 80
3.15 Pengujian Kombinasi Ekstrak Etilasetat Daun Kelor

dengan Doksorubin terhadap Apoptosis dan Siklus
Sel dari Sel T47D dan Sel MCF-7 ....................................... 82
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.16 Pengujian Kombinasi Ekstrak Etilasetat Daun Kelor
dengan Doksorubin dalam Penekanan Ekspresi Siklin
D1 dan Bcl-2 terhadap Sel T47D dan Sel MCF-7 ................ 83
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 84
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan ................................................. 84
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia ................................................ 84
4.3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak ................... 87
4.4 Ekstraksi ................................................................................ 89
4.5 Uji Sitotoksik Ekstrak ........................................................... 90
4.6 Indeks Selektivitas ................................................................ 94
4.7 Uji Kombinasi EEADK - Doksorubisin terhadap

Sel MCF-7 ............................................................................. 95
4.8 Uji Kombinasi EEADK - Doksorubisin terhadap

Sel T47D ............................................................................... 97
4.9 Uji Penghambatan Siklus Sel terhadap Sel MCF-7 ............... 99
4.10 Uji Penghambatan Siklus Sel terhadap Sel T47D................. 104
4.11 Uji Apoptosis pada Sel MCF-7 ............................................ 109
4.12 Uji Apoptosis pada Sel T47D .............................................. 113
4.13 Pengamatan Ekspresi Protein Siklin D1 dan Bcl-2 .............. 116
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 124
5.1 Kesimpulan ............................................................................ 124
5.2 Saran ..................................................................................... 125
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 126
LAMPIRAN …………............................................................................... . 138
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1 Daftar Penelitian dari Daun Kelor .............................................. 47
2.2 Interpretasi nilai CI (Combination Index) ................................... 53
4.1 Hasil karakteristik simplisia daun kelor (SDK) .......................... 85
4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia daun kelor (SDK) ................. 87
4.3 Hasil skrining fitokimia ekstrak daun kelor ................................. 87
4.4 Hasil IC50 ekstrak daun kelor terhadap sel T47D, MCF-7
dan sel Vero ................................................................................. 90
4.5 Nilai indeks selektivitas (IS) ekstrak daun kelor pada

sel MCF-7 dan sel T47D .............................................................. 93
4.6 Nilai indeks kombinasi (CI) EEADK-doksorubisin terhadap

sel MCF-7 .................................................................................... 96
4.7 Nilai indeks kombinasi (CI) EEADK-doksorubisin terhadap

sel T47D ....................................................................................... 97
4.8 Distribusi sel MCF-7 setelah perlakuan dengan berbagai

Konsentrasi EEADK, doksorubisin dan kombinasi keduanya .... 100
4.9 Distribusi sel T47D setelah perlakuan dengan berbagai

Konsentrasi EEADK, doksorubisin dan kombinasi keduanya .... 104
4.10 Hasil pengujian apoptosis EEADK pada sel MCF-7 .................. 110
4.11 Hasil pengujian apoptosis EEADK pada sel T47D ..................... 113
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ............................................... 7
2.1 Ilustrasi umum siklus sel ............................................................. 14
2.2 Aktivasi NF-kB terhadap sel kanker ............................................ 18
2.3 Jalur ekstrinsik dan intrinsik apoptosis ........................................ 22
2.4 Struktur kompleks doksorubisin-DNA ........................................ 39
2.5 Pohon kelor .................................................................................. 42
2.6 Daun Kelor ................................................................................... 44
2.7 Struktur kimia kandungan aktif daun kelor ................................. 46
2.8 Skema alat Flowcytometer ........................................................... 54
2.9 Kerangka teori penelitian ............................................................. 59
3.1 Hemositometer ............................................................................. 76
4.1 Hasil viabilitas sel MCF-7 ........................................................... 91
4.2 Hasil viabilitas sel T47D .............................................................. 91
4.3 Hasil viabilitas sel Vero ............................................................... 91
4.4 Hasil uji sitotoksik doksorubisin ................................................... 92
4.5 Gambaran siklus sel MCF-7 kontrol ............................................ 100
4.6 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi ½ IC50 EEADK ........... 100
4.7 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi 1/10 IC50 EEADK ......... 101
4.8 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi 1/8 IC50 EEADK dan
¼ IC50 doksorubisin ..................................................................... 101
4.9 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi ½ IC50 doksorubisin ... 101
4.10 Gambaran siklus sel T47D kontrol .............................................. 105
Universitas
Sumatera Utara
Utara
4.11 Gambaran siklus sel T47D yang diberi ½ IC50 EEADK ............ 105
4.12 Gambaran siklus sel T47D yang diberi 1/10 IC50 EEADK ............. 105
4.13 Gambaran siklus sel T47D yang diberi 1/8 IC50 EEADK dan
1
/4 IC50 doksorubisin ..................................................................... 106
4.14 Gambaran siklus sel T47D yang diberi ½ IC50 doksorubisin ...... 106
4.15 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 kontrol ........................ 110
4.16 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi ½ IC50

EEADK ........................................................................................ 110
4.17 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi 1/10 IC50
EEADK ........................................................................................ 110
4.18 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi 1/8 IC50
EEADK dan 1/4 IC50 doksorubisin ................................................ 111
4.19 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi ½ IC50

doksorubisin ................................................................................. 111
4.20 Gambaran persentase kondisi sel T47D kontrol .......................... 114
4.21 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi ½ IC50

EEADK ........................................................................................ 114
4.22 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi 1/10 IC50
EEADK ........................................................................................ 114
4.23 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi 1/8 IC50
EEADK dan 1/4 IC50 doksorubisin ................................................ 114
4.24 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi ½ IC50

doksorubisin ................................................................................. 115
4.25 Ekspresi Siklin D1 yang diberi berbagai perlakuan pada sel

T47D ............................................................................................ 118
4.26 Ekspresi Siklin D1 yang diberi berbagai perlakuan pada sel

MCF-7 .......................................................................................... 118
4.27 Ekspresi Bcl-2 yang diberi berbagai perlakuan pada sel T47D ... 121
4.28 Ekspresi Bcl-2 yang diberi berbagai perlakuan pada sel MCF-7 . 122
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1 Hasil identifikasi daun kelor (Moringa oleifera L.) ..................... 138
2 Gambar daun kelor (Moringa oleifera L.) .................................. 139
3 Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk SDK .............................. 140
4 Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi bertingkat ...... 141
5 Perhitungan kadar air SDK .......................................................... 142
6 Perhitungan kadar sari larut air SDK ........................................... 143
7 Perhitungan kadar sari larut etanol SDK ..................................... 144
8 Perhitungan kadar abu total SDK ................................................ 145
9 Perhitungan kadar abu tidak larut asam SDK .............................. 146
10 Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7 ..................................... 147
11 Perhitungan persen sel hidup sel T47D ....................................... 148
12 Perhitungan persen sel hidup sel Vero ......................................... 149
13 Bagan pembuatan media RPMI ................................................... 150
14 Bagan pembuatan media komplit (MK) RPMI ............................ 151
15 Bagan penumbuhan sel ................................................................ 152
16 Bagan panen sel ........................................................................... 153
17 Bagan penghitungan sel ............................................................... 154
18 Bagan pembuatan larutan uji ....................................................... 155
19 Bagan pengujian sitotoksik .......................................................... 156
20 Bagan pengujian flowsitometri .................................................... 157
21 Bagan pengujian imunositokimia ................................................ 158
Universitas
Sumatera Utara
Utara
22 Sel MCF-7, T47D dan sel Vero di bawah mikroskop ................. 159
23 Microplate-96 sumuran ................................................................ 160
24 Hasil IC50 EEADK pada sel MCF-7 dengan analisis probit

SPSS 24......................................................................................... 161
25 Hasil IC50 Doksorubisin pada sel MCF-7 dengan analisis

probit SPSS 24 .............................................................................. 162
26 Hasil IC50 EEADK pada sel T47D dengan analisis probit

SPSS 24......................................................................................... 163
27 Hasil IC50 Doksorubisin pada sel T47D dengan analisis

probit SPSS 24 .............................................................................. 164
28 Hasil IC50 EEADK pada sel Vero dengan analisis probit

SPSS 24......................................................................................... 165
29 Nilai persen hidup sel MCF-7 dengan pemberian kombinasi

EEADK-Doksorubisin .................................................................. 166
30 Nilai persen hidup sel T47D dengan pemberian kombinasi

EEADK-Doksorubisin .................................................................. 167
31 Indeks kombinasi (IK) EEADK-Doksorubisin pada sel

MCF-7 dengan Compusyn software versi 1 .................................. 168
32 Indeks kombinasi (IK) EEADK-Doksorubisin pada sel

T47D dengan Compusyn software versi 1 .................................... 170
33 LAF (Laminar Air Flow), mikroskop inverted dan

inkubator CO2 .............................................................................. 172
34 Microplate reader dan Flowsitometer ......................................... 173
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DAFTAR SINGKATAN
ABCB1 ATP Binding Cassette Famili B 1

AIF Apoptosis Including Factor
Apaf-1 Apoptosis activating factor-1
ATP Adenosine-Tri Phosphat
Bcl-2 B cell Limphoma-2
Bcl-XL B cell Limphoma- Extra Large
BCRP Breast Cancer Resistance Protein
CAK CDK Activating Kinase
CDK Cyclin Dependent Kinase
CDKI Cyclin Dependent Kinase Inhibitor
Cdc25c Cell division cycle 25 homolog C
CI Combination Index
Cyc Cyclin
DR Death Reseptor
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimethyl Sulfoxide
DNA Deoxiribo Nukleid Acid
Dox Doxorubicin
EAEKL Ethyl acetate Extract of Kelor Leaves
ENDK Ekstrak n-heksana daun kelor
EEADK Ekstrak etil asetat daun kelor
EEDK Ekstrak etanol daun kelor
EEKL Ethanol Extract of Kelor Leaves
ER Estrogen Reseptor
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FADD Fas-Asociated Death Domain
FBS Fetal Bovine Serum
HER-2 Human Epidermal growth factor Receptor 2
HIV Human Immunodeficiency Virus
IAP Inhibitory Apoptosis
Universitas
Sumatera Utara
Utara
IK Indeks Kombinasi
IS Indeks Selektivitas
MAPK Mitogen Activated Protein Kinase
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7
MDR Multi Drug Resistance
MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
NEKL N-hexana Extract of Kelor Leaves
NF-ĸB Nuclear Factor kappa B
p21 Protein 21
p53 Protein 53
Pgp P-glikoprotein
PI Propidium Iodida
PKC Protein Kinase C
pRB Protein Retinoblastoma
PS Phosphatidylserine
RNA Ribo Nucleid Acid
ROS Reactive Oxygen Species
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SDK Simplisia Daun Kelor
SDS Sodium Dodesil Sulfat
SI Selectivity Index
TNF Tumor Necrosis Factor
TNFR Tumor Necrosis Factor Receptor
T47D Tumor 47 Ductal
Universitas
Sumatera Utara
Utara
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kanker adalah istilah umum untuk pertumbuhan sel tidak normal (yaitu
tumbuh sangat cepat, tidak terkontrol) yang dapat menyerang ke jaringan tubuh
normal dan menekan jaringan tubuh normal sehingga mempengaruhi fungsi
tubuh. Kanker merupakan suatu penyakit yang kompleks yang diakibatkan oleh
banyak faktor. Secara fisiologis, sistem pertumbuhan sel dalam individu diatur
oleh suatu sistem keseimbangan, yaitu apoptosis dan proliferasi. Apabila pada
individu terjadi apoptosis yang berlebih, maka individu tersebut akan mengalami
kemunduran fungsi dari suatu sistem organ yang dapat menimbulkan suatu
penyakit. Demikian juga halnya bila terjadi proliferasi sel secara berlebihan, maka
akan membentuk suatu massa tumor (malignancy) yang akan mengarah pada
kanker (Sudiana, 2011).
Kanker termasuk penyakit mematikan baik pada pria maupun wanita.
Menurut data WHO tahun 2013, kanker menjadi penyebab kematian nomor dua di
dunia sebesar 13 persen setelah penyakit kardiovaskuler. Diperkirakan pada tahun
2030 insiden kanker dapat mencapai 26 juta orang dari 17 juta diantaranya
meninggal akibat kanker terlebih untuk negara miskin dan berkembang
kejadiannya akan lebih cepat. Insiden kanker meningkat dari 12,7 juta kasus tahun
2008 menjadi 14,1 juta kasus tahun 2012. Sedangkan jumlah kematian meningkat
dari 7,6 juta orang pada tahun 2008 menjadi 8,2 juta orang pada tahun 2012
(Kemenkes, 2015).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Prevalensi penyakit kanker di Indonesia cukup tinggi, berdasarkan data
Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) tahun 2013 prevalensi tumor/kanker di
Indonesia adalah 1,4 per 1000 penduduk, atau sekitar 330.000 orang. Kanker
merupakan penyebab kematian ketujuh di Indonesia. Penderita kanker tertinggi di
Indonesia adalah kanker payudara dan kanker rahim. Berdasarkan Sistem
Informasi Rumah Sakit (SIRS) 2013 jumlah pasien rawat jalan maupun rawat inap
pada kanker payudara terbanyak yaitu 12.014 orang (28,7%), kanker serviks 5.349
orang (12,8%), leukemia sebanyak 4.342 orang (10,4%), lymphoma 3.486 orang
(8,3 %) dan kanker paru 3.244 orang (7,8 %) (Kemenkes, 2015).
Kemoterapi merupakan salah satu terapi kanker yang digunakan saat ini
selain dengan pembedahan, radioterapi, dan pengobatan dengan hormon.
Pengobatan dengan pembedahan dan radioterapi dapat dilakukan pada kanker
stadium awal. Akan tetapi pengobatan tersebut gagal digunakan pada kanker yang
telah berkembang pada stadium lanjut dan mengalami metastasis.
Kemoterapi merupakan pengobatan kanker yang menggunakan senyawa
kimia untuk menekan atau menghentikan proliferasi sel, atau menghancurkan sel
kanker (sitotoksik). Doksorubisin merupakan antibiotik antrasiklin yang dianggap
efektif sebagai salah satu agen kemoterapi antikanker dan banyak digunakan
(Frias, et al., 2009). Senyawa ini diisolasi dari Streptomyces peucetius var caesius
pada tahun 1960-an dan digunakan secara luas (Childs, et al., 2002).
Penggunaan doksorubisin sebagai agen kemoterapi dapat digunakan baik
sebagai agen tunggal maupun kombinasi. Penggunaan doksorubisin sebagai agen
kemoterapi tersebut dianggap efektif (Frias, et al., 2009). Namun, penggunaan
doksorubisin pada terapi kanker ternyata memberikan beberapa efek samping
Universitas
Sumatera Utara
Utara
antara lain mempengaruhi sistem imun, rambut rontok, radang tenggorokan,
hepatotoksik, dan kardiotoksik (Frias, et al., 2009; Fogli, et al., 2004; Ekowati, et
al., 2013) yang bersifat irreversibel. Penelitian terhadap 399 pasien menunjukkan
bahwa insidensi gagal jantung pada pasien yang menerima doksorubisin dalam
dosis besar adalah lebih dari 18% (Singal, et al., 2000). Doksorubisin dapat
menginduksi akumulasi inflammatory cells yang terkait dengan peningkatan
amino transferase seperti alanine transaminase (ALT) dan Aspartate
transaminase (AST) dalam serum (Ekowati, et al., 2013). Beberapa peneliti juga
melaporkan terjadi induksi NOS (Nitric oxide synthase) yang melepaskan NO dan
menghasilkan ROS (Reactive oxygen species) pada cardiac akibat toksisitas
doxorubicin (Fogli, et al., 2004). Oleh karena itu, diperlukan inovasi untuk
menurunkan efek kardio-hepatotoksik tersebut.
Penggunaan jangka panjang dapat menyebabkan resistensi karena
ekspresi berlebih dari P-glikoprotein (Pgp), yakni protein yang berperan pada
pengeluaran obat dari sel, sehingga potensi sitotoksik pada sel kanker akan
berkurang (Imai, et al., 2005; Wong, et al., 2006). Timbulnya resistensi ini
menjadi kendala utama dalam kemoterapi karena dapat menurunkan sensitivitas
sel kanker terhadap agen kemoterapi.
Oleh karena itu, perlu dilakukan terapi kombinasi dengan menggunakan
agen kemopreventif untuk meningkatkan sensitivitas sel kanker payudara terhadap
agen kemoterapi dan meminimalkan efek samping , kombinasi ini disebut
kokemoterapi. Kokemoterapi merupakan strategi terapi kanker dengan
mengkombinasikan suatu senyawa dengan agen kemoterapi. Senyawa atau obat
ini dapat meningkatkan efikasi terapi sekaligus menurunkan toksisitas agen
Universitas
Sumatera Utara
Utara
kemoterapi pasangannya terhadap jaringan normal (Sharma, et al., 2004).
Pemilihan agen kokemoterapi dari alam merupakan sebuah peluang yang
prospektif dalam pengembangan obat. Akan tetapi masih langkanya pembuktian
penggunaan bahan alam secara ilmiah menimbulkan kekwatiran apakah alternatif
pengobatan tersebut mempunyai dampak positif atau justru berdampak negatif.
Bahan alami yang ideal digunakan sebagai kokemoterapi adalah bahan alami yang
berefek sinergis dengan agen kemoterapi sehingga dosis agen kemoterapi yang
dipakai dapat diturunkan sebagai upaya untuk menghindari efek samping serta
membantu percepatan penyembuhan kanker (Meiyanto, et al., 2008).
Salah satu tanaman yang diketahui berpotensi antikanker dengan
meningkatkan apoptosis dan menghambat proliferasi adalah kelor (Moringa
oleifera L). Daun kelor memiliki kandungan kimia yang unik yaitu isotiosianat,
glukosinolat, karbamat, tiokarbamat, fenolik, niazimicin, flavonoid (kaempferol,
quersetin), vitamin C dan vitamin E yang pada penelitian sebelumnya
menunjukkan aktivitas biologis sebagai antiinflamasi, antioksidan dan antitumor
(Sreelatha, et al., 2011; Karim, et al., 2016). Isotiosianat dan glukosinolat pada
daun kelor secara khusus merupakan zat yang berguna sebagai kemoprevensi
pada sel kanker yaitu benzil isotiosianat (BITC) dan Fenetil isotiosianat (PEITC),
dimana BITC secara in vitro mampu menginduksi apoptosis terhadap sel kanker
ovarium (Bose, et al., 2007) dan sel kanker pankreas BxPC-3 secara signifikan
dengan IC50 8 M serta menginhibisi pertumbuhan sel kanker pankreas BxPC-3
(Srivasta, et al., 2004). PEITC mampu menginhibisi pertumbuhan sel kanker
paru-paru dan menginduksi apoptosis selnya (Sticha, et al., 2002).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Beberapa publikasi penelitian membuktikan potensi daun kelor sebagai
antikanker yaitu pada penelitian Sreelatha et al, (2011) dimana ekstrak etanolnya
mampu menginduksi apoptosis dan menghambat radikal bebas pada human tumor
cell line (Sreelatha, et al., 2011), pada leukemia dan hepatocarcinoma cell line
(Khalafalla, et al., 2010). Sebagai sitotoksik dan antikanker pada cell line hela dan
lymphocyte (Nair, et al., 2011); antikanker pada sel HepG2 (Hepatoceluler),
Caco-2 (kanker kolon) dan MCF-7 (Charoensin, et al., 2014).
Ekstrak daun kelor mempunyai aktivitas antikanker pada sel kanker
payudara ini dibuktikan dengan penelitian yang dilakukan oleh Hossain et al,
(2015) dimana ekstrak etanol daun kelor menghambat pertumbuhan sel MCF-7
sebesar 88,13% dan pada sel normal sebesar 12,89%. Penelitian lainnya dilakukan
oleh Yurina et al, (2014) dimana ekstrak etanol daun kelor mampu meningkatkan
ekspresi caspase-9, menurunkan ekspresi p27 dan meningkatkan apoptosis pada
sel MCF-7.
Penelitian pengaruh ekstrak etanol daun kelor memberi efek sinergis
positif meningkatkan sitotoksisitas doksorubisin pada sel kanker servik (Hela)
telah dilakukan oleh Hermawan et al, (2012), dimana ekstrak etanol M. Oleifera
meningkatkan induksi apoptosis dibandingkan dengan doksorubisin saja,
sedangkan untuk sel kanker payudara belum pernah dilakukan.
Selain sebagai antikanker ekstrak daun kelor juga memiliki efek
kardioprotektif dimana ekstrak etanol daun kelor mampu memperbaiki
histopatologi cardiac tikus yang diinduksi oleh doksorubisin (Fikriansyah, et al.,
2015). Ekstrak metanol daun kelor juga memiliki efek hepatoprotektif dimana
ekstraknya dapat meningkatkan GSH, GSH-R dan CAT, Kadar RBCs dan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
menurunkan peroksidasi lipid pada liver (Kumar et al., 2011). Selain itu ekstrak
etanol daun kelor memiliki aktivitas sebagai imunostimulator terhadap CD3+ dan
CD8+ pada tikus betina yang diinduksi oleh doksorubisin (Sari, et al., 2015).
Penelitian uji toksisitas akut ekstrak daun kelor telah dilakukan terhadap
tikus albino dan kelinci dimana ekstrak daun kelor memiliki efek toksisitas yang
rendah dengan LD50 pada tikus 6616,67 mg/kg BB dan pada kelinci sebesar
26043,67 mg/kg BB (Osman, et al., 2015), untuk uji toksisitas sub kroniknya
terhadap mencit diperoleh LD50 sebesar 1585 mg/kg BB (Awodele, et al., 2012).
Sel kanker payudara memiliki beberapa jenis untuk diteliti. Diantara jenis
sel kanker tersebut sel kanker payudara yang sering digunakan dalam penelitian
adalah sel T47D (human ductal breast epithelial tumor cell line) dan sel MCF7.
Sel T47D sering digunakan dalam penelitian kanker secara in vitro karena
penanganannya mudah, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas atau
cepat pertumbuhannya, memiliki homogenitas yang tinggi dan mudah diganti sel
baru yang telah dibekukan jika terjadi kontaminasi (Abcam, 2007). Sel MCF-7
memiliki karakteristik antara lain resisten agen kemoterapi (Mechetner, et al.,
1998), mengekspresikan reseptor estrogen (ER +), overekspresi Bcl-2 (Butt, et al.,
2000; Amundson, et al., 2000) dan tidak mengekspresikan caspase-3 (Onuki, et
al., 2004).
Berdasarkan uraian di atas, tujuan penelitian ini adalah untuk meneliti efek
kombinasi dari ekstrak daun kelor yang dikombinasi dengan doksorubisin
terhadap ekspresi Siklin D1 dan Bcl-2 pada sel kanker payudara T47D dan MCF-
7 melalui uji sitotoksik, indeks selektivitas, indeks kombinasi dengan , apoptosis,
siklus sel, dan pengujian ekspresi proteinnya.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
1.2 Kerangka Pikir Penelitian
Berdasarkan uraian latar belakang diatas penelitian ini menguji efek
kombinasi ekstrak daun kelor dengan doksorubisin terhadap sel kanker payudara
yaitu sel MCF7 dan T47D, secara diagramatis kerangka pikir penelitian ini dapat
dilihat pada Gambar 1.1.
Variabel Bebas Variabel terikat Parameter

1.Makroskopik 6. Kadar sari larut
Simplisia Karakteristik 2.Mikroskopik dalam air
3.Kadar air 7. Kadar sari larut
daun kelor simplisia 4.Kadar abu total dalam etanol
5. Kadar abu tidak
larut asam
ENDK, 1. Alkaloid 5. Triterpenoid/steroid

Skrining 2. Flavonoid 6. Glikosida
EEADK 3. Tannin 7. Glikosida /antrakinon
Fitokimia
dan EEDK 4. Saponin
Sel T47D
Aktivitas Persentase Indeks
Sel MCF7 Sitotoksik Sel Hidup Selektivitas
Ekstrak (IC50) (IS)
Sel Vero
Indeks
Efek kombinasi Kombinasi (IK)
EEADK
Penghambatan Persentase
Sel T47D Hambatan siklus
siklus sel
sel
Sel
Sel MCF-7 Induksi Persentase
Doksorubisin MCF7 Apoptosis Apoptosis
Penekanan
Ekspresi protein
ekspresi protein
Siklin D1 dan
Siklin D1 dan
Bcl-2
Bcl-2
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian
Universitas
Sumatera Utara
Utara
1.3 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, maka permasalahan dalam penelitian ini
adalah:
a. Apakah ekstrak n-heksan, ekstrak etilasetat, ekstrak etanol daun kelor
memiliki aktivitas antikanker pada sel kanker payudara?
b. Apakah kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
memiliki efek sinergis sebagai antikanker terhadap sel kanker payudara?
c. Apakah kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menghambat siklus sel kanker payudara?
d. Apakah kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menginduksi apoptosis sel kanker payudara?
e. Apakah kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menekan ekspresi protein siklin D1?
f. Apakah kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menekan ekspresi protein Bcl-2?
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah penelitian di atas, maka hipotesis penelitian
ini adalah:
a. Ekstrak n-heksan, ekstrak etilasetat, ekstrak etanol daun kelor memiliki
aktivitas antikanker pada sel kanker payudara.
b. Kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin memiliki
efek sinergis sebagai antikanker terhadap sel kanker payudara.
c. Kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin mampu
menghambat siklus sel kanker payudara.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
d. Kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin mampu
menginduksi apoptosis sel kanker payudara.
e. Kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin mampu
menekan ekspresi protein siklin D1.
f. Kombinasi ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin mampu
menekan ekspresi protein Bcl-2.
1.5 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan penelitian ini adalah untuk:
a. Mengetahui apakah ekstrak n-heksan, ekstrak etilasetat, ekstrak etanol
daun kelor memiliki aktivitas antikanker pada sel kanker payudara.
b. Mengetahui apakah ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
memiliki efek sinergis sebagai antikanker terhadap sel kanker payudara.
c. Mengetahui apakah ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menghambat siklus sel kanker payudara.
d. Mengetahui apakah ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menginduksi apoptosis sel kanker payudara.
e. Mengetahui apakah ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menekan ekspresi protein siklin D1.
f. Mengetahui apakah ekstrak yang paling potensial dengan doksorubisin
mampu menekan ekspresi protein Bcl-2.
1.6 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah sebagai pengembangan daun kelor menjadi
sediaan obat tradisional yang selektif sebagai kokemoterapi antikanker dan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
menambah data informasi dalam pemanfaatan daun kelor sebagai tanaman obat
yang berkhasiat sebagai kokemoterapi antikanker.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Siklus Sel
Siklus sel merupakan proses perkembangbiakan sel yang memperantarai
pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Sel mampu melakukan
pembelahan sel yang merupakan mekanisme proliferasi sel. Siklus sel
berlangsung dengan mekanisme yang sangat kompleks, mekanisme pembentukan
protein, mekanisme aktivasi, mekanisme penghentian, mekanisme perbaikan
protein atau gen yang rusak, mekanisme istirahat dan mekanisme lain. Berbagai
mekanisme dan aktivitas sel pada siklus sel berlangsung dalam keadaan yang
seimbang dan gangguan salah satu aktivitas akan menyebabkan gangguan fungsi
dan siklus suatu sel (Aziz dkk., 2010).
Siklus sel merupakan proses vital dalam kehidupan setiap organisme.
Secara normal, siklus sel menghasilkan pembelahan sel. Pembelahan sel terdiri
dari 2 proses utama, yaitu replikasi DNA dan pembelahan kromosom yang telah
digandakan ke 2 sel anak. Secara umum, pembelahan sel terbagi menjadi 2 tahap,
yaitu mitosis (M) (pembelahan 1 sel menjadi 2 sel) dan interfase (proses di antara
2 mitosis). Interfase terdiri dari fase gap 1 (G1), sintesis DNA (S), gap 2 (G2).
Setiap tahap dalam siklus sel dikontrol secara ketat oleh regulator siklus sel, yaitu:
a. Cyclin, jenis cyclin utama dalam siklus sel adalah cyclin D, E, A, dan B.
Cyclin diekspresikan secara periodik sehingga konsentrasi cyclin berubah-
ubah pada setiap fase siklus sel. Berbeda dengan cyclin yang lain, cyclin D
Universitas
Sumatera Utara
Utara
tidak diekspresikan secara periodik akan tetapi selalu disintesis selama ada
stimulasi growth factor.
b. Cyclin-dependent kinases (Cdk). Cdk utama dalam siklus sel adalah Cdk
4, 6, 2, dan 1. Cdks merupakan treonin atau serin protein kinase yang
harus berikatan dengan cyclin untuk aktivasinya. Konsentrasi Cdks relatif
konstan selama siklus sel berlangsung. Cdks dalam keadaan bebas (tak
berikatan) adalah inaktif karena catalytic site, tempat ATP dan substrat
berikatan diblok oleh ujung C-terminal dari CKIs. Cyclin akan
menghilangkan pengeblokan tersebut, ketika diaktifkan, Cdk akan
memacu proses downstream dengan cara memfosforilasi protein spesifik.
c. Cyclin–dependent kinase inhibitor (CKI), merupakan protein yang dapat
menghambat aktivitas Cdk dengan cara mengikat Cdk atau kompleks
cyclin- Cdk. Cyclin–dependent kinase inhibitor terdiri dari dua kelompok
protein yaitu INK4 (p15, p16, p18, dan p19) dan CIP/KIP (p21, p27, p57).
Keluarga INK4 membentuk kompleks yang stabil dengan Cdk sehingga
mencegah Cdk mengikat cyclin D. INK4 bertugas mencegah progresi fase
G1. Keluarga CIP/KIP meregulasi fase G1 dan S dengan menghambat
kompleks G1 cyclin- Cdk dan cyclin B-Cdk1. Protein p21 juga
menghambat sintesis DNA dengan menonaktifkan proliferating cell
nuclear antigen (PCNA). Ekspresi p21 diregulasi oleh p53 karena p53
merupakan faktor transkripsi untuk ekspresi p21 (Vermeulen, et al., 2003).
2.1.1 Rb Pathway
Siklus sel dimulai dari masuknya sel dari fase G0 (quiescent) ke fase G1
karena adanya stimulus oleh growth factor (Gambar 2.1). Pada awal fase G1, Cdk
Universitas
Sumatera Utara
Utara
4 dan atau 6 diaktifkan oleh cyclin D (cycD). Kompleks Cdk 4/6 dengan cycD
akan menginisiasi fosforilasi dari keluarga protein retinoblastoma (pRb) selama
awal G1. Efek dari fosforilasi ini, fungsi histon deasetilasi (HDAC) yang
seharusnya menjaga kekompakan struktur kromatin menjadi terganggu. Akibatnya
struktur DNA menjadi longgar dan faktor transkripsi yang semula diikat pRb
menjadi lepas dan transkripsi dari E2F responsive genes yang dibutuhkan dalam
progresi siklus sel ke fase S menjadi aktif. Gen tersebut antara lain cycE, cycA,
Cdc25, DNA polimerase, timidilat kinase, timidilat sintetase, DHFR, dll
(Satyanarayana and Kaldis, 2009; Vermeulen, et al., 2003).
Pada transisi fase G1 ke fase S, Cdk2 aktif dengan mengikat cycE.
Kompleks tersebut melanjutkan proses fosforilasi pRb (status hiperfosforilasi)
supaya proses transkripsi yang dipacu E2F tetap aktif dan Restriction point (R)
yang ada di batas fase G1/S dapat terlampaui. Pada saat inilah cycA ditranskripsi
(Satyanarayana and Kaldis, 2009). Selama G1/S, kompleks Cdk2-cycE juga
memfosforilasi inhibitor p27 sehingga p27 terdegradasi (Vermeulen, et al., 2003),
ketika siklus sel akan memasuki fase S, cycE akan didegradasi dan Cdk2 yang
dibebaskan akan mengikat cycA (Cooper and Hausman, 2009).
Kompleks Cdk2-cycA dibutuhkan sel untuk mereplikasi DNA selama fase
S. Kompleks Cdk2-cycA akan memfosforilasi protein yang dibutuhkan dalam
replikasi DNA supaya aktif, contohnya adalah protein CDC6 (Cell Division Cycle
6). Kompleks tersebut juga menjaga supaya tidak terjadi multiplicity replikasi
DNA. Pada akhir fase S, cycA akan melepas Cdk2 dan mengikat Cdk1 (Cdc2)
yang meregulasi transisi sel dari S ke G2 (Dhulipala, et al., 2006). Kompleks
cycA-Cdk1 akan memfasilitasi kondensasi kromatin yang dibutuhkan untuk
Universitas
Sumatera Utara
Utara
penggandaan sel (Lapenna and Giordano, 2009). Pada fase G2, sel juga memiliki
kesempatan melakukan mekanisme repair apabila terjadi kesalahan sintesis DNA
(Baumforth and Crocker, 2003).
Gambar 2.1 Ilustrasi umum siklus sel (Lapenna and Giordano, 2009)
Memasuki fase mitosis, cycA akan didegradasi dan terjadi peningkatan
ekspresi cycB yang akan mengikat Cdk1. Kompleks Cdk1-cycB secara aktif
memacu mitosis. Kompleks cycB-Cdk1 berperan penting dalam control
rearrangement mikrotubul selama mitosis (Dhulipala et al., 2006; Lapenna and
Giordano, 2009).
Cdk1 dapat dinonaktifkan oleh Wee1 dan Myt1 dengan cara Wee1 dan
Myt1 akan memfosforilasi Cdk1 pada tirosin-15 dan atau threonin-14.
Defosforilasi pada situs tersebut dapat dilakukan oleh Cdc25 sehingga Cdk 1
menjadi aktif kembali dan siklus sel tetap berlangsung (Vermeulen et al., 2003).
Pada akhir fase mitosis, cycB akan didegradasi oleh anaphase promoting complex
(APC) melalui proses proteolitik. APC juga berfungsi untuk memacu kromatid
Universitas
Sumatera Utara
Utara
untuk berpisah bergerak ke masing-masing kutub untuk menyelesaikan mitosis
(anafase) (Lapenna and Giordano, 2009).
2.1.2 Checkpoint pada siklus sel
Mekanisme checkpoint dilakukan pada siklus sel untuk menjamin bahwa
DNA berduplikasi dengan akurat dan separasi dari kromosom terjadi dengan
benar. Checkpoint bertugas mendeteksi kerusakan DNA. Apabila terdapat
kerusakan DNA, checkpoint akan memacu cell cycle arrest sementara untuk
perbaikan DNA atau cell cycle arrest permanen sehingga sel memasuki fase
senescent. Bila mekanisme cell cycle arrest tidak cukup menjamin DNA yang
rusak diduplikasi, maka sel akan dieliminasi dengan cara apoptosis (Siu, et al.,
1999).
Faktor checkpoint pertama pada sel mamalia dikenal dengan restriction
point (R) dan muncul menjelang akhir G1. Pada checkpoint ini, DNA sel induk
diperiksa apakah terdapat kerusakan atau tidak. Bila terdapat DNA yang rusak,
siklus sel dihentikan hingga mekanisme repair DNA rusak telah selesai. Setelah
melampaui R, sel menjadi commited (komitment) untuk menyelesaikan
keseluruhan satu siklus (no return point) dan selanjutnya sel harus mampu
melakukan replikasi DNA. Bila tidak melampaui R, sel dapat kembali ke fase G0.
Hilangnya kontrol dari R akan menghasilkan survival DNA yang rusak (Cooper
and Hausman, 2004).
2.1.3 P-53 Pathway
Pada checkpoint G1/S, kerusakan DNA dapat memacu cell cycle arrest
dan proses ini adalah p53-dependent. Secara umum, level p53 sel rendah karena
diregulasi negatif oleh mdm2 yang mentarget degradasi p53, namun kerusakan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DNA dapat menginduksi aktivitas p53 dengan cepat. p53 dikontrol oleh mdm2
dan p19ARF. Level protein p53 secara normal adalah pada konsentrasi rendah di
dalam sel. Namun, sekali distimulasi, level protein secara cepat akan meningkat
sepanjang waktu paruhnya, sedangkan level mRNA relatif tidak berubah. Regulasi
p53 terjadi pada level protein (bukan DNA atau RNA) adalah hal yang sangat
kritikal pada aktivasinya. Regulator negatif p53 yaitu mdm2 yang merupakan
suatu p53-responsive gene (gen yang terekspresi melalui faktor transkripsi p53).
Sel dapat menghambat mdm2 tergantung pada rangsangan misal adalah agen
perusak DNA (radiasi, UV, obat kemoterapi). DNA damage agent akan
menginduksi aktivasi kinase (seperti ATM dan DNA-PK) yang dapat
memfosforilasi critical residu serin dalam domain Mdm2-binding domain dari
p53. Fosforilasi p53 pada serin-15 dan serin-37 oleh ATM atau protein kinase lain
setelah terjadi kerusakan DNA dapat mencegah ikatan MDM2 dengan p53. Jadi,
ketika p53 terfosforilasi maka tidak akan bisa lagi mengikat mdm2, hal ini mampu
menghilangkan penghambatan p53 dimediasi mdm2. p53 mengenali ketika sel
telah mengalami kerusakan DNA dan menghentikan siklus sel (cell cycle arrest)
sehingga sel dapat memperbaiki kerusakan (repair), atau dalam banyak kasus,
hanya memberitahu sel untuk bunuh diri (apoptosis), yaitu dengan cara
menstimulasi transkripsi gen seperti p21 dan Bax sehingga siklus sel berhenti atau
terjadi apoptosis (Siu, et al., 1999).
Checkpoint selanjutnya terdapat pada fase S yang berfungsi mendeteksi
kerusakan DNA yang direplikasi. Checkpoint pada G2 mencegah inisiasi mitosis
sebelum replikasi DNA selesai. Checkpoint utama pada fase S/G2/M adalah
Chk1. Ketika terdapat kerusakan DNA, protein kinase ATR akan memfosforilasi
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Chk1, kemudian Chk1 memfosforilasi Cdc25C pada serin-216. Fosforilasi
tersebut menyebabkan kompleks cycB-Cdk1 yang bertanggung jawab pada
progresi fase G/M tidak aktif. Selain itu, Chk1 juga memfosforilasi Cdc25A yang
bertugas mengaktifkan kompleks cycE-Cdk2 dan cycA-Cdk2 yang berperan pada
progresi fase S. Dengan difosforilasinya Cdc25A oleh Chk1, kompleks cyc-Cdk
menjadi tidak aktif dan terjadi S arrest (Xiao, et al., 2003).
Checkpoint yang terakhir, disebut spindle checkpoint, bertugas menjaga
integritas genom menjelang akhir mitosis. Jika terjadi kegagalan pada penempatan
pasangan kromosom pada spindle, akan terjadi mitosis arrest. Pada sel kanker,
checkpoint tidak berfungsi dengan baik dan siklus sel berlangsung tanpa kendali
(Cooper and Hausman, 2004).
2.1.4 Nuclear Factor kappa B (NF-kB) Pathway
NF-kB merupakan famili faktor transkripsi dengan spektrum kerja yang
luas, antara lain menginduksi pertahanan sel, proliferasi serta berperan dalam
regulasi sistem imun dan respons inflamasi. Aktivasi NF-kB pada sel normal akan
mengaktifkan beberapa gen yang terlibat dalam supresi kematian sel melalui jalur
mitokondria maupun reseptor kematian. NF-kB menginduksi ekspresi inhibitors
of apoptosis (IAPs) dan beberapa anggota famili anti-apoptosis Bcl- 2. NF-kB
juga dapat melakukan interferensi terhadap aktivitas transkripsional p53 melalui
peningkatan gen antiapoptosis dan penekanan p53 sehingga menghambat proses
apoptosis yang diinduksi oleh p53. Selain itu, NF-kB mempromosikan progresi
siklus sel melalui pengaturan gen yang terlibat dalam siklus sel seperti cyclin D1,
D2, D3 dan cyclin E, c-myc dan c-mycb. NF-kB diduga berhubungan pula dengan
aktivitas pRb melalui cyclin D1. Mekanisme anti-apoptosis NF-kB menimbulkan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
konsep umum bahwa aktivasi NF-kB berperan terhadap resistensi apoptosis (Park
and Hong, 2016).
Aktivasi NF-kB mempengaruhi terjadinya kanker dan penyakit radang
melalui transkripsi gen yang terlibat dalam proliferasi sel, kelangsungan hidup,
angiogenesis, peradangan dan promosi tumor dan metastasis seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2 Aktivasi NF-kB terhadap sel kanker (Nilius, et al., 2013)
Beberapa penelitian menunjukkan inhibisi NF-kB meningkatkan
sensitivitas sel kanker terhadap reaksi apoptosis pada kemoterapi dan radioterapi,
namun hasil penelitian tersebut masih bervariasi. Ratnasari et al, (2016)
melaporkan aktivasi NF-kB berhubungan erat dengan progresi tumor, perilaku
agresif sel kanker dan prognosis buruk kanker serviks (Ratnasari, et al., 2016).
2.1.5 Keseimbangan Apoptosis dan Proliferasi
Sistem pertumbuhan sel dalam individu secara fisiologis diatur oleh suatu
sistem keseimbangan, yaitu apoptosis dan proliferasi. Apabila terjadi apoptosis
berlebihan, maka suatu sistem organ akan mengalami kemunduran fungsi yang
dapat menimbulkan penyakit. Sebaliknya, apabila terjadi proliferasi berlebihan,
Universitas
Sumatera Utara
Utara
maka akan membentuk suatu massa tumor yang akan mengarah pada kanker
(Sudiana, 2011).
Jumlah sel pada suatu jaringan merupakan fungsi kumulatif, antara
masuknya sel baru dan keluarnya sel yang ada pada populasi. Masuknya sel baru
ke dalam populasi jaringan ditentukan oleh kecepatan proliferasinya. Sel dapat
meninggalkan populasinya karena kematian sel (apoptosis) ataupun karena
berdiferensiasi menjadi jenis sel lain. Peningkatan jumlah sel dalam populasi
tertentu dapat terjadi karena peningkatan proliferasi, penurunan apoptosis atau
diferensiasi sel (Hartono, 2009).
Apoptosis adalah proses fisiologis untuk menjaga keseimbangan populasi
sel atau homeostasis. Differensiasi sel pada fase G0 (resting/ istirahat)
memungkinkan berproliferasi bila diperlukan, bila terjadi stimulasi akan terjadi
proliferasi dengan memasuki siklus G1 (Hartono, 2009).
Proliferasi sel distimulasi oleh faktor pertumbuhan intrinsik, jejas,
kematian dan kerusakan sel, mediator biokimiawi dari lingkungan. Kelebihan
stimulus atau kekurangan inhibitor akan menyebabkan pertumbuhan sel yang tak
terkontrol atau terjadinya kanker. Penginduksian pertumbuhan sel dihubungkan
dengan pemendekan siklus sel pada fase G0 sampai sel memasuki siklus sel. Pada
fase G0 sampai memasuki siklus sel terdapat penghambatan fisiologis untuk
terjadinya proliferasi sel. Pertumbuhan sel dapat dicapai dengan memperpendek
atau memperpanjang siklus sel (Hartono, 2009).
Apoptosis adalah proses regulasi kematian sel untuk menggontrol jumlah
sel dan menghilangkan sel yang rusak. Jalur apoptosis diinduksi oleh regulasi
program intraselular, dimana sel mati akan mengaktivasi enzim untuk
Universitas
Sumatera Utara
Utara
mendegradasi DNA pada nukleus dan protein sitoplasma pada sel itu sendiri.
Membran plasma masih utuh, tetapi terjadi perubahan struktur menjadi sel
apoptosis yang akan menjadi target phagositosis oleh makrofag. Sel yang mati
segera dibersihkan sebelum terjadi kebocoran sel yang akan menyebabkan reaksi
inflamasi. Kematian sel dengan jalur apoptosis berbeda dengan nekrosis, pada
apoptosis tidak terjadi reaksi inflamasi. Apoptosis penting untuk mengatur
kematian sel untuk mengkontrol jumlah sel dan membersihkan sel yang rusak
yang mempunyai peran penting untuk supresi tumor. Akhir-akhir ini, apoptosis
digunakan untuk target terapi kanker. Sel yang apoptosis akan menunjukkan sel
melisut (cell shrinkage), pemadatan kromatin (chromatin condensation) kemudian
menjadi sel apoptosis atau badan apoptosis yang akan memudahkan untuk
difagositosis oleh makrofag. Mekanisme utama dalam apoptosis diperankan oleh
kinase di growth factor signaling pathways dan particular proteases yang disebut
caspase.
Proses apoptosis dibagi menjadi initiation phase selama caspase menjadi
aktif mengkatalisis dan excution phase yaitu selama enzim bereaksi menjadikan
sel apoptosis. Mekanisme apoptosis dibagi menjadi dua yaitu mekanisme
ekstrinsik (death receptor – initiated pathways) dan mekanisme intrinsik
(mitochondrial pathways).
Mekanisme ekstrinsik diawali oleh sel surface death receptor dari
berbagai macam sel. Death receptor adalah anggota dari tumor necrosis factor
receptor family (TNF) mempunyai cytoplasmic domain yang berisi protein
interaksi disebut death domain, penting untuk mengirim apoptotic signals.
Beberapa TNF receptor family tidak mempunyai cytoplasmic death domain,
Universitas
Sumatera Utara
Utara
mekanisme apoptosisnya sedikit diketahui. Death receptor antara lain adalah
Type I TNF receptor (TNFR I) dan protein yang berhubungan disebut Fas
(CD95). Mekanisme apoptosis diinduksi oleh death receptor diilustrasikan
dengan baik oleh Fas (King, 2000).
Diawali Fas ligand (FasL) melepaskan Fas dari ligandnya. Molekul Fas
menuju ke sitoplasma yang terdapat death domain, tempat untuk berikatan dengan
adapter protein yang juga mempunyai death domain dan disebut FADD (fas-
associated death domain). FADD yang dilekatkan pada death receptors kembali
berikatan dengan inaktif dari caspase-8 (di manusia, caspase 10) melalui death
domain. Multiple pro caspase-8 molekul kemudian dibawa ke dekatnya dan
mereka saling berikatan untuk mengaktifkan caspase-8, yang kemudian enzim
tersebut akan mengaktifkan cascade-caspase dengan mengikat dan meng-aktifkan
pro-caspase yang lain serta mengaktifkan enzim yang melaksanakan execution
phase dari apoptosis. Mekanisme apoptosis dapat dihambat oleh protein yang
disebut FLIP, yang berikatan dengan procaspase-8 tetapi tidak dapat berikatan
dan mengaktifkan enzim karena kurang mempunyai aktifitas enzym. Beberapa
virus dan sel normal memproduksi FLIP dan digunakan untuk menghambat dan
memproteksi infeksi dan memproteksi sel normal dari Fas mediated apoptosis
(King, 2000).
Mekanisme intrinsik diawali dari mitokondria yang disebabkan stimulus
internal seperti kerusakan DNA dan stress oksidatif. Jalur intrinsik disebabkan
oleh peningkatan permiabilitas mitokondria dan pelepasan molekul pro apoptotic
ke sitoplasma. Growth factor dan survival signal menstimulasi produksi anti-
apoptotic members dari Bcl-2 family. Bcl-2 family mempunyai lebih dari 20
Universitas
Sumatera Utara
Utara
macam protein, yang semuanya berfungsi regulasi apoptosis. Dua protein yang
berfungsi anti apoptosis adalah Bcl-2 dan Bcl-X. Protein anti-apoptosis dalam
keadaan normal berada disekitar membran mitokondria dan sitoplasma. Ketika sel
kehilangan kemampuan mempertahankan diri atau mengalami stress, Bcl-2
dan/atau Bcl-x akan menghilang dari membran mitokondria dan digantikan
kelompok protein pro-apoptosis seperti Bax, Bak dan Bim. Ketika Bcl-2/Bcl-x
menurun, terjadi peningkatan permiabilitas membran mitokondria menyebabkan
keluarnya beberapa protein yang akan mengaktifkan caspase cascade. Salah satu
dari protein tersebut adalah cytochrome c, di dalam cytosol cytochrome c
berikatan dengan Apaf-1 (apoptosis activating factor-1) dan mengaktifkan
caspase-9. ( Bcl-2 dan Bcl-x secara langsung menghambat aktivasi Apaf-1 dan
kemudian menghilang dari sel yang menyebabkan dapat terjadi aktivasi Apaf-1).
Protein mitokondria yang lain seperti apoptosis initiating factor (AIF) memasuki
sitoplasma yang akan berikatan untuk menetralkan berbagai macam inhibitor
apoptosis. Hal tersebut akan mengaktifkan caspase cascade (King, 2000).
Gambar 2.3 Jalur ekstrinsik dan intrinsik apoptosis (Marzban, et al., 2015)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.2 Kanker
Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel tidak
terkendali dan kemampuan sel menyerang jaringan biologis lainnya, baik
pertumbuhan langsung di jaringan tetangganya (invasif) maupun migrasi sel ke
tempat yang lebih jauh (metastasis). Pertumbuhan yang tidak terkendali tersebut
disebabkan kerusakan DNA yang menyebabkan mutasi di gen vital yang
mengontrol pembelahan sel. Sel kanker kehilangan fungsi kontrolnya terhadap
regulasi daur sel maupun fungsi homeostasis sel pada organisme multiseluler
sehingga sel tidak dapat berproliferasi secara normal. Akibatnya, sel akan
berproliferasi terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang
abnormal (Diananda, 2009).
Sel kanker timbul dari sel normal tubuh yang mengalami transformasi atau
perubahan menjadi ganas oleh karsinogen atau karena mutasi spontan.
Transformasi sejumlah gen yang menyebabkan gen tersebut termutasi disebut
neoplasma atau tumor. Neoplasma merupakan jaringan abnormal yang terbentuk
akibat aktivitas proliferasi yang tidak terkontrol (neoplasia). Pada tahap awal,
neoplasma berkembang menjadi karsinoma in situ di mana sel pada jaringan
tersebut masih terlokalisasi dan mungkin memiliki kesamaaan fungsional dengan
sel normal (King, 2000). Sel neoplasma mengalami perubahan morfologi, fungsi,
dan siklus pertumbuhan yang akhirnya menimbulkan disintegrasi dan hilangnya
komunikasi antarsel. Tumor diklasifikasikan sebagai benigna, yaitu kejadian
neoplasma yang bersifat jinak dan tidak menyebar ke jaringan di sekitarnya.
Sebaliknya, maligna disinonimkan sebagai tumor yang melakukan metastasis,
yaitu menyebar dan menyerang jaringan lain sehingga maligna sering disebut
Universitas
Sumatera Utara
Utara
sebagai kanker. Kanker sering dikenal sebagai tumor, tetapi tidak semua tumor
disebut kanker (Diananda, 2009).
Sel kanker memiliki perbedaan yang sangat signifikan dengan sel normal.
Beberapa sifat-sifat umum sel kanker adalah:
a. Sel kanker menunjukkan Instabilitas genetik, sifat ini memudahkan
terjadinya mutasi gen-gen yang lain dan terjadinya akumulasi kelainan
genetik. Sumber utama instabilitas genetik adalah kehilangan “telomeric
DNA” berakibat instabilitas kariotip dan amplifikasi maupun delesi
segmen-segmen kromosom.
b. Sel kanker seringkali ditemukan dalam lingkungan mikro inflamatorik,
paradigma baru menyatakan bahwa lingkungan mikro mempunyai
pengaruh yang besar terhadap perkembangan kanker, khususnya
lingkungan mikro inflamatorik. Saat ini hampir semua lesi neoplastik
mengandung sel-sel imun dengan densitas bervariasi yang sebenarnya
dimaksudkan untuk mengeradikasi tumor. Inflamasi berkontribusi pada
pertumbuhan sel ganas dengan mensuplai molekul-molekul bioaktif,
termasuk diantaranya faktor pertumbuhan yang memberi sinyal
pertumbuhan, faktor survival yang membatasi apoptosis, faktor
proangiogenik, dan juga dapat melepaskan bahan kimia seperti ROS yang
bersifat mutagenik.
c. Sel kanker dapat tumbuh tanpa memerlukan rangsangan pertumbuhan
eksogen (sustained growth signaling). Ketidakbergantungan pertumbuhan
sel kanker ini dapat disebabkan 3 hal, yaitu perubahan sinyal pertumbuhan
ekstrasel sendiri, perubahan transduser trans-seluler sinyal-sinyal itu, atau
Universitas
Sumatera Utara
Utara
perubahan dalam sirkuit intraseluler yang menerjemahkan sinyal menjadi
action. Perubahan yang paling kompleks terjadi pada komponen sirkuit
downstream dalam sitoplasma diantaranya yang memegang peran penting
adalah kaskade SOS-Ras-Raf-MAKP. Mutasi pada gen-gen ini
mengakibatkan berlangsungnya stimulasi pertumbuhan tanpa adanya
rangsangan melalui upstream. Selain itu sel kanker dapat memproduksi
ligan faktor pertumbuhan sendiri.
d. Sel kanker tidak sensitif terhadap sinyal anti-pertumbuhan (negative
feedback loop) atau mampu menghindar dari supresor pertumbuhan.
e. Kemampuan apoptosis sel kanker menurun, mesin apoptosis dapat dibagi
dalam 2 komponen yaitu sensor dan efektor. Sensor bertanggung jawab
atas pemantauan lingkungan ekstrasel maupun intrasel yang normal atau
abnormal, yang mempengaruhi apakah sel akan hidup atau mati. Efektor
yang paling penting dari apoptosis adalah berbagai jenis protein caspase
yang sering disebut eksekutor apoptosis. Gangguan proses apoptosis dapat
disebabkan oleh ekspresi berlebihan onkogen dan mutasi p53.
f. Kemampuan proliferasi tidak terbatas (Immortal), salah satu diantara
faktor yang berperan adalah pemeliharaan telomere, telomere akan
memendek setiap kali sel membelah, disisi lain pada sel kanker, enzim
telomerase akan mencegah pemendekan telomere dan panjang telomere
dipertahankan di atas ambang batas kritis, dan hal inilah yang
menyebabkan sel dapat membelah atau berproliferasi tanpa batas.
g. Mesin metabolisme sel kanker tidak berfungsi baik, proliferasi sel secara
terus menerus dan tidak terkendali bukan saja berakibat pertumbuhan tidak
Universitas
Sumatera Utara
Utara
terkontrol tetapi juga menyebabkan kebutuhan metabolisme energi
bertambah untuk menunjang pertumbuhan dan pembelahan sel.
h. Sel kanker memiliki kemampuan menghindar dari sistem imun, berbagai
cara oleh sel kanker agar dapat mengelak dari sistem imun sehingga selnya
tidak dikenal oleh sel-sel imun, dan berinteraksi dengan sel-sel imun
dalam lingkungan mikro tumor yang berakibat progresi yang
meningkatkan perkembangan tumor.
i. Kemampuan angiogenesis yang terus menerus, untuk menjamin suplai
oksigen dan makanan, sel ganas meningkatkan kemampuan untuk
angiogenesis dengan berbagai strategi diantaranya dengan meningkatkan
ekspresi vascular endothelial growth factor (VEGF) dan acidic/basic
fibroblast growth factor (FGF1/2).
j. Kemampuan invasi dan metastasis, berbagai protein yang terlibat dalam
menahan sel agar tidak terlepas ke sekitarnya pada sel kanker mengalami
gangguan, salah satu di antaranya adalah cell-cell adhesion molecule
(CAM) dan integrin yang menghubungkan sel dengan matriks
ekstraseluler serta E-cadherin. Gangguan atau inaktivasi ini berakibat sel
tidak lagi melekat satu sama lain dan memudahkan sel terlepas dari
kelompoknya. Selain itu ekspresi berbagai protease juga meningkat
sehingga sel mudah menginvasi jaringan sekitarnya.
Kesepuluh kemampuan sel kanker di atas diperolah sel kanker baik
langsung maupun tidak langsung selama perkembangan kanker melalui perubahan
pada berbagai gen (Kresno, 2014)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.2.1 Karsinogenesis
Kanker bukan termasuk penyakit yang datang begitu saja, melainkan
akibat akumulasi atau penumpukan kerusakan-kerusakan tertentu di dalam tubuh.
Serangkaian proses berkembangnya kanker disebut karsinogenesis.
Karsinogenesis adalah suatu proses terjadinya kanker melalui mekanisme multi
tahap yang menunjukkan perubahan genetik dan menyebabkan transformasi
progresif sel normal menjadi sel malignan (ganas). Perubahan ini diawali dari
mutasi somatik satu sel tunggal yang mengakibatkan perubahan dari normal
menjadi hiperplastik, displastik, dan pada akhirnya menjadi suatu keganasan atau
malignansi (memiliki kemampuan metastasis atau menginvasi jaringan di
sekitarnya). Perubahan genetik ini termasuk perubahan seluler mendasar pada sel
kanker yang dipengaruhi oleh beberapa gen seperti tumor suppresor genes (pRb,
p53, PTEN, E-cadherin) dan proto-oncogenes (ras, c-myc, Bcl-2). Karsinogenesis
dapat dibagi menjadi empat tahap utama, yaitu tahap inisiasi, promosi, progresi,
dan metastasis (Tsao, et al., 2004).
Tahap inisiasi adalah tahap pertama pada karsinogenesis dan merupakan
hasil perubahan genetik yang menuntun pada proliferasi tidak terkontrol
(abnormal) sebuah sel. Tahap inisiasi dapat terjadi melalui jalur germinal dan
somatik. Namun pada kebanyakan kasus diperoleh secara somatik akibat
terjadinya kesalahan acak saat pembelahan sel atau karena paparan dari
karsinogen spesifik seperti tobako dan radiasi. Pada tahap ini, senyawa yang
berpotensi sebagai senyawa karsinogen diaktivasi terlebih dahulu di dalam tubuh
terutama di hepar menjadi senyawa metabolitnya. Senyawa metabolit ini ada yang
bersifat reaktif, mutagenik, dan mampu berikatan dengan makromolekul di dalam
Universitas
Sumatera Utara
Utara
tubuh seperti DNA dengan ikatan irreversible. Sel yang mengalami inisiasi atau
prakanker dapat kembali ke tingkat normal secara spontan, tetapi pada tingkat
lebih lanjut dapat menjadi ganas (malignan) (King, 2000).
Selanjutnya tahap promosi yang merupakan tingkat lanjutan dari tahap
inisiasi. Pada tahap ini, sel mulai mengalami hiperplastik pada inti sel. Berbeda
dengan tahap inisiasi yang dapat melewati jalur germinal dan somatik, tahap
promosi hanya diketahui terjadi melalui jalur somatik. Pada tahap promosi, sel
akan memperoleh beberapa keuntungan selektif untuk tumbuh sehingga
pertumbuhannya menjadi cepat dan berubah menjadi tumor jinak. Tahap promosi
tidak melibatkan perubahan struktural dari genom secara langsung, tetapi biasanya
terjadi perubahan ekspresi gen yang terinisiasi (Tsao, et al., 2004; King, 2000).
Pada tahap progresi, kemampuan pembelahan yang tinggi menuntun
terbentuknya koloni sel yang lebih besar melalui perubahan genetik lebih lanjut
dan munculnya keistimewaan lain seperti peningkatan mobilitas dan angiogenesis.
Pada tahap ini, sel tumor dikatakan sebagai sel malignan. Pada fase ini juga akan
terjadi karsinoma dan metastasis melalui aktivasi onkogen dan malfungsi dari
enzim topoisomerase (King, 2000).
Tahap metastasis merupakan tahap akhir dalam karsinogenesis. Pada tahap
ini, sel kanker melakukan invasi ke jaringan lain di dalam tubuh melalui
pembuluh darah, pembuluh limpa, atau rongga tubuh. Sel malignan yang
bermetastasis ini masuk melalui basement membran menuju saluran limpoid. Sel
tersebut akan berinteraksi dengan sel limpoid yang digunakan sebagai inangnya.
Selanjutnya, sel kanker akan masuk ke jaringan lainnya membentuk tumor
sekunder dengan didukung kemampuan neoangiogenesis yang dimilikinya. Tahap
Universitas
Sumatera Utara
Utara
metastasis dapat berlangsung karena melemahnya ikatan antarsel yang disebabkan
oleh terdegradasinya CAMs (Cell-cell Adhesion Molecules) dan E-cadherin
sebagai molekul yang menjaga pertautan antarsel. Molekul tersebut diketahui
sudah sangat sedikit bahkan tidak ditemukan lagi pada sel kanker, sehingga proses
metastasis dapat terus terjadi (King, 2000).
2.2.2 Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan kanker yang menyerang jaringan epithelial
payudara, yaitu membran mukosa dan kelenjar sehingga kanker payudara
tergolong pada karsinoma. Kanker payudara merupakan kanker yang paling
umum diderita oleh wanita selain kanker serviks. Penyebab kanker payudara
sangat beragam, antara lain kerusakan pada DNA yang menyebabkan mutasi
genetik. Kerusakan ini dapat disebabkan oleh radiasi yang berlebihan. Selanjutnya
karena kegagalan immune surveillance dalam pencegahan proses malignan pada
fase awal, faktor pertumbuhan yang abnormal, dan malfungsi DNA repairs seperti
BRCA1, BRCA2, dan p53 (Torosian, 2002).
Kanker payudara terjadi ketika sel pada payudara tumbuh tidak terkendali
dan dapat menginvasi jaringan tubuh yang lain baik yang dekat dengan organ
tersebut maupun bermetastasis ke jaringan tubuh yang letaknya berjauhan. Semua
tipe jaringan pada payudara dapat berkembang menjadi kanker, namun pada
umumnya kanker muncul baik dari saluran (ducts) maupun kelenjar (glands).
Perkembangannya memerlukan waktu berbulan-bulan atau bertahun-tahun sampai
tumor tersebut cukup besar untuk dirasakan pada payudara. Deteksi dapat
dilakukan dengan mammogram yang kadang-kadang dapat mendeteksi tumor
sejak dini (Elwood, et al., 1993).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Peningkatan insidensi kanker payudara disebabkan oleh kegagalan terapi
terhadap kanker itu sendiri. Kegagalan ini diakibatkan oleh adanya multidrug
resistance (MDR) dan terjadi hingga 71% dibandingkan dengan faktor penyebab
lainnya (Mechetner, et al., 1998). Multidrug resistance atau resistensi obat ini
diakibatkan oleh adanya breast cancer resistance protein (BCRP) yang salah
satunya adalah P-glycoprotein (Pgp) (Imai, et al., 2005). Aktivasi Pgp dan
peningkatan ekspresinya dapat menurunkan efikasi dari beberapa agen
kemoterapi, seperti Taxol dan Doksorubisin (Mechetner, et al., 1998). Penekanan
aktivitas Pgp dan ekspresinya mampu meningkatkan efektivitas agen kemoterapi
(Zhou, et al., 2006).
Selain itu, paparan estrogen endogen yang berlebihan juga dapat
berkontribusi sebagai penyebab kanker payudara. Sekitar 50% kasus kanker
payudara merupakan kanker yang bergantung pada estrogen dan sekitar 30%
kasus merupakan kanker yang positif mengekspresi HER-2 berlebihan. Kedua
protein tersebut selain berperan dalam metastasis, juga berperan dalam
perkembangan kanker payudara (early cancer development) (Gibbs, 2000).
Proses metastasis kanker payudara diinisiasi oleh adanya aktivasi/ekspresi
berlebih beberapa protein, seperti Estrogen Reseptor (ER) dan c-erbB-2 (HER- 2)
yang merupakan protein predisposisi kanker payudara. Aktivasi reseptor estrogen
melalui ikatan kompleks dengan estrogen akan memacu transkripsi gen yang
mengatur proliferasi sel. Estrogen dapat memacu ekspresi protein yang berperan
dalam siklus sel seperti cyclin D1, CDK4, cyclin E, dan CDK2. Selain itu, aktivasi
reseptor estrogen mampu mengaktivasi beberapa onkoprotein yang berperan
dalam sinyal pertumbuhan, misalnya Ras, Myc, dan cycD1 (King, 2000). Aktivasi
Universitas
Sumatera Utara
Utara
protein ini mengakibatkan adanya pertumbuhan yang berlebihan melalui aktivasi
onkoprotein yang lain seperti P13K, AKT, Raf, ERK, dan MAP kinase (Hahn, et
al., 2002). Di lain pihak, kompleks estrogen dengan reseptornya juga akan
memacu transkripsi beberapa gen tumor suppressor, seperti BRCA1, BRCA2, dan
p53. Namun, pada penderita kanker payudara (yang umumnya telah lewat masa
menopause), gen tersebut telah mengalami perubahan (transformed) akibat dari
hiperproliferasi sel payudara selama perkembangannya sehingga tidak berperan
sebagaimana mestinya (Clarke, 2001; Ingvarsson, et al., 2002).
Beberapa jenis sel kanker payudara yang dapat dikultur adalah MCF-7, Ia-
270, BT-20, BT-474, BT-549, Colo-824, HBL-100, MA-CLS-2, MDA-MB-231,
MDA-MB-435S, MDA-MB-436, MB-MDA-468, MX-1, SK-BR-3, ZR-75-1, dan
T47D (Pao, et al., 1985; Anonim, 2014).
Banyaknya jenis sel kanker payudara ini akan memberikan hasil yang
berbeda pada setiap selnya. Perbedaan hasil ini akan memberikan peluang baru
untuk menyelidiki perkembangan yang terjadi pada resistensi obat pada pasien
dengan tumor payudara yang memiliki p53 termutasi (Schafer, et al., 2000).
2.2.2.1 Sel T47D
Sel T47D merupakan sel kanker yang mengekspresikan reseptor estrogen
atau yang biasa disebut ER positif serta mengekspresikan p53 yang telah termutasi
sehingga resisten terhadap mekanisme apoptosis (Ruddon, 2007; Junedi, et al.,
2010). Pada sel ini, p53 mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam
zincbinding domain L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat
mengikat response element pada DNA, maka akan mengurangi atau
menghilangkan kemampuannya dalam meregulasi siklus sel dan memacu
Universitas
Sumatera Utara
Utara
apoptosis. Sel ini dapat kehilangan estrogen reseptor (ER) apabila kekurangan
estrogen pada jangka waktu lama selama percobaan in vitro. Oleh karena itu, sel
ini digunakan pada model untuk penelitian resistensi obat pada pasien dengan
tumor payudara yang memiliki p53 termutasi (Abcam, 2007).
Sel T47D sering digunakan dalam penelitian kanker secara in vitro karena
mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas atau
cepat pertumbuhannya, memiliki homogenitas yang tinggi dan mudah diganti sel
baru yang telah dibekukan jika terjadi kontaminasi (Abcam, 2007). Sel T47D
memiliki mekanisme antiapoptosis dan karsinogenesis lebih kuat daripada sel
MCF-7. Beberapa protein yang terlibat dalam stimulasi pertumbuhan sel ini
termasuk caspase-3 subunit p12, protein nuklir Hcc-1, G1/S-specific cyclin-D3,
cathepsin B, protein CDV3 homolog, N (G), N(G)-dimethylarginine
dimethylaminohydrolase 2, dan prohibitin (Aka, et al., 2012).
2.2.2.2 Sel MCF-7
Sel MCF-7 adalah salah satu model sel kanker payudara yang banyak
digunakan dalam penelitian. Sel tersebut diambil dari jaringan payudara seorang
wanita Kaukasian berumur 69 tahun golongan darah O, dengan Rh positif, berupa
sel adherent (melekat) yang dapat ditumbuhkan dalam media penumbuh DMEM
atau RPMI yang mengandung foetal bovine serum (FBS) 10% dan antibiotik
Penicilin-Streptomycin 1% (Anonim, 2007). Sel MCF-7 memiliki karakteristik
antara lain resisten agen kemoterapi (Mechetner, et al., 1998), mengekspresikan
reseptor estrogen (ER +), overekspresi Bcl-2 (Butt, et al., 2000; Amundson, et al.,
2000) dan tidak mengekspresikan caspase-3 (Onuki, et al., 2003). Sel MCF-7
Universitas
Sumatera Utara
Utara
tergolong cell line adherent (ATCC, 2008) yang mengekspresikan reseptor
estrogen alfa (ER-α), resisten terhadap doksorubisin (Zampieri, et al., 2002).
2.2.3 Sel Vero
Sel Vero ATCC CCL-81 merupakan sel epitel non kanker (sel normal).
Sel ini berasal dari organ ginjal monyet hijau asal Afrika. Sel Vero merupakan sel
monolayer berbentuk poligonal dan pipih, immortal, non tumorigenic fibroblastic
cell. Sel ini melekat erat pada substrat yang berbahan polistirena dengan
membentuk ikatan kovalen. Pengujian sel Vero dilakukan untuk mempelajari
pertumbuhan sel, diferensiasi sel, sitotoksisitas, dan transformasi sel yang
diinduksi oleh berbagai senyawa kimia (Goncalves, et al., 2006).
2.2.4 P-glycoprotein
P-glycoprotein (Pgp) merupakan protein ABC-transporter pada manusia
yang termasuk dalam subfamili MDR/TAP (Allen, et al., 2002). Pgp dikenal
dalam beberapa sebutan, yaitu ABCD1, ATP-binding cassette sub-family B
member 1, MDR1, dan PGY1 (Choi, 2005). ABCD1 atau Pgp termasuk dalam
ATP dependent efflux pump yang memiliki substrat spesifik, antara lain: obat
(colchicines dan tacrolimus), agen kemoterapi (etoposide, adriamycin, dan
vinblastine), lipid, steroid, xenobiotik, peptide, bilirubin, cardiac glycoside
(digoxin), glucocorticoids (dexamethasone), dan agen terapi HIV tipe 1 (inhibitor
protease dan nonnucleoside reverse transcriptase) (Kitagawa, 2006). Di dalam
tubuh, Pgp dapat ditemukan pada sel usus, hati, tubula ginjal dan capillary
endothelial (Deng, et al., 2001).
P-glycoprotein adalah sebuah glikoprotein transmembran yang memiliki
10 - 15 kDa N-terminal glycosylation dengan bobot 170-kDa dikode oleh gen
Universitas
Sumatera Utara
Utara
MDR1 (Kitagawa, 2006). Gen ini dicirikan dengan pompa efflux obat dan anggota
dari keluarga ATP-binding transport (Choi., 2005). Dalam sistem organ, Pgp
berpengaruh terhadap absorbsi, distribusi, dan eliminasi obat. Kemampuan Pgp
sebagai efflux pump berguna dalam detoksifikasi senyawa-senyawa yang masuk
ke dalam sel. Senyawa yang termasuk substrat dari Pgp akan diikat dan
dikeluarkan dari dalam sel. Aktivitas Pgp sangat bergantung pada aktivasi Pgp
oleh ATP melalui pembentukkan kompleks Pgp-ATP (Conseil, et al., 1998).
Hidrolisis ATP oleh ATPase memberikan energi aktivasi pada Pgp (Choi, 2005).
Aktivasi Pgp akan menurunkan intake agen kemoterapi sehingga menurunkan
efikasi agen tersebut terhadap sel kanker. Pada kondisi ekspresi berlebihan, Pgp
dapat menyebabkan resistensi obat terutama agen kemoterapi pada jenis kanker
payudara seperti doksorubisin (Mechetner, et al., 1998). Pgp akan mengikat
doksorubisin sebagai salah satu substratnya untuk dikeluarkan dari dalam sel
(Wong, et al., 2006). Pgp atau ABCD1 pertama kali diujikan sebagai multidrug
resistance dan terbukti sebagai penyebab resistensi obat kemoterapi (Juliano, et
al., 1976).
Penghambatan aktivasi dan ekspresi Pgp memegang peranan penting
dalam keberhasilan terapi kanker (Zhou, et al., 2006). Penghambatan aktivitas Pgp
dapat melalui beberapa mekanisme, antara lain penghambatan substrat Pgp secara
langsung dengan berikatan pada Pgp-binding domain dan penghambatan
hidrolisis ATP oleh ATPase melalui ikatan substrat dengan ATP. Penghambatan
ini dapat dilakukan menggunakan senyawa flavonoid dan polifenol melalui dua
sisi ikatan pada ATP binding sites dan steroid interacting region dimana ATPase
berikatan dengan Pgp cytosolic domain (Kitagawa, 2006).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Deng, et al., (2001) melaporkan bahwa aktivasi NF-κB sebagai akibat
adanya stimulus dari lingkungan berupa stress, paparan agen sitotoksik, heat
shock, iradiasi, stress genotoksik, inflamasi, paparan sitokin, dan faktor
pertumbuhan dapat meningkatkan ekspresi Pgp. NF-κB yang aktif mampu
berikatan dengan promoter gen MDR1 sehingga proses ekspresi Pgp dapat
berjalan. Inaktivasi NF-κB mampu menghambat ekspresi Pgp.
2.3 Penanganan Kanker
Penanganan kanker ada dua macam, yaitu pencegahan dan penghambatan
kanker. Upaya pencegahan kanker disebut kemopreventif. Senyawa
kemopreventif dibagi menjadi dua kategori, yaitu blocking agent dan suppressing
agent. Blocking agent mencegah karsinogen mencapai target aksinya, baik melalui
penghambatan aktivasi metabolisme maupun menghambat interaksi dengan target
makromolekul seperti DNA, RNA, atau protein. Sedangkan suppressing agent
menghambat pembentukan malignan dari sel yang telah terinisiasi pada tahap
promosi atau progresi (Surh, 1999).
Kemopreventif dibagi menjadi tiga golongan, yaitu primer, sekunder, dan
tersier. Kemopreventif primer adalah mencegah terjadinya sel kanker sejak tahap
premalignan. Usaha pencegahan saat karsinogenesis pada tahap awal malignan
adalah kemopreventif sekunder. Sedangkan kemopreventif tersier adalah usaha
untuk meminimalkan resiko yang mungkin terjadi setelah terapi untuk malignan
primer. Upaya penyembuhan (kuratif) kanker, antara lain kemoterapi
menggunakan obat-obatan, seperti golongan siklofosfamid, methotreksat, dan 5-
flurourasil. Pada dasarnya kinerja obat-obatan tersebut sama, yaitu menghambat
proliferasi sel sehingga sel tidak jadi memperbanyak diri. Kemoterapi bisa
Universitas
Sumatera Utara
Utara
diberikan secara tunggal ataupun kombinasi dengan harapan bahwa sel-sel yang
resisten terhadap obat tertentu juga bisa merespon obat yang lain sehingga bisa
diperoleh hasil yang lebih baik. Dampaknya pada pasien biasanya rambut rontok,
selera makan menurun, serta rasa lemah dan letih (Sharma, 2000).
Terapi hormon digunakan untuk jenis kanker yang berkaitan dengan
hormon, misalnya kanker payudara (berkaitan dengan hormon estrogen) pada
wanita dan kanker prostat (berkaitan dengan hormon androgen) pada pria. Terapi
hormon pada dasarnya berusaha menghambat sintesis steroid sehingga sel tidak
dapat membelah. Terapi ini membawa dampak negatif bila diaplikasikan pada
wanita yang masih dalam usia subur karena dapat menghambat siklus menstruasi.
Radioterapi menggunakan sinar-X dengan dosis tertentu dapat merusak DNA dan
memaksa sel untuk berapoptosis. Efek negatif yang ditimbulkan hampir sama
dengan kemoterapi (Sharma, 2000; Wargasetia, 2005).
2.3.1 Terapi Kanker Payudara
Upaya penyembuhan kanker payudara dapat digolongkan secara
pembedahan, kemoterapi, terapi hormon, radioterapi, dan terapi gen (Sharma,
2000; Wargasetia, 2005).
Pada pertengahan abad-20 para klinisi menyadari bahwa tidak semua
kanker payudara memiliki prognosis dan membutuhkan tindakan pengobatan yang
sama. Penentuan stadium kanker payudara sangat penting sebagai panduan
pengobatan dan menentukan prognosisnya. Ada hubungan antara stadium kanker
dengan angka 10-year relative survival pada pasien kanker payudara. Terdapat
perbedaan yang signifikan diantara stadium kanker payudara. Sebanyak 5-12%
dari pasien stadium I/II meninggal dalam 10 tahun pertama setelah diagnosis
Universitas
Sumatera Utara
Utara
ditegakkan, dibandingkan pada pasien stadium III yang lebih dari 60%, dan lebih
dari 90% pada pasien stadium IV. Sistem staging kanker payudara juga
memberikan informasi tentang pilihan terapi yang sesuai berdasarkan stadiumnya.
(Rasjidi, 2010).
Klasifikasi tahapan kanker payudara pertama kali dikembangkan oleh
Pierre Denoix pada tahun 1942 dengan sistem Tumor-Nodus-Metastasis (TNM).
Pembagiannya berdasarkan morfologi tumor yang akan menentukan
prognosisnya; ukuran dari tumor (T), ada atau tidaknya keterlibatan kelenjar limfe
(N), dan adanya metastasis (M) (Rasjidi, 2010).
The international Union Against Cancer (UICC) mengeluarkan klasifikasi
tahapan kanker payudara yang baru berdasarkan pada sistem TNM pada tahun
1958 yaitu:
a. Stage 0 sel kanker payudara tetap didalam kelenjar payudara, tanpa invasi
ke dalam jaringan payudara yang berdekatan.
b. Stage I terdapat tumor dengan ukuran 2 cm atau kurang dan batas yang
jelas (kelenjar getah bening normal).
c. Stage IIA tumor tidak ditemukan pada payudara tapi sel-sel kanker
ditemukan di kelenjar getah bening ketiak, atau tumor dengan ukuran 2 cm
atau kurang dan telah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak/ aksiller,
atau tumor yang lebih besar dari 2 cm, tapi tidak lebih besar dari 5cm dan
belum menyebar ke kelenjar getah bening ketiak.
d. Stage IIB tumor dengan ukuran 2-5 cm dan telah menyebar ke kelenjar
getah bening yang berhubungan dengan ketiak, atau tumor yang lebih
besar dari 5 cm tapi belum menyebar ke kelenjar getah bening ketiak.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
e. Stage IIIA tidak ditemukan tumor di payudara, kanker ditemukan di
kelenjar getah bening ketiak yang melekat bersama atau dengan struktur
lainnya, atau kanker ditemukan di kelenjar getah bening di dekat tulang
dada, atau tumor dengan ukuran berapapun yang telah menyebar ke
kelenjar getah bening ketiak, terjadi pelekatan dengan struktur lainnya,
atau kanker ditemukan di kelenjar getah bening di dekat tulang dada.
f. Stage IIIB tumor dengan ukuran tertentu dan telah menyebar ke dinding
dada dan/atau kulit payudara dan mungkin telah menyebar ke kelenjar
getah bening ketiak yang terjadi perlengketan dengan struktur lainnya,
atau kanker mungkin telah menyebar ke kelenjar getah bening di dekat
tulang dada.
g. Stage IIIC ada atau tidak tanda kanker di payudara atau mungkin telah
menyebar ke dinding dada dan/ atau kulit payudara dan kanker telah
menyebar ke kelenjar getah bening baik di atas atau di bawah tulang
belakang dan kanker mungkin telah menyebar ke kelenjar getah bening
ketiak atau ke kelenjar getah bening di dekat tulang dada.
h. Stage IV kanker telah menyebar atau metastasis ke bagian lain dari tubuh
(Rasjidi, 2010).
Kemoterapi merupakan salah satu pengobatan yang bertujuan mematikan
ataupun memperlambat pertumbuhan sel kanker. Jenis agen kemoterapi yang
sering digunakan pada kanker payudara antara lain kemoterapi neoajuvan, ajuvan,
dan paliatif (Yudissanta and Ratna, 2012). Obat kemoterapi yang biasanya
diberikan dalam upaya penyembuhan kanker payudara ada dalam bentuk tunggal
Universitas
Sumatera Utara
Utara
dan kombinasi. Beberapa bentuk tunggal yang biasanya diberikan antara lain
docetaxel, taxol, dan doksorubisin (Mechetner, et al., 1998).
2.3.1.1 Doksorubisin
Doksorubisin merupakan golongan antibiotik antrasiklin sitotoksik yang
diisolasi dari Streptomyces peucetius var. caesius. Doksorubisin telah digunakan
secara luas untuk mengobati kanker payudara. Senyawa ini menunjukkan
kemampuan yang kuat dalam melawan kanker dan telah digunakan sebagai obat
kemoterapi kanker sejak akhir tahun 1960-an (Singal, et al., 1998).
Doksorubisin memiliki aktivitas antineoplastik dan spesifik untuk fase S
dalam siklus sel. Mekanisme aktivitas antineoplastiknya belum diketahui dengan
pasti. Mekanisme aksi doksorubisin kemungkinan melibatkan ikatan dengan DNA
melalui interkalasi di antara pasangan basa serta menghambat sintesis DNA dan
RNA. Kemungkinan mekanisme yang lain adalah melibatkan ikatan dengan lipid
membran sel yang akan mengubah berbagai fungsi selular dan berinteraksi dengan
topoisomerase II membentuk kompleks pemotong DNA (Yang, et al., 2014).
Gambar struktur kompleks doksorubisin-DNA dapat dilihat Gambar 2.4.
Keterangan: a. Ikatan kovalen doksorubisin dengan guanine pada satu untai DNA (warna
merah) dan ikatan hydrogen dengan guanine pada untaian yang berlawanan.; b.Struktur
interkalasi doksorubisin pada DNA
Gambar 2.4 Struktur kompleks doksorubisin-DNA (Yang, et al., 2014)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Doksorubisin telah digunakan pada beberapa pengobatan jenis tumor
seperti kanker payudara, esophagus, osteosarkoma, Kaposi’s sarkoma, sarkoma
jaringan lunak, limfoma Hodgkin, dan non-Hodgkin baik dalam aplikasi tunggal
maupun kombinasi dengan beberapa agen antitumor lainnya (Tyagi, et al., 2004).
Efek samping yang timbul segera setelah pengobatan dengan doksorubisin
adalah mual, imunosupresi, dan aritmia yang sifatnya revesibel serta dapat
dikontrol dengan obat-obat lain. Efek samping yang paling serius dalam jangka
waktu yang lama adalah hepatotoksik (Ekowati, et al., 2013) dan cardiomyopathy
yang diikuti dengan gagal jantung (Tyagi, et al., 2004). Berdasarkan hasil
penelitian restrospektif, diketahui bahwa toksisitas kardiak akibat pemberian
doksorubisin merupakan efek samping yang bergantung pada dosis. Mekanisme
yang memperantarai toksisitas kardiak tersebut diduga disebabkan oleh
terbentuknya spesies oksigen reaktif, meningkatnya kadar anion superoksida dan
pengurasan ATP yang kemudian menyebabkan luka jaringan kardiak (Fogli, et
al., 2004; Wattanapitayakul, et al., 2005). Permasalahan yang sering timbul pada
penggunaan doksorubisin dalam terapi kanker terutama kanker payudara adalah
resistensi obat yang menjadi penyebab kegagalan terapi. Pengeluaran obat yang
disebabkan oleh adanya pompa efflux Pgp menjadi salah satu penyebab utama
resistensi obat ini (Mechetner, et al., 1998).
Doksorubisin termasuk obat golongan antrasiklin yang merupakan substrat
Pgp. Doksorubisin akan dikenali oleh Pgp dan selanjutnya segera dikeluarkan dari
dalam sel sehingga menurunkan konsentrasi efektif doksorubisin dalam sel
kanker. Mekanisme pemompaan oleh Pgp sangat bergantung pada aktivasi protein
tersebut dan penekanan ekspresi Pgp. Oleh karena itu, inaktivasi Pgp dan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
penekanan ekspresinya mampu mengatasi permasalahan resistensi sel kanker
terhadap doksorubisin (Mechetner, et al., 1998; Zhou, et al., 2006; Wong, et al.,
2006).
2.3.1.2 Terapi Kombinasi
Terapi pengobatan kanker payudara pada umumnya menggunakan terapi
kombinasi (ko-kemoterapi) dengan obat/senyawa yang memiliki efek sinergis
terhadap sel kanker, bersifat spesifik, dan memiliki efek toksik seminimal
mungkin. Terapi kombinasi hingga saat ini dikembangkan secara empiris. Namun
sampai saat ini belum ada terapi pengobatan untuk kanker payudara yang telah
metastasis. Hal tersebut menuntut pengembangan cara pengobatan baru bagi
kanker payudara. Pemanfaatan senyawa alam yang non-toksik dengan efektivitas
tinggi melawan kanker dapat menjadi pilihan pengembangan terapi kombinasi
dengan agen kemoterapi (Tyagi, et al., 2004). Oleh karena itu, berbagai metode
dapat dilakukan untuk mengembangkan dan mengevaluasi kombinasi terapi yang
tepat.
2.4 Kelor
2.4.1 Uraian Umum
Kelor (Moringa oleifera L.) tumbuh dalam bentuk pohon, berumur
panjang (perenial) dengan tinggi 7 - 12 m. Batang berkayu (lignosus), tegak,
berwarna putih kotor, kulit tipis, permukaan kasar. Percabangan simpodial, arah
cabang tegak atau miring, cenderung tumbuh lurus dan memanjang. Perbanyakan
bisa secara generatif (biji) maupun vegetatif (stek batang). Tumbuh di dataran
rendah maupun dataran tinggi sampai di ketinggian ± 1000 m dpl, banyak ditanam
Universitas
Sumatera Utara
Utara
sebagai pagar di halaman rumah atau ladang (Krisnadi, 2015). Gambar pohon
kelor dapat dilihat pada Gambar 2.5.
Gambar 2.5 Pohon kelor
Kelor dikenal di seluruh dunia sebagai tanaman bergizi dan WHO telah
memperkenalkan kelor sebagai salah satu pangan alternatif untuk mengatasi
masalah gizi (malnutrisi). Di Afrika dan Asia daun kelor direkomendasikan
sebagai suplemen yang kaya zat gizi untuk ibu menyusui dan anak pada masa
pertumbuhan. Semua bagian dari tanaman kelor memiliki nilai gizi, berkhasiat
untuk kesehatan dan manfaat dibidang industri (Broin, 2010).
Tanaman kelor tidak hanya dapat tumbuh dan berkembang di India dan
Indonesia saja, tetapi juga di kawasan tropis lainnya di dunia. Kondisi lahan dan
pemeliharaan akan mempengaruhi kandungan unsur hara. Kandungan unsur hara
dalam tanaman berbeda-beda, tergantung pada jenis hara, jenis tanaman,
kesuburan tanah atau jenis tanah, dan pengelolaan tanaman (Kurniasih, 2013).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Kandungan nilai gizi yang tinggi, khasiat dan manfaatnya menyebabkan
kelor mendapat julukan sebagai Mother’s Best friendly and miracle tree. Namun
di Indonesia sendiri pemanfaatan kelor masih belum banyak diketahui, umumnya
hanya dikenal sebagai salah satu menu sayuran. Selain dikonsumsi langsung
dalam bentuk segar, kelor juga dapat diolah menjadi bentuk tepung atau powder
yang dapat digunakan sebagai bahan fortikan untuk mencukupi nutrisi pada
berbagai produk pangan (Krisnadi, 2015).
Ada beberapa sebutan nama untuk tumbuhan kelor di beberapa daerah di
Indonesia yaitu bahasa Sunda dan melayu kelor; di Sulawesi kelo, wori atau
keloro; di Madura maronggih; di Aceh murong; di Sumbawa kawona dan di
Minang disebut munggai (Krisnadi, 2015).
2.4.2 Sistematika Tumbuhan
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Kelas : Dicotyledoneaea
Ordo : Brassicales
Famili : Moringaceae
Genus : Moringa
Spesies : Moringa oleifera Lamk. (Krisnadi, 2015)
2.4.3 Daun Kelor
Daun majemuk, bertangkai panjang, tersusun berseling (alternate),
beranak daun gasal (imparipinnatus), helai daun saat muda berwarna hijau muda
setelah dewasa hijau tua, bentuk helai daun bulat telur, panjang 1 - 2 cm, lebar 1-2
cm, tipis lemas, ujung dan pangkal tumpul (obtusus), tepi rata, susunan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
pertulangan menyirip (pinnate), permukaan atas dan bawah halus. Merupakan
jenis daun bertangkai karena hanya terdiri atas tangkai dan helaian saja. Tangkai
daun berbentuk silinder dengan sisi atas agak pipih, menebal pada pangkalnya dan
permukaannya halus. Bangun daunnya berbentuk bulat atau bundar (orbicularis),
pangkal daunnya tidak bertoreh dan termasuk ke dalam bentuk bangun bulat telur.
Ujung dan pangkal daunnya membulat (rotundatus) dimana ujungnya tumpul dan
tidak membentuk sudut sama sekali, hingga ujung daun merupakan semacam
suatu busur (Krisnadi, 2015).
Susunan tulang daunnya menyirip (penninervis), dimana daun Kelor
mempunyai satu ibu tulang yang berjalan dari pangkal ke ujung, dan merupakan
terusan tangkai daun. Selain itu, dari ibu tulang itu ke arah samping keluar tulang-
tulang cabang, sehingga susunannya seperti sirip–sirip pada ikan. Kelor
mempunyai tepi daun yang rata (integer) dan helaian daunnya tipis dan lunak.
Berwarna hijau tua atau hijau kecoklatan, permukaannya licin (laevis) dan
berselaput lilin (pruinosus). Merupakan daun majemuk menyirip gasal rangkap
tiga tidak sempurna (Krisnadi, 2015). Gambar daun kelor dapat dilihat pada
Gambar 2.6.
Gambar 2.6 Daun kelor
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.4.4 Kandungan Bahan Aktif dalam Daun Kelor
Moringaceae kaya kandungan gula sederhana, rhamnose, dan senyawa
unik yaitu glukosinolat dan isotiotianat (Bennet et al., 2003). Beberapa kandungan
bahan aktif daun kelor adalah vitamin, carotenoid, polifenol, phenolic acid,
flavonoid, alkaloid, glukosinolat, isotiosianat, tannin, saponin, oksalat dan
phytates (Gambar 2.7).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Gambar 2.7 Struktur kimia kandungan aktif daun kelor (Leone, et al., 2015)
2.4.5 Manfaat dan Efek Farmakologi Daun Kelor
Kelor diakui sebagai tanaman bergizi yang bisa dikonsumsi untuk
mengatasi kelaparan karena memiliki kandungan nutrisi yang tinggi. Telah
dilaporkan bahwa dalam 100 gram daun kelor mengandung 12 kali vitamin C
dibanding jeruk, Vitamin A 10 kali dibanding wortel, protein 9 kali dibanding
Universitas
Sumatera Utara
Utara
yogurt, kalium 15 kali dari pada pisang, kalsium 17 kali daripada susu dan besi 25
kali daripada bayam (Karim, et al., 2016). Kandungan gizi ini sangat penting
peranannya dalam proses biokimia manusia dan hewan.
Ekstrak kelor telah digunakan sebagai bahan obat tradisional, tanaman ini
memiliki efek menguntungkan sebagai antiinflamasi, antifibrotik, antimikroba,
antioksidan, antihiperglikemia, antitumor dan antikanker (Abdull, et al., 2014).
Ekstrak kelor dapat digunakan untuk pengobatan demensia sebagai promoter
memori spasial dimana ekstrak daun dapat menurunkan aktivitas
asetilkolinesterase sehingga meningkatkan fungsi kolinergik dan memori
(Sutalangka, et al., 2013). Ekstrak kelor juga digunakan sebagai antidiabetes
(Divi,et al., 2012). Tanaman ini juga kaya akan fitosterol seperti stigmasterol,
sitosterol dan kampesterol yang merupakan prekusor hormon (Mutiara, et al.,
2013).
2.4.6 Penelitian terhadap Daun Kelor
Beberapa penelitian yang telah dilakukan terhadap daun kelor dapat dilihat
pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Daftar penelitian dari daun kelor

No Efek Ekstrak Cell line Mekanisme Referensi
Induksi apoptosis
Sreelatha et
1 Kemoprevensi Etanol Human Tumor dan menghambat
al., 2011
radikal bebas
Leukemia dan Menghambat Khalafalla et
2 Antitumor Etanol
hepatocarcinoma radikal bebas al., 2010
Induksi
Sitotoksik dan Hela dan Nair et al.,
3 Aqua fragmentasi dan
antikanker Lymphocyte 2011
apoptosis
Sitotoksik dan Hidroalkohol Hela, HepG2, Antiproliferasi sel Ghassami et
4
antikanker metanol Caco-2, MCF 7 kanker al., 2012
Penghambatan
mikronukleus
Sitotoksik dan eritrosit dan Rao et al.,
5 Metanol Tikus albino
antikanker aberasi pada 2001
metaphase
kromosom
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Menghambat Luqman et
6 Antioksidatif Etanol Tikus albino
radikal bebas al., 2012
Kanker pancreas Menghambat NF-
Berkovich et
7 Antiproliferasi Aqua (Panc-1), Colo KB Signaling
al., 2013
357 pathway
MDA MB 231, Antiproliferasi sel Ghosh et al.,
8 Antikanker Metanol
MCF 7 kanker 2013
Antioksidan dan HepG2, Caco-2, Antiproliferasi sel Charoensin
9 Diklorometan
antikanker MCF 7 kanker et al., 2014
Meningkatkan
GSH, CAT,
Kadar RBCs dan Kumar et al.,
10 Hepatoprotektif Metanol Tikus
menurunkan 2011
peroksidasi lipid
liver
Menghambat
radiasi yang
menginduksi lipid Sinha et al.,
11 Radioprotektif Etanol Tikus albino
peroksidasi dan 2011
meningkatkan
GSH
Penghambatan
translokasi NF-
KB dan Sinha et al.,
12 Radioprotektif Hidroalkohol Tikus albino
peroksidasi lipid, 2012
meningkatkan
SOD, CAT, GSH
Menurunkan
Fikriansyah
13 Kardioprotektif Etanol Tikus aktivitas peroksid
et al., 2015
radikal (ROS)
2.5 Target Molekular Terapi Herbal untuk Prevensi dan Terapi Kanker
Target dan mekanisme molekular herbal untuk prevensi dan terapi kanker
sedikit diketahui. Tumorigenesis adalah berbagai tingkatan yang mengaktifkan
karsinogen lingkungan, faktor inflamasi dan tumor promotor. Karsinogen akan
memodulasi faktor transkripsi (NF-κB, AP-1, STAT3), protein anti apoptosis
(Akt, Bcl-2, Bcl-XL), pro-apoptotis protein (caspase, PARP), protein kinase
(IKK, EFGR, HER2, JNK, MAPK), protein siklus sel (cyclin, cyclin dependent
kinase), cell adhesion molecules, COX-2 and Growth factor signaling pathways.
Nuclear factor-kappa B (NF-κB) adalah berhubungan dengan protein
dimmers yang berikatan dengan DNA disebut κB site. NF-κB berhubungan
dengan kanker, diaktivasi oleh radikal bebas, stimulus inflamasi, cytokines,
Universitas
Sumatera Utara
Utara
karsinogen, tumor promotor, endotoksin, radiasi, ultraviolet dan X-rays. Bila
terjadi aktivasi maka akan terjadi translokasi di nukleus, yang akan menginduksi
ekspresi lebih dari 20 gen yang akan menekan apoptosis dan menginduksi
transformasi sel, proliferasi, inflamasi, metastasis, kemoresisten, rasio resisten dan
inflamasi. Dimana gen tersebut akan menunjukkan terjadinya kanker termasuk
ekspresi cyclin D1, menekan apoptosis dengan meningkatkan protein Bcl-2 dan
Bcl XL serta menyebabkan terjadi angiogenesis dan metastasis (Park and Hong,
2016).
Siklus sel, diatur oleh cyclin dan cyclin dependent kinase, cyclin D1, Cdk-
4 dan Cdk-6. Gangguan dari pengaturan waktu, check point, dan over ekspresi
dari growth promoting cell cycle factor seperti cyclin D1 dan CDK akan
menyebabkan tumorigenesis. Beberapa phytochemicals menunjukkan
menghambat gangguan pada pengaturan siklus sel pada kanker (Hartono, 2009).
Apoptosis, menunjukkan menjadi keseimbangan secara alami antara sel
mati dan sel matur dengan menghancurkan sel yang rusak dan abnormal. Ekspresi
NF-κB, Bcl-2, Bcl-XL, cIAP, survivin, TRAF1 dan TRAF2 menyebabkan
menghambat jalur apoptosis. Beberapa phytochemical menunjukkan menghambat
aktivasi NF-κB atau AP-1 yang akan menekan proliferasi dan menginduksi
apoptosis (Hartono, 2009).
2.6 Metode Pengujian Aktivitas Antikanker dari Berbagai Tanaman obat
Pemanfaatan senyawa alam yang non-toksik dengan efektivitas tinggi
melawan kanker dapat menjadi pilihan pengembangan terapi kombinasi dengan
agen kemoterapi (Tyagi, et al., 2004). Oleh karena itu, berbagai metode dapat
dilakukan untuk mengembangkan dan mengevaluasi kombinasi terapi yang tepat.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Uji efek kombinasi dengan kedua metode tersebut biasanya dilakukan secara in
vitro. Metode uji in vitro dapat digunakan sebagai uji praklinik awal untuk
menggambarkan interaksi kombinasi, sehingga ketika dilakukan uji in vitro
hasilnya akan lebih efisien.
Pengujian aktivitas antikanker dapat dilakukan dari beberapa parameter,
antara lain uji sitotoksik, indeks selektivitas, analisis isobologram, combination
index (CI), pemacuan apoptosis dan siklus sel dengan metode flowcytometry, dan
pengujian ekspresi protein dengan metode imunositokimia (Kupscik, et al., 2011).
2.6.1 Uji Sitotoksik
Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur
sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetik, zat tambahan
makanan, pestisida dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas
antineoplastik dari suatu senyawa. Senyawa sitotoksik adalah senyawa yang
bersifat toksik pada sel tumor secara in vitro dan jika toksisitas ini ditransfer
menembus sel tumor in vivo senyawa tersebut mempunyai aktivitas antitumor
(Freshney, 2000).
Metode in vitro memberikan berbagai keuntungan dapat digunakan pada
langkah awal pengembangan obat, hanya membutuhkan sejumlah kecil bahan
yang digunakan untuk kultur sel primer manusia serta dapat memberikan
informasi secara langsung efek potensial pada sel target manusia serta uji yang
digunakan sangat sensitif dan dampak yang ditimbulkan dapat dilihat langsung.
Akhir dari uji sitotoksisitas pada organ target memberikan informasi tentang
perubahan yang terjadi pada fungsi sel secara spesifik (Doyle, et al., 2000).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.6.1.1 Uji Sitotoksik Menggunakan Metode MTT
Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan
pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme
suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini digunakan
garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan
direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium, yang
termasuk dalam mitokondria dari sel hidup (Kupcsik, 2011).
Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air
sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10% SDS
dalam HCl 0,01 N. Intensitas warna ungu terbentuk dapat ditetapkan dengan
spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif
melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel. Persentase
viabilitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Absorbansi sampel
% Viabilitas = x 100%
Absorbansi kontrol
2.6.2 Indeks Selektivitas
Nilai indeks selektivitas diperoleh dengan menggunakan sel yang berasal
dari ginjal monyet hijau afrika (sel Vero) menggunakan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-
yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT). Indeks selektivitas diperoleh dari
rasio IC50 sel Vero sel dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Nilai lebih
tinggi dari 3 menunjukkan bahwa obat atau ekstrak memiliki selektivitas yang
tinggi (Weerapreeyakul, et al., 2012).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.6.3 Indeks Terapi Kombinasi
Isobologram dan indeks kombinasi (IK) merupakan metode yang umum
digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat. Metode ini dikemukakan pertama
kali oleh Chou dan Talalay pada tahun 1984 (Zhao, et al., 2004).
Analisis isobologram mengevaluasi interaksi dua obat dengan jalan
menentukan terlebih dahulu konsentrasi efektif (IC50) dari masing-masing obat
ketika diaplikasikan sebagai agen tunggal kemudian diplotkan pada sumbu X dan
Y. Garis yang menghubungkan kedua titik disebut dengan garis aditif.
Selanjutnya, konsentrasi kombinasi kedua obat untuk menghasilkan efek yang
sama digambarkan pada plot yang sama. Efek sinergis, aditif atau antagonis
diindikasikan oleh letak titik plot tersebut, yaitu apakah (secara berurutan) di
bawah, pada atau di atas garis aditif (Zhao, et al., 2004).
Penentuan Combination index (CI) dapat dianalisis dengan menggunakan
Compusyn system version 1, metode ini adalah metode yang menggunakan
software untuk menentukan efek kombinasi 2 obat atau lebih apakah memberi
efek sinergis, aditif atau antagonis (Chou and Martin, 2004; Zhang, et al., 2016).
Interaksi antara dua obat dapat dianalisis dengan Combination Index (CI).
Analisis kombinasi menggambarkan efikasi dari kombinasi dengan
menggunakan persamaan sebagai berikut.
CI= (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2
CI adalah indeks kombinasi, Dx adalah konsentrasi dari satu senyawa
tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek, dalam hal ini adalah IC50
terhadap pertumbuhan sel kanker payudara. (D)1 dan (D)2 adalah besarnya
konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama. Nilai IK kurang,
Universitas
Sumatera Utara
Utara
sama atau lebih dari 1 mengindikasikan efek (secara berurutan) sinergis, aditif
atau antagonis. Combination Index (CI) yang diperoleh diinterpretasikan seperti
pada Tabel 2.2.
Tabel 2.2 Interpretasi nilai CI (Combination Index)
CI Interpretasi CI Interpretasi
<0,1 sinergis sangat kuat 0,9-1,1 mendekati additif

0,1-0,3 sinergis kuat 1,1-1,45 antagonis ringan-sedang
0,3-0,7 sinergis 1,45-3,3 antagonis
0,7-0,9 sinergis ringan-sedang >3,3 antagonis kuat-sangat kuat
Sumber: Reynolds, et al., (2005)
2.6.4 Flowcytometry
Pengujian siklus sel dan apoptosis menggunakan metode flowcytometry.
Flowcytometry adalah teknik yang digunakan untuk menghitung dan menganalisis
partikel mikroskopis yang tersuspensi dalam aliran fluida (Sayed, et al., 2009).
Prinsip dasar dari metode ini adalah berdasarkan fluoresensi. Suspensi sel atau
partikel yang hendak dianalisa disedot atau dialirkan. Aliran dikelilingi oleh fluida
yang sempit, sel akan melewati satu demi satu melalui sinar laser terfokus. Sinar
laser akan menyerang sel tersebut. Sel yang sesuai dengan cahaya laser dan
panjang gelombang yang tepat dapat dipancarkan kembali sebagai fluoresensi jika
sel mengandung zat alami fluorescent satu atau lebih fluorochrome-label
antibody melekat pada permukaan atau struktur internal sel. Penyerapan cahaya
tergantung pada struktur internal sel dan ukuran dan bentuknya. Cahaya
fluoresensi terdeteksi oleh serangkaian dioda. Filter optik berfungsi untuk
memblokir cahaya yang tidak diinginkan. Hasil data disimpan melalui komputer
(Givan, 2001). Flowcytometry dapat digunakan untuk menganalisa DNA content
Universitas
Sumatera Utara
Utara
sel melalui pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide (PI) atau 4’,6’-
diamino-2-phenylindole (DAPI). Dengan adanya fluorochrome yang memiliki
kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propidium iodide,
maka tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan
memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom
maka intensitas fluoresensi akan semakin besar. Untuk pengujian apoptosis,
ditambahkan antibodi Annexin V dan propidium iodida, sedangkan pengujian
siklus sel ditambahkan antibodi propidium iodida. Lalu diukur dengan alat
flowcytometer (Hostanska, et al., 2004). Flowcytometer atau FACS (Fluorescence
Activated Cell Sorting) digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel
(Givan, 2001). Skema alat flowcytometer ditunjukkan oleh Gambar 2.8.
Gambar 2.8 Skema alat flowcytometer
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.6.5 Imunositokimia
Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk
mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan
menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen.
Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode
tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat
warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak
langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung, kemudian
ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali
fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan
antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah
oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen) yang akan mewarnai
sel (CCRC, 2009).
Untuk menjamin antibodi agar dapat mengikat antigen, sel harus difiksasi
dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat sehingga antigen akan
immobile. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel pada slide
mikroskop, coverslip, atau bahan pendukung plastik yang sesuai. Ada dua macam
metode fiksasi, yaitu pelarut organik dan reagen cross-linking. Pelarut organik
seperti alkohol dan aseton akan memindahkan lipid, mendehidrasi sel, dan
mengendapkan protein. Reagen cross-linking seperti paraformaldehid
membentuk jembatan intermolekuler melalui gugus amino bebas (CCRC, 2009)
Imunositokimia melibatkan inkubasi sel dengan antibodi. Antibodi akan
berikatan dengan antigen atau protein spesifik di dalam sel. Antibodi yang tidak
berikatan dipisahkan dengan pencucian, sedangkan antibodi yang berikatan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
dideteksi secara langsung dengan antibodi primer berlabel, maupun secara tidak
langsung dengan antibodi sekunder berlabel enzim atau fluoresen (CCRC, 2009).
Keuntungan metode imunositokimia ini adalah hasil pemeriksaan cepat didapat
(24 jam), mudah, relatif murah, dan dapat digunakan untuk pemeriksaan sampel
dalam jumlah banyak (Abbas, et al., 2003).
2.7 Metode Ekstraksi
Ekstraksi atau penyarian merupakan proses pemisahan senyawa dari
matriks atau simplisia dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Metode ekstraksi
yang digunakan tergantung pada jenis, sifat fisik, dan sifat kimia kandungan
senyawa yang akan diekstraksi. Pelarut yang digunakan tergantung pada polaritas
senyawa yang akan disari, mulai dari pelarut yang bersifat non polar hingga polar
yang disebut dengan ekstraksi bertingkat (Hanani, 2017).
Tujuan ekstraksi adalah menarik atau memisahkan senyawa dari
campurannya atau simplisia. Ada berbagai cara ekstraksi yang telah diketahui.
Masing-masing cara tersebut memiliki kelebihan dan kekurangannya. Pemilihan
metode dilakukan dengan memperhatikan sifat senyawa, pelarut yang digunakan,
dan alat yang tersedia. Struktur untuk setiap senyawa, suhu, tekanan merupakan
faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan ekstraksi. Alkohol merupakan
salah satu pelarut yang paling banyak digunakan untuk menyari secara total.
Beberapa metode ekstraksi yang umum digunakan adalah sebagai berikut:
a. Maserasi
Maserasi adalah cara ekstraksi simplisia dengan merendam dalam pelarut
pada suhu kamar sehingga kerusakan atau degradasi metabolit dapat
diminimalisasi. Pada maserasi, terjadi proses keseimbangan konsentrasi
Universitas
Sumatera Utara
Utara
antara larutan di luar dan di dalam sel sehingga diperlukan penggantian
pelarut secara berulang. Maserasi kinetik adalah cara ekstraksi yang
dilakukan dengan pengadukan, sedangkan digesti adalah cara maserasi yang
dilakukan pada suhu yang lebih tinggi dari suhu kamar, yaitu 40-60°C.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah cara ekstraksi simplisia menggunakan pelarut yang selalu
baru, dengan mengalirkan pelarut melalui simplisia hingga senyawa tersari
sempurna. Cara ini memerlukan waktu lebih lama dan pelarut yang lebih
banyak dan untuk menyakinkan perkolasi sempurna perkolat dapat diuji
adanya metabolit dengan pereaksi yang spesifik.
c. Refluks
Refluks adalah cara ekstraksi dengan pelarut pada suhu titik didihnya selama
waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya
pendingin balik. Agar hasil penyarian lebih baik atau sempurna, refluks
umumnya dilakukan berulang-ulang (3-6 kali) terhadap residu pertama.
d. Sokletasi
Sokletasi adalah cara ekstraksi menggunakan pelarut organik pada suhu didih
dengan alat soklet. Pada metode ini simplisia dan ekstrak berada pada labu
berbeda. Pemanasan mengakibatkan pelarut menguap, dan uap masuk dalam
labu pendingin. Hasil kondensasi jatuh pada bagian simplisia sehingga
ekstraksi berlangsung terus-menerus dengan jumlah pelarut relatif konstan.
e. Infusa
Infusa adalah cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut air, pada suhu 96-
98°C selama 15-20 menit (dihitung setelah suhu 96°C tercapai). Bejana
Universitas
Sumatera Utara
Utara
infusa tercelup dalam tangas air. Cara ini sesuai untuk simplisia yang bersifat
lunak, seperti bunga dan daun.
f. Dekok
Dekok adalah cara ekstraksi yang mirip infusa, hanya saja waktu ekstraksinya
lebih lama yaitu 30 menit dan suhunya mencapai titik didih air.
g. Destilasi (penyulingan)
Destilasi adalah cara ekstraksi untuk menarik atau menyari senyawa yang ikut
menguap dengan air sebagai pelarut. Pada proses pendinginan, senyawa dan
uap air akan terkondensasi dan terpisah menjadi destilat air dan senyawa yang
diekstraksi. Cara ini umum digunakan untuk menyari minyak atsiri dari
tumbuhan (Hanani, 2017)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
2.8 Kerangka Teori Penelitian
Kultur Sel Kanker Doksorubisin

T47D/MCF7
Kultur Sel Kanker

NF-kB
T47D/MCF7
Bcl-2 Cyclin D1 Interkalasi Doxo-DNA
Bax Topoisomerase
Ekstrak II terhambat
etil
asetat Citochrom C Kompleks
Keluar dari Cyclin Sintesis
daun
sitoplasma D1-CDK 4/6 DNA/RNA
kelor
Kompleks
cytochrom
C-Apaf 1 Siklus sel Siklus sel
terhenti terhenti pada
pada fase fase S
Caspase 9 G1/S
Caspase 3 Proliferasi Proliferasi

sel sel
Apoptosis
bodies
Fagosit
Makrofag
Sel kanker
mati
Keterangan: menghambat
meningkatkan
Gambar 2.9 Kerangka teori penelitian
Universitas
Sumatera Utara
Utara
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui apakah
ekstrak n-heksan daun kelor (ENDK), ekstrak etil asetat daun kelor (EEADK),
ekstrak etanol daun kelor (EEDK) dan doksorubisin memiliki efek kombinasi
terhadap sel kanker payudara MCF-7 dan T47D. Tahap penelitian meliputi
identifikasi sampel atau bahan tumbuhan, pengumpulan dan pembuatan simplisia,
pembuatan pereaksi, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia simplisia dan
ekstrak, pembuatan ekstrak n-heksana (ENDK), etil asetat (EEADK) dan etanol
(EEDK) yang dilakukan di laboratorium Farmakognosi, Fakultas Farmasi,
Universitas Sumatera Utara, Medan. Pengujian efek sitotoksik ENDK, EEADK,
EEDK dan doksorubisin, pengujian indeks kombinasi ENDK, EEADK, EEDK
dengan doksorubisin, pengujian selektivitas terhadap sel Vero, pengujian
penghambatan siklus sel, pengujian apoptosis dengan metode flowsitometri dan
penekanan ekspresi protein Bcl-2 dan siklin D1 dilakukan di Laboratorium
Parasitologi, dan Laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran, Universitas
Gadjah Mada, Yogyakarta.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboratorium, autoclave, blender, conical tube, eksikator, Microplate reader, flow
cytometer, inverted microscope, laminar air flow, mikropipet, flask (wadah
kultur), hemositometer, alat penghitung, neraca kasar, neraca listrik, oven,
Universitas
Sumatera Utara
Utara
penangas air, rotary evaporator, sentrifugator, seperangkat alat penetapan kadar
air, cawan porselen, desikator, tanur, vortex.
3.1.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kelor. Bahan kimia
yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, yaitu α-
naftol, amonium hidroksida, asam asetat anhidrida, asam asetat pekat, asam
klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi (III) klorida,
kloralhidrat, bismut (III) nitrat, etanol, eter, etil asetat, n-heksana, iodium,
isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium
sulfat anhidrat, petroleum eter, raksa (II) klorida, serbuk magnesium, serbuk
zinkum, sodium hidrogen sulfat, timbal (II) asetat, toluena, air suling, dimethyl
sulfoxide (DMSO). Sel MCF-7, sel T47D dan sel Vero, doksorubisin, media
penumbuh Roswell Park Memorial Institute (RPMI), media penumbuh
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), media M199-serum, Fetal
Bovine Serum (FBS) 10% (v/v), penisillin-streptomisin 2% (v/v) dan Fungizone
(Amphoterisin B) 0,5%. Selain bahan-bahan di atas juga digunakan 0,25%
Tripsin-EDTA, Phospate Buffer Saline (PBS), MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-
2,5difeniltetrazolium bromida] dengan konsentrasi 5 mg/mL, sodium deodesil
sulfat (SDS) dalam HCl 0,1 N, Annexin V, propidium iodida, antibodi Bcl-2 dan
siklin D1.
3.2 Penyiapan Bahan Tumbuhan
3.2.1 Pengumpulan Bahan
Pengumpulan daun kelor dilakukan secara purposive, yaitu tanpa
membandingkan dengan daerah lain. Daun yang diambil sebagai sampel adalah
Universitas
Sumatera Utara
Utara
keseluruhan dari helaian daun tumbuhan pada urutan kelima dari pucuk daun yang
masih dalam keadaan baik, bersumber dari Kelurahan Bukit Batrem, Kecamatan
Dumai Timur, Provinsi Riau.
3.2.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanense (MEDA)
Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2.3 Pembuatan Simplisia Daun Kelor
Bahan yang digunakan adalah daun kelor yang masih segar. Daun
dipisahkan dari tangkainya lalu dicuci hingga bersih kemudian ditiriskan dan
ditimbang. Selanjutnya daun dikeringkan dalam lemari pengering dengan
temperature ± 40°C sampai kering. Simplisia yang telah kering diblender menjadi
serbuk lalu dimasukkan ke dalam wadah plastik bertutup dan disimpan pada suhu
kamar.
3.3 Pembuatan Pereaksi
3.3.1 Besi (III) klorida 1% b/v
Sebanyak 1 g besi (III) klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 mL
(Depkes, 1995).
3.3.2 Larutan asam klorida 2 N
Sebanyak 17 mL asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai
100 mL (Depkes, 1979).
3.3.3 Timbal (II) asetat 0,4 M
Timbal (II) asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling bebas CO2
hingga 100 mL (Depkes, 1995).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.3.4 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,36 g raksa (II) klorida, kemudian dilarutkan dalam air suling
hingga 60 mL. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu
dilarutkan dalam 20 mL air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan
air suling hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes, 1995).
3.3.5 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut (III) nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20
mL kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam
50 mL air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih
diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 mL (Depkes,
1995).
3.3.6 Larutan kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 mL
air suling (Depkes, 1979).
3.3.7 Larutan asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 mL asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga
diperoleh 100 mL (Depkes, 1995).
3.3.8 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya
kemudian ditambahkan 2 g iodida sedikit demi sedikit, cukupkan dengan air
suling sampai 100 mL (Depkes, 1995).
3.3.9 Pereaksi Liebermann-Burchard
Campur secara perlahan 5 mL asam asetat anhidrida dengan 5 mL asam
sulfat pekat (Depkes, 1995).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik,
mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan
penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam (Depkes, 1986; WHO, 1998).
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan memperhatikan morfologi
luar, rasa, dan tekstur dari daun kelor. Pemeriksaan mikroskopik dilakukan
terhadap serbuk simplisia daun kelor (Moringa oleifera L.). Serbuk simplisia
ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan
ditutup dengan deck glass kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.4.2 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi toluen).
Alat terdiri dari alas bulat 500 mL, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima 10 mL.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 mL toluena dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian di destilasi selama
2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian
volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL.
b. Penetapan kadar air simplisia
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 gram serbuk simplisia
yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah
toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian
Universitas
Sumatera Utara
Utara
besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume
air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air
dihitung dalam persen (WHO, 1998).
volume air (ml)

% Kadar air Simplisia = x 100%
Berat sampel (g)
3.4.3 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi
selama 24 jam dalam 100 mL air-kloroform (2,5 mL kloroform dalam air suling
sampai 1 liter) dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam
pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 mL filtrat
pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang
telah dipanaskan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap.
Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah
dikeringkan dengan rumus sebagai berikut: (Depkes, 1995).
Berat sari (g) 100

% Kadar sari larut dalam air = x x 100%
Berat sampel (g) 20
3.4.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL
etanol 96% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari
Universitas
Sumatera Utara
Utara
penguapan etanol. Sejumlah 20 mL filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan
pada suhu 105° C sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung
dalam persen terhadap bahan yang dikeringkan di udara dengan rumus sebagai
berikut: (Depkes, 1995)
Berat sari (g) 100

% Kadar sari larut dalam etanol = x x 100%
Berat sampel (g) 20
3.4.5 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan
dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar
perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600°C selama 3
jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar
abu dihitung dalam persen terhadap bahan yang dikeringkan di udara dengan
rumus sebagai berikut: (Depkes, 1995)
Berat abu (g)

% Kadar abu total = x 100%
Berat sampel (g)
3.4.6 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total, dididihkan
dalam 25 mL asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci
dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 600°C sampai
bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam
asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan dengan rumus sebagai berikut:
(Depkes, 1995).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Berat abu (g)
% Kadar abu tidak larut asam = x 100%
Berat sampel (g)
3.5 Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia
Penentuan golongan senyawa kimia skrining fitokimia dilakukan
pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida
antrakuinon (Depkes RI, 1995), saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid (Harborne,
1996).
3.5.1 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia/ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan
1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas penangas air
selama 2 menit, didinginkan, dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes
alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 mL filtrat.
Pada masingmasing tabung reaksi:
a. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer.
b. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat.
c. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan
di atas (Depkes, 1995).
3.5.2 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia/ekstrak ditambahkan 10 mL air panas,
dididihkan selama 5 menit, dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 mL
filtrate ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat dan 2
mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi
Universitas
Sumatera Utara
Utara
warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth,
1966).
3.5.3 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia/ekstrak ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30
mL campuran etanol 96% dengan air (7:3) dan 10 mL asam klorida 2 N, direfluks
selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 mL filtrat ditambahkan 25
mL air suling dan 25 mL timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran isopropanol dan kloroform (2:3),
dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 50° C. Sisanya dilarutkan dalam 2 mL metanol.
Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 mL larutan percobaan
dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas air. Pada sisa
ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Kemudian secara perlahan-
lahan ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya
cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan gula (Depkes,
1995).
3.5.4 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia/ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g, dimasukan ke dalam
tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak
kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N, menunjukan adanya saponin (Depkes, 1995).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.5.5 Pemeriksaan Tanin
Serbuk simplisia/ekstrak ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3
menit dalam 100 mL air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat
ditambahkan 1-2 tetes peraksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru
kehitaman atau hijau kehitaman, menunjukan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.5.6 Pemeriksaan Steroid/triterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia/ekstrak dimaserasi dengan 20 mL n-
heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada
sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya
warna biru atau biru hijau menunjukan adanya steroid, sedangkan warna merah,
merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1996).
3.5.7 Pemeriksaan Antrakuinon
Ditimbang sebanyak 0,2 g serbuk simplisia/ekstrak, ditambahkan 5 mL
asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 mL benzena,
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring, kocok lapisan
benzene dengan 2 mL NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan
lapisan benzena tidak berwarna menunjukan adanya antrakuinon (Depkes, 1995).
3.6 Pembuatan Ekstrak Daun Kelor
Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi bertingkat, yaitu serbuk
simplisia dengan perbandingan tertentu direndam dengan cairan penyari berturut-
turut n-heksan, etilasetat dan etanol 70%. Serbuk simplisia dimaserasi dengan
pelarut n-heksan sebanyak tiga kali, kemudian serbuk yang sama dimaserasi lagi
dengan pelarut etil asetat sebanyak tiga kali, dan terakhir serbuk tersebut
dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 70% sebanyak tiga kali.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Masukkan satu bagian serbuk kering simplisia ke dalam wadah maserasi,
ditambahkan 10 bagian pelarut, lalu direndam selama 6 jam pertama sambil
sekali-sekali diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam. Maserat dipisahkan
dengan cara dienaptuangkan dan disaring. Proses penyarian dilakukan sebanyak 3
kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan
kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh diperoleh ekstrak
kental (Depkes, 2008).
3.7 Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Kelor
Ketiga ekstrak kental terlebih dahulu dilarutkan dalam etanol 96%,
kemudian dilakukan skrining fitokimia terhadap masing-masing ekstrak. Prosedur
skrining fitokimia masing-masing ekstrak daun kelor dilakukan sama seperti
prosedur untuk pemeriksaan skrining fitokimia serbuk simplisia.
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini disterilkan
terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan
disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Lay, 1994).
3.9 Pembuatan Media
3.9.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L

glutamine tanpa NaHCO3, netto 10,4 g
Hepes 2g
NaHCO3 2g
HCl 1N secukupnya
NaOH 1N secukupnya
Aquabidest steril ad 1 L
Cara pembuatan: Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes, dan 2 gram
NaHCO3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabidest steril,
Universitas
Sumatera Utara
Utara
homogenkan dengan menggunakan stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH
meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan HCl 1N (bila larutan basa) atau
NaOH 1N (bila larutan asam), tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan
sterilisasi dengan filter vaccum di dalam LAF (Laminar Air Flow), dipasang filter
aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan
filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada
botol media (nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat),
dan disimpan pada suhu 2-8°C (Sambrook, et al., 1989).
3.9.2 Pembuatan Media Komplit RPMI (MK RPMI)
Komposisi: Fetal Bovine Serum (FBS) 10 %

Penisilin-Streptomisin 2%
Fungizone (Amphotericin B) 0,5 %
RPMI ad 100 mL
Cara pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam
LAF (Laminar Air Flow), beri identitas pada botol MK (nama media, tanggal
pembuatan, expire date, dan nama pembuat), simpan pada suhu 2 – 8°C
(Sambrook, et al,.1989).
3.9.3 Pembuatan Media Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
Komposisi: DMEM sachet 10,4 gram

Hepes 2 gram
NaHCO3 2 gram
HCl 1N secukupnya
NaOH 1N secukupnya
Aquabidest steril ad 1 liter
Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet DMEM, 2 gram Hepes dan 2 gram
NaHCO3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabidest steril,
homogenkan dengan menggunakan Stirer magnet. Ukur pH 7,2 – 7,4 dengan pH
meter, untuk menyesuaikan pH dapat digunakan asam klorida 1 N (bila larutan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
basa) atau natrium hidroksida 1 N (bila larutan asam) sehingga pH sesuai dengan
kondisi yang diharapkan tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan
sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF, dipasang filter aparatus steril pada
botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media
ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media (nama
media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat) dan disimpan pada
suhu 2 - 8oC (Sambrook, et al., 1989).
3.9.4 Pembuatan Media Komplit DMEM (MK DMEM)
Komposisi: Fetal Bovine Serum (FBS) 10%

Penisilin-Streptomisin 2%
Fungizone (Amphotericin B) 0,5%
DMEM ad 100 ml
Cara Pembuatan:Semua bahan di atas dicampur dan dilakukan di dalam
LAF, tiap botol MK diberi identitas (nama media, tanggal pembuatan, expire date
dan nama pembuat), disimpan pada suhu 2-8oC (Sambrook, et al., 1989).
3.9.5 Pembuatan Media M199
Komposisi: M199 sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 819942, dengan Earle’s
salt, dengan L-glutamine, tanpa NaHCO3, netto 9,5 gram
Akuabidest 1 liter
NaHCO3 2,2 gram
Hepes 2 gram
HCl 1 N secukupnya
NaOH 1 N secukupnya
Cara pembuatan: Sebanyak 1 sachet M199 sachet, 2,2 gram NaHCO3,
gram Hepes dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 mL
aquabidest steril dan dihomogenkan menggunakan stirer magnet. Diatur pH 7,2 –
7,4 dengan menggunakan pH meter. Penyesuaikan pH dilakukan dengan
menambahkan HCL 1 N (bila larutan basa) atau NaOH 1 N (bila larutan asam).
Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter
Universitas
Sumatera Utara
Utara
vaccum di dalam LAF (Laminar Air Flow). Dipasang filter aparatus steril pada
botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter,
aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol
media (nama media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat). Media
disimpan pada suhu 2 – 8°C (Handayani, et al., 2001).
3.9.6 Pembuatan Media Komplit M199 (MK M199)
Komposisi : Foetal Bovine Serum (FBS) 10 %

Penisilin-streptomisin 3%
Fungizone 1%
M199 ad 100 mL
Cara pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam
LAF (Laminar Air Flow), beri identitas pada botol MK (nama media, tanggal
pembuatan, expire date, dan nama pembuat), simpan pada suhu 2 – 8°C
(Handayani, et al., 2001).
3.10 Penumbuhan Sel
3.10.1 Penumbuhan Sel T47D
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 mL
media RPMI pada tabung konikel 15 mL, ambil ampul (sel T47D) dari freezer -
80°C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam
ampul, masukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI yang telah disiapkan,
sentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 mL
MK-RPMI dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 mL ke
dalam flask kultur baru. Tambahkan 5 mL MK-RPMI ke dalam masing-masing
flask kultur, dan homogenkan. Amati kondisi sel dengan menggunakan inverted
microscope. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur (tidak
Universitas
Sumatera Utara
Utara
menggerombol pada bagian tertentu). Beri identitas pada flask kultur, kemudian
simpan dalam inkubator CO2 (Doyle, et al., 2000).
3.10.2 Subkultur Sel T47D
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan
pengerjaan pada LAF. Proses panen sel T47D dilakukan dengan cara mengambil
500 Μl panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Tambahkan 6 mL MK-
RPMI, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO2, amati kondisi sel pada
keesokan harinya (Doyle, et al., 2000).
3.10.3 Panen Sel T47D
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi
sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80% konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Buang MK dari flask dengan mikropipet atau
pipet pasteur, cuci sel 3 kali dengan 5 mL PBS (Phosphate Buffer Salin),
tambahkan 400 μL Tripsin-EDTA 0,25% secara merata, kemudian inkubasi di
dalam inkubator CO2 selama ± 5 menit, dan tambahkan 4 mL MK untuk
menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-
satu (tidak menggerombol). Amati keadaan sel di inverted microscope.
Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol. Transfer sel ke
dalam tabung konikel (Doyle, et al., 2000).
3.10.4 Penumbuhan Sel MCF-7
Prosedur penumbuhan sel, subkultur sel dan panen sel MCF-7 dilakukan
sama seperti terhadap sel T47D.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
3.10.5 Penumbuhan Sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 mL
media M199 pada tabung konikel, ambil ampul dari freezer -80°C (sel Vero) atau
tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul,
masukkan tetes demi tetes ke dalam media M199 yang telah disiapkan, sentrifuge
pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 mL MK-M199
dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 mL ke dalam flask
kultur baru. Tambahkan 5 mL MK-M199 ke dalam masing-masing flask kultur,
dan homogenkan. Amati kondisi sel dengan menggunakan inverted microscope.
Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur (tidak menggerombol
pada bagian tertentu). Beri identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam
inkubator CO2 (Handayani, et al., 2001).
3.10.6 Subkultur Sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan
pengerjaan pada LAF. Lakukan proses panen sel Vero dengan cara mengambil
500 μL panenan sel Vero dan masukkan ke dalam flask kultur. Tambahkan 6 mL
MK-M199, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO2, amati kondisi sel pada
keesokan harinya (Handayani, et al., 2001).
3.10.7 Panen Sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi
sel Vero. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80% konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Buang MK-M199 (sel Vero) dari masing-masing
flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS
(Phosphate Buffer Saline), tambahkan 400 μL Tripsin-EDTA 0,25% secara
Universitas
Sumatera Utara
Utara
merata, kemudian inkubasi di dalam inkubator CO2 selama ± 5 menit, dan
tambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan
mikropipet agar sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol). Amati keadaan sel di
inverted microscope. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang
menggerombol. Transfer sel ke dalam tabung konikel (Handayani, et al., 2001).
3.10.8 Penghitungan Sel T47D, Sel MCF-7 dan Sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 μL
panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel di bawah
mikroskop dengan menggunakan counter. Hemositometer terdiri dari 4 kamar
hitung (A, B, C, dan D), setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak (Gambar 3.1).
Gambar 3.1 Hemositometer
Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap (mati) dan sel
yang berada di batas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel di batas
kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel per mL dengan rumus:
∑ sel A + ∑ sel B + ∑ sel C + ∑sel D

∑sel/mL = x 104
4
Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misalnya untuk menanam sel
pada tiap sumuran 96-well plate, maka jumlah total sel yang diperlukan adalah
1x104/sumuran x 100 sumuran (dibuat lebih) = 1x106 sel. Hitung volume panenan
sel yang diperlukan (dalam mL) dengan rumus:
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Jumlah total sel yang diperlukan
Volume panenan sel =
Jumlah sel terhitung/ml
Diambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian
tambahkan MK sampai total volume yang diperlukan (CCRC, 2009).
3.10.9 Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 10 mg dalam polytube, kemudian
dilarutkan dalam dimetilsulfoksida (DMSO) sebanyak 200 μL, divortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan Media komplit masing-
masing sel, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji
dengan konsentrasi 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5
μg/mL, 31,25 μg/mL dan 15,625 μg/mL semua pengenceran dilakukan dengan
menggunakan media komplit (MK) (CCRC, 2009).
3.11 Pengujian Sitotoksik
Pengujian sitotoksik meliputi pengujian terhadap sel Vero, sel T47D dan
sel MCF7 yang selanjutnya dikonversi ke dalam persen sel hidup dan dianalisis
dengan SPSS 24 lalu dihitung indeks selektivitasnya.
3.11.1 Pengujian Sitotoksik terhadap Sel Vero
Endapan sel Vero disuspensikan pada media M199 dan ditentukan
kerapatan sel sebesar 1 x 106 sel/mL. Suspensi sel dibagi ke dalam sumuran-
sumuran yang tiap sumuran sebanyak 100 μL suspensi dan kemudian
ditambahkan ke dalamnya larutan atau suspensi ekstrak sampel uji dalam berbagai
konsentrasi yang selanjutnya disebut sampel. Pada kontrol positif yang
ditambahkan adalah larutan doksorubisin juga dalam berbagai kadar sedangkan
pada kontrol negatif adalah media M199. Sampel diinkubasi sampai pertumbuhan
sel konfluen. Pada tiap sumuran ditambahkan 100 μL media kultur M199 dan 10
Universitas
Sumatera Utara
Utara
μL MTT (Sigma) konsentrasi 5 mg/mL. Sel diinkubasi kembali selama 4 – 6 jam
dalam inkubator CO2 5% bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen
stopper (SDS 10% dalam HCl 0,01 N), lalu plate dibungkus agar tidak tembus
cahaya dan dibiarkan selama satu malam pada suhu kamar. Serapan dibaca
dengan Microplate reader pada = 595 nm (Handayani, et al., 2001).
3.11.2 Pengujian Sitotoksik terhadap Sel T47D
Sel T47D ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh
kepadatan 1x104 sel/sumuran dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% bersuhu
37°C selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu
medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan ekstrak sampel uji
berbagai konsentrasi dengan co-solvent DMSO (Sigma) dan diinkubasi pada 37ºC
dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak
dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS (Sigma). Pada masing-masing sumuran,
ditambahkan 100 μL media kultur RPMI dan 10 μL MTT (Sigma) konsentrasi 5
mg/mL. Sel diinkubasi kembali selama 4 – 6 jam dalam inkubator CO2 5%
bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper (SDS 10% dalam
HCl 0,01 N), lalu plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama
satu malam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan Microplate reader pada
panjang gelombang 595 nm (Handayani, et al., 2001).
3.11.3 Pengujian Sitotoksik terhadap Sel MCF-7
Prosedur pengujian sitotoksik terhadap sel MCF7 sama seperti terhadap sel T47D.
3.12 Analisis Hasil
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Berdasarkan data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik, sel
dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan
rumus:
absorbansi sel perlakuan– absorbansi kontrol media

%Hidup = x100%
absorbansi kontrol media Sel − absorbansi kontrol media
Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan IC50 (konsentrasi yang
menyebabkan kematian 50% populasi sel) yang dianalisis dengan analisis probit
menggunakan SPSS (CCRC, 2009).
3.13 Indeks Selektivitas
Sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x

4
10 sel/sumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan
yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan
ekstrak pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO (Sigma) dan
diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam. Pada akhir
inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS (Sigma).
Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μL media komplit dan 10 μL
MTT (Sigma) 5 mg/mL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator
CO2 5%, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper (SDS 10% dalam
HCl 0,01 N), plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu
malam. Serapan dibaca dengan Microplate reader (Bencmark Bio Rad) pada
panjang gelombang 595 nm (Nugroho, et al., 2012).
Indeks selektivitas diperoleh dari rasio IC50 sel vero dibandingkan dengan
sel kanker yang diuji (sel T47D, sel MCF-7). Indeks selektivitas dihitung
menggunakan persamaan di bawah ini: (Weerapreeyakul, et al., 2012)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
IC50 Sel Vero
Indek Selektivitas =
IC50 Sel Kanker
3.14 Uji Kombinasi Ekstrak Etilasetat Daun Kelor dengan Doksorubisin

terhadap Sel T47D dan Sel MCF-7
Kultur sel yang digunakan dalam kondisi 70 – 80% konfluen untuk
dipanen. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji kombinasi adalah 1 x 104
sel/sumuran (1 x 104 sel/100 μL MK). Lalu dibuat pengenceran suspensi sel
sehingga konsentrasi sel akhir 1x104 sel/100 μL MK. Ditransfer sel ke dalam
sumuran, masing-masing 100 μL. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi sel
agar tetap homogen. Sebanyak 3 sumuran kosong disisakan untuk kontrol media.
Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Sel diinkubasikan
ke dalam inkubator selama 24 jam. Setelah sel normal kembali, segera buat seri
konsentrasi sampel dan agen kemoterapi (doksorubisin) untuk perlakuan. Seri
konsentrasi ekstrak terdiri dari 4 konsentrasi: ½; 3/8; 1/4; 1/8 IC50. Seri
konsentrasi doksorubisin terdiri dari 4 konsentrasi: ½; 3,8; 1/4; 1/8 IC50. Diambil
plate yang telah berisi sel dari inkubator. Media sel dibuang dengan cara
membalikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian plate ditekan secara
perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan. Sel dicuci dalam
sumuran dengan masing-masing 100 μL PBS. PBS dibuang, ditiriskan sisa cairan
dengan tisu. Pada kelompok perlakuan kombinasi, dimasukkan seri konsentrasi
sampel ke dalam sumuran masing-masing 50 μL dengan replikasi 3 kali (triplo),
kemudian ditambahkan seri konsentrasi doksorubisin untuk kombinasi masing-
masing 50 μL.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Pada kelompok perlakuan tunggal, dimasukkan seri konsentrasi sampel
atau doksorubisin ke dalam sumuran masing-masing 50 μL dengan replikasi 3 kali
(triplo), kemudian ditambahkan MK masing-masing 50 μL ke dalam sumuran.
Untuk kontrol sel, ditambahkan MK ke dalam sumuran yang berisi sel
masing-masing 100 μL dengan replikasi 3 kali (triplo). Untuk kontrol
media,ditambahkan MK ke dalam sumuran yang kosong (tanpa sel) masing -
masing 100 μLdengan replikasi 3 kali (triplo). Diinkubasi di dalam inkubator
CO2. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam
waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, diinkubasikan kembali selama 24 jam
(waktu inkubasi total 24 – 48 jam). Dibuat stok MTT 5 mg/mL dengan cara
penimbangan 50 mg serbuk MTT, dilarutkan dalam 10 μL PBS (dengan bantuan
vortex). Dibuat reagen MTT untuk perlakuan (0,5 mg/mL) dengan cara diambil 1
mL stok MTT 5 mg/mL dan diencerkan dengan MK ad 10 mL. Reagen ini dibuat
untuk 1 buah 96 well plate. Media sel dibuang lalu dicuci masing-masing dengan
100 μL PBS 1x. Ditambahkan 100 μL reagen MTT 0,5 mg/mL 100 μL ke setiap
sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel). Diinkubasikan sel selama 2 – 4 jam
di dalam inkubator sampai terbentuk kristal formazan yang ungu. Setelah 2 – 4
jam, kondisi sel diperiksa dengan inverted microscope. Jika formazan telah jelas
terbentuk, ditambahkan stopper SDS 10% dalam HCl 0,1 N. Plate dibungkus
dengan kertas atau alumunium foil dan diinkubasikan di tempat gelap dan suhu
kamar selama semalam. Keesokan harinya, plate di-shaker selama 10 menit untuk
melarutkan formazan. Microplate reader dihidupkan dan ditunggu proses
progressing hingga selesai. Pembungkus plate dibuka dan plate ditutup. Lalu
dimasukkan ke dalam microplate reader.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Dibaca absorbansi pada masing-masing sumuran dengan Microplate
reader dengan λ= 550 – 600 nm (λ= 595 nm) dengan cara tekan tombol START.
Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP dan Microplate reader
dimatikan. Setiap kali pembacaan di Microplate reader, dicatat di buku catatan
pemakaian Microplate reader. Presentase sel hidup dihitung (Nugroho, et al.,
2013), dari hasil persen hidup perlakuan tunggal dan kombinasi dianalisa
menggunakan Compusyn system versi 1 untuk menentukan nilai CI (Combination
index) (Zhang, et al., 2016).
3.15 Pengujian Kombinasi Ekstrak Etilasetat Daun Kelor dengan

Doksorubisin terhadap Apoptosis dan Siklus Sel dari Sel T47D dan
Sel MCF7
Pengujian apoptosis dan siklus sel menggunakan metode flow cytometry.
Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji apoptosis adalah sebanyak 1 x 106
sel/sumuran yang kemudian ditanam pada microplate 6 sumuran, lalu diinkubasi
selama 24 jam. Keesokan harinya sel ditambahkan sampel uji lalu diinkubasi
kembali selama 24 jam. Kemudian diambil media pada masing-masing sumuran
pada tiap konsentrasi lalu dimasukkan dalam tabung konikel 15 mL lalu media
dicuci 1 x dengan PBS dan dibuang. Ditambahkan 250 μL tripsin-EDTA 0,25%
pada tiap sumuran lalu diinkubasi selama 3 menit pada suhu 37°C (pastikan di
bawah mikroskop sel tidak menggerombol satu sama lain untuk mendapatkan
hasil yang maksimal). Setelah itu, ditambahkan 1 mL media kultur lalu media
ditampung pada tabung konikel 15 mL. Disentrifugasi dengan kecepatan 6000
rpm selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Lalu ditambahkan sebanyak 1
mL PBS kemudian media dipindahkan ke dalam tabung konikel 1,5 mL dan
disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit, setelah itu
Universitas
Sumatera Utara
Utara
supernatannya dibuang. Untuk pengujian apoptosis ditambahkan Annexin V dan
propidium iodida, sedangkan pengujian siklus sel ditambahkan propidium iodida.
Lalu diukur dengan alat flow cytometer (Hostanska, et al., 2004).
3.16 Pengujian Kombinasi Ekstrak Etilasetat Daun Kelor dengan

Doksorubisin dalam Penekanan Ekspresi Siklin D1 dan Bcl-2 terhadap
Sel T47D dan sel MCF7
Analisis penghambatan ekspresi protein Bcl-2 dan Siklin D1 menggunakan
metode imunositokimia. Sebelum sel T47D ditanam terlebih dahulu pada masing-
masing sumuran 24-well plate dimasukkan coverslip. Kemudian sel ditanam

5
dengan kepadatan 5 x 10 sel/sumuran), lalu diinkubasi selama 24 jam di dalam
inkubator CO2 5% lalu dibuang medium. Sel yang telah diinkubasi kemudian
ditambahkan larutan uji, doksorubisin dan kombinasinya dengan konsentrasi
masing-masing 1 kali IC50 dan ½ IC50. Pada kelompok kontrol, ditambahkan 1000
μl media kultur. Sel kembali diinkubasi selama 24 jam. Keesokan harinya larutan
uji dan media kultur dibuang. Kemudian dicuci dengan PBS 2 kali. Kemudian sel
di fiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit. Setelah itu coverslip di masing-
masing sumuran diangkat dengan pinset secara hati-hati dan diletakkan di atas
kaca objek lalu dicuci dengan PBS 2 kali, lalu cuci dengan aquadest lalu
keringkan, tambahkan blocking serum lalu simpan pada sumur kamar diamkan 15
menit, lalu tambahkan antibodi primer Bcl-2/siklin D1 diamkan 60 menit cuci
PBS 2 kali, tambahkan antibodi sekunder Bcl-2/siklin D1 lalu keringkan,
tambahkan larutan label dan cuci PBS 2 kali keringkan tambahkan campuran 1 :
100 DAB substrat lalu cuci dengan aquadest lalu genangi dengan hematoxicillin
dan divisualisasikan dengan reaksi warna. Ekspresi Bcl-2/siklin D1 diamati
menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang diamkan 10 menit. Ditambah etanol
Universitas
Sumatera Utara
Utara
absolut lalu tambahkan xylol dan tambahkan entelan. Mengekspresikan Bcl-
2/siklin D1 akan memberikan warna coklat/gelap sedangkan yang tidak akan
memberikan warna ungu/ biru (Sekti, dkk., 2010).
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan oleh Herbarium Medanense
(MEDA) Universitas Sumatera Utara adalah jenis Moringa oleifera L., suku
Moringaceae. Hasil identifikasi dan gambar daun dapat dilihat pada Lampiran 1
dan Lampiran 2.
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik daun kelor secara makroskopik dilakukan untuk
memperoleh identitas simplisia. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia daun
kelor adalah helaian daun berwarna hijau sampai hijau kecoklatan, berbentuk
bundar telur atau bundar telur terbalik, panjang 1 cm sampai 3 cm, lebar 4 mm
sampai 1 cm, ujung daun tumpul, pangkal daun membulat, tepi daun rata, dengan
tekstur permukaan daun licin serta berselaput licin. Hasil pemeriksaan
makroskopik simplisia daun kelor dapat dilihat pada Lampiran 2 .
Pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia secara mikroskopik dilakukan
untuk memperoleh identitas simplisia. Hasil pemeriksaan karakteristik serbuk
simplisia secara mikroskopik pada Lampiran 3 serbuk berwarna hijau muda,
terlihat adanya fragmen pengenal berupa rambut penutup terdiri dari 1 sel sampai
2 sel, fragmen epidermis atas, fragmen epidermis bawah dengan stomata tipe
Universitas
Sumatera Utara
Utara
anomositik, hablur kalsium oksalat berbentuk roset, fragmen berkas pembuluh
dengan penebalan tangga dan spiral.
Menurut Depkes (2000), standarisasi suatu simplisia dan ekstrak adalah
pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan obat dan menjadi penetapan nilai
untuk berbagai parameter produk. Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia daun
kelor terlihat pada Tabel 4.1 berikut:
Tabel 4.1 Hasil karakteristik simplisia daun kelor (SDK)

No Uraian Simplisia SDK (%)
1 Kadar air 5,32
2 Kadar sari larut air 32,78
3 Kadar sari larut etanol 14,42
4 Kadar abu total 10,67
5 Kadar abu tidak larut dalam asam 0,95
Hasil karakteristik SDK pada Tabel 4.1 menunjukkan bahwa hasil
pemeriksaan kadar air serbuk simplisia daun kelor (SDK) adalah 5,32%. Hasil
penetapan kadar air simplisia dari daun kelor memenuhi persyaratan dari buku
Materia Medika Indonesia, yaitu tidak melebihi 10% (Depkes, 1989). Tingginya
kandungan air menyebabkan ketidakstabilan sediaan obat, pertumbuhan bakteri
dan jamur, dan bahan aktif yang terkandung dapat terurai. Perubahan senyawa
kimia berkhasiat akibat aktivitas enzim karena enzim tertentu dalam sel masih
dapat bekerja menguraikan senyawa aktif setelah sel mati dan selama ekstrak
masih mengandung jumlah air tertentu (Depkes, 1986). Penetapan kadar air
dilakukan untuk memberikan batasan minimal kandungan air yang masih dapat
ditolerir di dalam simplisia dan ekstrak.
Hasil penetapan kadar sari yang larut dalam air dari simplisia sebesar
32,78%, hasil ini memenuhi syarat sesuai dengan yang tercantum di Materia
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Medika Indonesia yaitu kadar sari larut dalam air untuk simplisia daun kelor
adalah tidak kurang dari 5% (Depkes, 1989). Senyawa-senyawa yang dapat larut
dalam air adalah glikosida, gula, gom, protein, enzim, zat warna, dan asam
organik. Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol dari simplisia adalah
14,42%, hasil ini memenuhi syarat Materia Medika Indonesia yaitu tidak kurang
dari 5% (Depkes, 1989). Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol digunakan
untuk mengetahui kadar sari yang larut dalam pelarut polar. Senyawa-senyawa
yang dapat larut dalam etanol adalah glikosida, antrakuinon, steroid, alkaloid,
flavonoid, klorofil, dan dalam jumlah sedikit yang larut, yaitu lemak dan saponin
(Depkes, 1986).
Penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam dari serbuk
simplisia 10,67% dan 0,95%, hasil ini memenuhi syarat Materia Medika
Indonesia dimana untuk penetapan kadar abu total tidak lebih dari 11% dan kadar
abu tidak larut asam adalah tidak lebih dari 1% (Depkes, 1989). Tujuan penetapan
kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam adalah untuk memberikan
gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal
sampai terbentuknya simplisia (Depkes, 2000). Zat-zat ini dapat berasal dari
senyawa-senyawa oksida anorganik. Kadar abu total yang tinggi menunjukkan
adanya zat anorganik logam-logam (Ca, Mg, Fe, Cd, dan Pb) yang sebagian
mungkin berasal dari pengotor. Kadar logam berat yang tinggi dapat
membahayakan kesehatan sehingga perlu dilakukan penetapan kadar abu total dan
kadar abu tidak larut asam untuk memberikan jaminan bahwa simplisia tidak
mengandung logam berat tertentu melebihi nilai yang ditetapkan karena
berbahaya (toksik) bagi kesehatan (Suismono, et al., 2007).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
4.3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak
Skrining fitokimia terhadap SDK, ENDK, EEADK dan EEDK dilakukan
untuk mendapatkan informasi golongan senyawa metabolit sekunder yang
terdapat di dalamnya. Hasil skrining fitokimia SDK, ENDK, EEADK dan EEDK
dilihat pada Tabel 4.2 dan Tabel 4.3.
Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia daun kelor (SDK)

No Skrining Pereaksi Hasil (warna/ endapan)
1 Alkaloid Mayer (+) endapan putih
Bouchardat (+) kekeruhan kuning
Dragendorff (+) kekeruhan coklat
2 Flavonoid Mg + as. Klorida pekat (+) Jingga
3 Glikosida Molisch (+) cincin ungu
4 Saponin Air panas/ dikocok (+) busa
5 Tanin FeCl3 1% (+) hijau kehitaman
6 Steroid/triterpenoid Lieberman-Burchard (+) biru hijau
7 Antrakuinon Benzen-NaOH 2N (-) coklat
Tabel 4.3 Hasil skrining fitokimia ekstrak daun kelor

Ekstrak n- Ekstrak Ekstrak
No Skrining
Heksan etilasetat Etanol
1 Alkaloid + - -
2 Flavonoid - + +
3 Glikosida - + +
4 Saponin - + -
5 Tanin - + +
6 Steroid/Triterpenoid + + -
7 Antrakuinon - - -
Keterangan: (+) positif : mengandung golongan senyawa
(-) negatif : tidak mengandung golongan senyawa
Hasil pengujian skrining fitokimia simplisia menunjukkan adanya
senyawa alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tanin dan steroid pada daun kelor.
Hasil pengujian skrining fitokimia untuk masing-masing ekstrak menunjukkan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
golongan senyawa kimia yang ada pada ENDK adalah alkaloid, dan steroid.
EEADK mengandung golongan senyawa flavonoid, glikosida, saponin, tanin, dan
steroid. EEDK mengandung senyawa flavonoid, glikosida, dan tanin.
Alkaloid merupakan senyawa yang sangat penting pada tumbuhan dengan
genus Moringa dimana alkaloid yang mempunyai aktivitas sebagai antikanker.
Golongan alkaloid dapat menyebabkan kerusakan dan pengkerutan pada membran
sel sehingga komponen penyusun membran akan berubah dan proses fisiologi
membran akan terganggu (Karim, et al, 2016).
Flavonoid adalah senyawa fenil yang tersubstitusi derivat benzopyran
yang terdiri dari kerangka dasar C15 (C6-C3-C6). Beberapa tanaman yang
mengandung turunan flavonoid, telah digunakan sebagai pencegahan penyakit dan
agen terapeutik pada pengobatan tradisional di Asia selama ribuan tahun,
diantaranya sebagai antikanker (Huang, et al., 1998). Keberadaan flavonoid pada
EEADK dan EEDK menunjukkan kemungkinan pada ekstrak tersebut memiliki
efek antikanker. Ditemukan adanya senyawa kaempferol, kuersetin dan
isorhamnetin pada daun kelor, senyawa ini merupakan senyawa flavonoid yang
memiliki efek yang baik sebagai antikanker dimana berperan dalam menghambat
proliferasi sel dan menginduksi apoptosis sel (Obakan, et al., 2017).
Steroid adalah senyawa yang memiliki aktifitas antitumor yang tinggi
yang telah diuji melalui kemampuan untuk memblok nuclear factor-kappa B,
dimana Nf-KB ini dapat menghambat apoptosis, mengaktifkan transkripsi dan
angiogenesis (Petronelli, et al., 2009).
Glikosida yang terkandung dalam daun kelor yaitu glukosinolat dan
isotiosianat yang merupakan derivat glukosinolat memiliki efek antikanker
Universitas
Sumatera Utara
Utara
dimana senyawa ini menghambat aktivitas NF-kB (nuclear factor-kappa B) yang
berperan dalam proliferasi sel dan apoptosis sel (Brunelli, et al., 2010).
4.4 Ekstraksi
Ekstraksi serbuk simplisia dilakukan secara maserasi bertingkat dimulai
dari pelarut non polar hingga pelarut polar (n-heksana-etil asetat-etanol).
Pemisahan ini bertujuan untuk memisahkan senyawa kimia yang terdapat pada
daun kelor berdasarkan tingkat kepolarannya. Senyawa polar akan larut didalam
pelarut polar dan senyawa non polar akan larut dalam pelarut non polar.
Hasil ekstraksi dari 600 g serbuk simplisia daun kelor (SDK) diperoleh
ekstrak n-heksana (ENDK) sebanyak 20,098 g, ekstrak etil asetat (EEADK)
20,025 g dan ekstrak etanol (EEDK) 95,101 g. Penggunaan pelarut n-heksana
untuk menarik senyawa kimia non polar, seperti alkaloid, triterpenoid dan steroid
bebas. Pelarut etil asetat digunakan agar senyawa kimia yang bersifat semipolar
dan agak polar tersari di dalamnya, seperti flavonoid, glikosida, saponin,
antrakuinon glikosida dan tanin. Pelarut etanol untuk menarik senyawa yang
bersifat polar seperti glikosida dan saponin.
Flavonoid secara umum larut pada pelarut semipolar seperti etilasetat.
Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid lebih
mudah larut dalam air. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon,
flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah
larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform. Masing-masing ekstrak yang
diperoleh dilakukan uji sitotoksik terhadap sel MCF-7, sel T47D dan sel Vero dan
selanjutnya dilakukan penelitian secara komprehensif tentang aktivitas
kombinasinya dengan doksorubisin.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
4.5 Uji Sitotoksik Ekstrak
Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan
pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme
suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini digunakan
garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase, MTT akan
direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium, yang
termasuk dalam mitokondria dari sel hidup (Kupcsick, 2011). Perlakuan masing-
masing ekstrak dengan seri konsentrasi 1000 μg/mL; 500 μg/mL; 250 μg/mL; 125
μg/mL; 62,5 μg/mL; 31,25 μg/mL dan 15,625 μg/mL menunjukkan adanya
korelasi antara konsentrasi larutan uji dengan efek toksik yang ditimbulkan Pada
perlakuan dengan doksorubisin dengan seri konsentrasi 24,00 μg/mL, 12,00
μg/mL; 6,00 μg/mL; 3,00 μg/mL; 1,50 μg/mL; 0,75 μg/mL dan 0,375 μg/mL.
Grafik hasil pengujian sitotoksik masing-masing ekstrak terhadap masing-masing
sel yaitu terhadap sel MCF-7 dapat dilihat pada Gambar 4.1, terhadap sel T47D
pada Gambar 4.2 dan sel Vero pada Gambar 4.3, sedangkan untuk uji sitotoksik
doksorubisin ditunjukkan pada Gambar 4.4. Nilai viabilitas sel dari masing-
masing ekstrak dianalisis dengan SPSS 24 untuk menentukan nilai IC50 dari
masing-masing ekstrak terhadap sel MCF-7, sel T47D dan sel vero. Hasil IC50
masing-masing ekstrak yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.4.
Tabel 4.4 Hasil IC50 Ekstrak daun kelor terhadap Sel T47D, MCF-7 dan Sel Vero
IC50 ± SD (g/mL)
No. Nama Ekstrak
Sel T47D Sel MCF 7 Sel Vero
1 ENDK 1.053,76±24,05 367,73±23,58 842,57±28,13
2 EEADK 186,56±33,09 149,29±24,41 983,97±30,23
3 EEDK 2.738,89±21,35 1.604,22±18,34 3.994,90±11,97
4 Doksorubisin 1,40±1,98 5.80±7,25 251,09±9,65
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Viabilitas sel MCF-7
100.0
80.0
60.0
% Hidup
Ekstrak n-heksan
40.0
Ekstrak etilasetat
20.0 ekstrak etanol
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200
Konsentrasi (g/mL)
Gambar 4.1 Hasil viabilitas sel MCF-7
Viabilitas sel T47D

120.0
100.0
80.0
% Hidup
60.0
Ekstrak n-heksan
40.0
Ekstrak etil asetat
20.0
Ekstrak etanol
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200
Gambar 4.2 Hasil viabilitas sel T47D
Viabilitas sel Vero

120.0
100.0
80.0
% Hidup
60.0 Ekstrak n-Heksan

40.0 Ekstrak etil asetat
Ekstrak etanol
20.0
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200
Gambar 4.3 Hasil viabilitas sel Vero
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Uji sitotoksik Doksorubisin
70.0
60.0
50.0
% Hidup
40.0
30.0 Doksorubisin
20.0 terhadap sel MCF7
10.0 Doksorubisin
0.0 terhadap T47D
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
Konsentrasi g/ml
Gambar 4.4 Hasil uji sitotoksik doksorubisin
Hasil uji sitotoksik pada gambar 4.1; 4.2 dan 4.3 menunjukkan bahwa
semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka nilai viabilitas sel semakin rendah atau
semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka sel yang hidup semakin sedikit yang
berarti semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka akan semakin tinggi efek
sitotoksiknya terhadap sel kultur yang diuji.
Hasil uji sitotoksik perlakuan doksorubisin untuk sel MCF-7 dan sel T47D
yang pada gambar 4.4 menunjukkan bahwa sel T47D lebih sensitif terhadap
doksorubisin dibandingkan dengan sel MCF-7 hal ini disebabkan bahwa sel MCF-
7 adalah salah satu sel kanker payudara yang sudah resisten terhadap agen
kemoterapi (Mechetner, et al., 1998) sehingga sel ini kurang sensitif terhadap
doksorubisin oleh karena itu dibutuhkan konsentrasi yang lebih tinggi
dibandingkan dengan sel T47D.
Hasil IC50 masing-masing ekstrak yang ditunjukkan pada Tabel 4.4
diperoleh IC50 yang paling poten adalah ekstrak etilasetat daun kelor yaitu
terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC50 149,29±24,41 μg/mL dan hasil
pengujian sitotoksik EEADK terhadap sel T47D memberikan nilai IC50
Universitas
Sumatera Utara
Utara
186,56±33,09 μg/mL. Ekstrak dinyatakan poten jika mempunyai nilai IC50 kurang
dari 500 μg/mL (Machana, et al., 2011). Dari hasil pengujian dan perhitungan
nilai IC50 EEADK terhadap sel MCF-7 dan sel T47D, diperoleh hasil IC50 di
bawah 500 μg/mL. Ekstrak ini dapat menjadi agen ko-kemopreventif, sebagai
terapi tambahan yang dikombinasikan dengan obat kanker modern seperti
doksorubisin. EEADK adalah ekstrak paling poten sesuai dengan hasil skrining
fitokimia ekstraknya dimana EEADK mengandung metabolit sekunder yang lebih
banyak dibanding ekstrak yang lain yaitu flavonoid, glikosida, saponin, tanin, dan
steroid dimana senyawa ini telah diteliti memiliki aktivitas antikanker (Karim, et
al., 2016). Perlakuan selanjutnya diteruskan pada ekstrak yang paling poten yaitu
EEADK.
Sel MCF-7 adalah sel kanker payudara yang tergolong resisten terhadap
obat kemoterapi seperti doksorubisin dibandingkan dengan sel T47D. Hal ini
disebabkan karena pada sel MCF-7, Pgp diekspresikan tinggi sehingga sensitivitas
sel terhadap agen kemoterapi doksorubisin rendah (Wong, et al., 2006).
Kombinasi EEADK dengan doksorubisin diharapkan dapat meningkatkan
sensitivitas sel MCF-7 dan aktivitas sitotoksik doksorubisin serta dapat
menurunkan dosis doksorubisin pada pengobatan sehingga dapat mengurangi efek
samping doksorubisin. Sel T47D sering digunakan dalam penelitian kanker secara
in vitro karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak
terbatas atau cepat pertumbuhannya. Selain itu memiliki homogenitas yang tinggi
dan mudah diganti sel baru yang telah dibekukan jika terjadi kontaminasi.
Hasil uji sitotoksik doksorubisin dengan nilai IC50 5,8 μg/mL terhadap sel
MCF-7 dan 1,4 μg/mL terhadap sel T47D. Kombinasi doksorubisin dan EEADK
Universitas
Sumatera Utara
Utara
diharapkan dapat memberikan hasil yang sinergis sehingga dapat dikembangkan
sebagai obat antikanker.
4.6 Indeks Selektivitas
Penentuan nilai indeks selektivitas (IS), perlu diketahui IC50 sel Vero dan
IC50 sel MCF-7 serta sel T47D dengan menggunakan metode MTT. Indeks
selektivitas dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:
IC50 Sel Vero

Indeks Selektivitas =
IC50 Sel Kanker
Indeks selektivitas menunjukkan selektivitas sitotoksik (tingkat keamanan)
dari ekstrak terhadap sel kanker dibandingkan sel normal, yaitu dengan
membandingkan IC50 ekstrak terhadap sel normal dan IC50 ekstrak terhadap sel
kanker. Nilai indeks selektivitas ekstrak pada sel MCF-7 dan sel T47D dapat
dilihat pada Tabel 4.5.
Tabel 4.5 Nilai indeks selektivitas (IS) ekstrak daun kelor pada sel MCF-7 dan
sel T47D
Indeks selektivitas
No. Nama Ekstrak
Sel T47D Sel MCF 7
1 ENDK 0,80 2,29
2 EEADK 5,27 6,59
3 EEDK 1,46 2,49
Nilai indeks selektivitas masing-masing ekstrak ditunjukkan pada Tabel
4.5 yaitu ENDK terhadap T47D 0,80; terhadap MCF7 2,29; EEADK terhadap
T47D 5,27; EEADK terhadap MCF7 6,59; EEDK terhadap T47D 1,46 dan
terhadap MCF7 2,49. Ekstrak dikatakan memiliki selektivitas yang tinggi apabila
nilai IS lebih besar dari 3 sehingga ekstrak yang selektif terhadap sel kanker
MCF-7 dan sel T47D adalah ekstrak etil asetat daun kelor (Machana, et al., 2011).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
4.7 Uji Kombinasi EEADK-Doksorubisin terhadap Sel MCF-7
Salah satu ciri sel kanker adalah tidak sensitif terhadap sinyal
antiproliferasi oleh karena itu pengobatan penyakit kanker dengan obat modern
umumnya menggunakan dosis besar. Peningkatan dosis obat sitostatik
menimbulkan masalah karena semakin banyak sel normal yang terserang dan
mati. Selain itu peningkatan dosis dapat menyebabkan sel kanker cepat menjadi
resisten terhadap obat. Salah satu pendekatan yang sedang populer adalah
penggunaan kombinasi kemoterapi, dimana senyawa kemoprevensi yang bersifat
non toksis atau lebih tidak toksik dikombinasikan dengan agen kemoterapi untuk
meningkatkan efikasi dengan menurunkan toksisitasnya terhadap jaringan yang
normal (Junedi, et al., 2010).
Hasil pengujian EEADK terhadap sel MCF-7 diperoleh nilai IC50 149,29
μg/mL sedangkan perlakuan dengan doksorubisin menghasilkan penghambatan
pertumbuhan sel sebesar 50% dengan IC50 5,8 μg/mL. Uji kombinasi dilakukan
dengan perlakuan kombinasi EEADK-doksorubisin terhadap MCF-7. Seri kadar
EEADK-doksorubisin secara berturut-turut adalah 74,63; 55,97; 37,31; 18,66

3 1 1
μg/ml (EEADK dengan ½; /8; /4; /8 IC50) dan 2,9; 2,18; 1,45; 0,73 μg/mL
3 1 1
(doksorubisin dengan ½; /8; /4; /8 IC50). Hasil uji sitotoksik kombinasi EEADK-
doksorubisin dalam penentuan indeks kombinasinya dianalisa menggunakan
software Compusyn system version 1 (Zhang, et al., 2016). Hasil analisa data
indeks kombinasi (CI) EEADK-doksorubisin ditunjukkan pada Tabel 4.6.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Tabel 4.6 Nilai indeks kombinasi (CI) EEADK-doksorubisin terhadap sel MCF-7
EEADK Doksorubisin (ug/mL)
(µg/mL) 2,9 2,18 1,45 0,73
74,63 0,551 0,603 0,102 0,436
55,97 0,379 0,323 0,064* 0,341
37,31 0,265 0,189 0,039* 0,179
18,66 0,277 0,088* 0,023* 0,083*
Keterangan:
Indeks Kombinasi perlakuan kombinasi EEADK dengan doksorubisin terhadap
sel MCF-7, Dihitung menggunakan metode Compusyn system versi 1.
Hasil indeks kombinasi (CI) pada Tabel 4.6 menunjukkan perlakuan
kombinasi EEADK-doksorubisin memberikan efek sinergis sangat kuat (CI < 0,1)
terhadap sel MCF-7 dengan dosis optimum ekstrak-doksorubisin 18,66 μg/mL –

1 1
1,45 μg/mL ( /8 IC50 EEADK- /4 IC50 doksorubisin). Pada pengamatan morfologi
sel MCF-7 dapat diamati morfologi sel yang mati akibat perlakuan tunggal
ekstrak dan doksorubisin serta kombinasi keduanya. Efek sinergisme untuk semua
perlakuan kombinasinya dimungkinkan karena adanya kemampuan kombinasi
tersebut untuk mencegah resistensi obat akibat pompa efflux Pgp yang terjadi pada
sel kanker payudara MCF-7. Pencegahan resistensi obat dapat dilakukan dengan
penekanan terhadap aktivasi Pgp dan ekspresinya. Pgp berperan sebagai pompa
pengeluaran (efflux) untuk detoksifikasi senyawa-senyawa yang masuk ke dalam
sel. Ekspresi Pgp yang berubah akan menurunkan konsentrasi doksorubisin di
dalam sel melalui mekanisme efflux obat dari dalam sel. Akibatnya potensi
sitotoksik doksorubisin pada sel kanker berkurang (Wong, et al., 2006). Ekspresi
berlebihan dari P-gp, suatu transporter membran plasma yang mengantarkan agen
kemoterapi keluar dari sel, diduga berperan dalam timbulnya resistensi sel kanker
terhadap agen kemoterapi. Flavonoid yang merupakan suatu senyawa polifenol
dilaporkan mampu menghambat P-gp dengan mekanismenya yaitu menghambat
Universitas
Sumatera Utara
Utara
ikatan antara substrat dengan P-gp dan menghambat aktivitas ATPase sehingga
akan meningkatkan sensitivitas sel kanker terhadap agen kemoterapi (Kitagawa,
2006).
4.8 Uji Kombinasi EEADK-Doksorubisin terhadap sel T47D
Hasil pengujian EEADK terhadap sel T47D diperoleh nilai IC50 186,56
μg/mL sedangkan perlakuan dengan doksorubisin menghasilkan penghambatan
pertumbuhan sel sebesar 50% dengan IC50 1,4 μg/mL. Data tersebut
memperlihatkan efikasi EEADK dan doksorubisin sebagai agen tunggal.
Efek kombinasi EEADK dan doksorubisin terhadap pertumbuhan sel
T47D dianalisis dengan software Compusyn system version 1 untuk mengetahui
kemungkinan efek kombinasinya, yaitu apakah sinergis, aditif atau antagonis.
Seri konsentrasi EEADK-doksorubisin secara berturut-turut adalah 93,28; 69,96;

1 3 1 1
46,64; 23,32 μg/mL ( /2; /8; /4; /8 IC50 EEADK) dan 0,7; 0,525; 0,35 dan 0,175
1 3 1 1
μg/mL ( /2; /8; /4; /8 IC50 doksorubisin). Indeks kombinasi (CI) EEADK-
doksorubisin ditunjukkan pada Tabel 4.7.
Tabel 4.7 Nilai indeks kombinasi (CI) EEADK-doksorubisin terhadap sel T47D
EEADK Doksorubisin (ug/mL)
(µg/mL) 0,7 0,525 0,35 0,175
93,28 1,467 1,015 0,853 1,167
69,96 1,742 1,052 0,756 1,025
46,64 1,930 1,019 0,733 0,949
23,32 2,034 1,103 0,698* 0,800
Keterangan:
Indeks Kombinasi perlakuan kombinasi EEADK dengan doksorubisin terhadap
sel T47D, dihitung menggunakan metode Compusyn system versi 1.
Hasil indeks kombinasi (CI) pada Tabel 4.7 menunjukkan perlakuan
kombinasi ekstrak-doksorubisin memberikan efek sinergis (CI = 0,3-0,7) terhadap
sel T47D dengan dosis optimum ekstrak-doksorubisin 23,32 μg/mL – 0,35 μg/mL
Universitas
Sumatera Utara
Utara
1 1
( /8 IC50 EEADK- /4 IC50 doksorubisin), ada juga kombinasi memberi efek aditif
(CI = 0,9-1,1) dan antagonis (CI = 1,45-3,3). Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa kombinasi EEADK-doksorubisin sangat dipengaruhi oleh konsentrasi
EEADK dan doksorubisin yang diberikan. Pada pengamatan morfologi sel T47D
dapat diamati morfologi sel yang mati akibat perlakuan tunggal ekstrak dan
doksorubisin serta kombinasi keduanya.
Doksorubisin digunakan secara luas untuk terapi berbagai jenis kanker
namun penggunaannya dalam klinik dibatasi oleh timbulnya efek samping (Tyagi,
et al., 2004). Efek samping yang timbul segera setelah pengobatan dengan
doksorubisin adalah mual, imunosupresi dan aritmia yang sifatnya reversibel serta
dapat dikontrol dengan obat-obat lain. Efek samping yang paling serius akibat
pengobatan dengan doksorubisin dalam jangka waktu yang lama adalah
cardiomyopathy yang diikuti dengan gagal jantung (Singal, et al., 1998).
Mekanisme yang memperantarai toksisitas kardiak tersebut diduga disebabkan
oleh terbentuknya spesies oksigen reaktif, meningkatnya kadar anion superoksida
dan pengurasan ATP yang kemudian menyebabkan perlukaan jaringan kardiak.
Berdasarkan hasil penelitian restrospektif diketahui bahwa toksisitas
kardiak akibat pemberian doksorubisin merupakan efek samping sesuai dosis
(Wattanapitayakul, et al., 2005), dari hasil penelitian dapat ditunjukkan bahwa
EEADK sinergis dengan doksorubisin (CI = 0,3-0,7), sehingga diharapkan
aplikasi EEADK sebagai ko-kemoterapi dan mampu menurunkan dosis
doksorubisin yang dalam terapi kanker payudara selain toksis terhadap jaringan
normal doksorubisin juga diketahui mampu menyebabkan timbulnya resistensi sel
tumor terhadap obat.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
4.9 Uji Penghambatan Siklus Sel Terhadap Sel MCF-7
Akumulasi sel pada siklus sel merupakan salah satu target utama agen
antikanker. Pada penelitian ini pengamatan siklus sel dilakukan dengan metode
flowsitometri, dengan metode ini, dapat dilihat distribusi sel pada masing-masing
fase dalam siklus sel setelah perlakuan, sehingga dapat diperkirakan jalur
penghambatan EEADK serta kombinasinya dengan doksorubisin dalam
menghambat siklus sel. Fase-fase dalam siklus sel normal memiliki perbedaan
pada jumlah set kromosom yaitu fase G1 jumlah set kromosomnya adalah 2n.
Berlanjut pada fase S, jumlah set kromosomnya antara 2n dan 4n karena terjadi
proses replikasi sedangkan pada fase G2 dan M, replikasi telah sempurna
membentuk set kromosom 4n. Dengan adanya fluorochrome yang memiliki
kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propidium iodide maka
tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan
intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom maka
intensitas fluoresensi akan semakin besar. Alat yang digunakan untuk membaca
intensitas fluoresensi tiap sel pada penelitian ini adalah FACS (Fluorescence
Activated Cell Sorting) atau flowsitometer (Givan, 2001).
Pengujian siklus sel pada sel MCF-7 dengan metode flowsitometri
dilakukan dengan berbagai perlakuan. Diantaranya adalah kontrol ditunjukkan
pada Gambar 4.5, EEADK pada konsentrasi ½ IC50 yaitu 74,63 μg/mL
ditunjukkan pada Gambar 4.6, EEADK pada konsentrasi 1/10 IC50 yaitu 14,93
1
μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.7, EEADK-doksorubisin ( /8 IC50 EEADK dan
1
/4 IC50 doksorubisin yaitu 18,66 μg/mL dan 1,45 μg/mL) ditunjukkan pada
Universitas
Sumatera Utara
Utara
R1
Gambar 4.8, doksorubisin pada konsentrasi ½ IC50 yaitu 2,9 μg/mL ditunjukkan
GO-G1
pada Gambar 4.9. Profil penghambatan siklus sel MCF-7 Tabel 4.8 dibawah ini.
S-pha se G2-M
M1
Tabel 4.8 Distribusi sel MCF-7 setelah perlakuan dengan berbagai M5 konsentrasi
EEADK, doksorubisin dan kombinasi keduanya.
Fase sel (%)
Konsentrasi
G0 – G1 S G2 - M
Fil e: KS SS .00 1 Total Even ts: 2000 0
Kontrol X Pa rameter: FL2-A FL2-Area (L inea r) 47,64 19,94 32,12
EEADK Marke r ½Events
IC50 % Gated % Total Mean 63,77CV Media 18,44 n 17,58
All 200 00 100 .00 100 .00 375 .68 56.07 336 .00
EEADK IC 1/10 20850 1.0 4 1.0 4
M1 69,8993.74 16,13
69.76 47.50 13,43
GO-G1 686 8
Kb.EEADK- Dox (1/8 IC EEADK-
50 1/4 34.34
50
34.34
IC doxo) 200 .96
54,4810.32
R1 202 .00
18,16 27,62
S-pha se 298 1 14.90 14.90 294 .76 8.9 9 297 .00
Doksorubisin ½ IC
G2-M 569
501 28.46 28.46 383 .52
55,00 7.1 2 383 .00
30,00 15,00
M5 435 0 21.75 21.75 709 .62 25.67 666 .00
GO-G1
GO-G1
G2-M
S-pha se G2-M
M1
S-pha se
M5
Fil e: KS SS .00 1 Total Even ts: 2000 0

Fil e: 1 /2 EEADK MCF7 SS.00 3 Total Even ts: 2000 0
X Pa rameter: FL2-A FL2-Area (L inea r)
Marke r Events % Gated % Total Mean CV Media n
All 200 00 All 100 144
.00 01 100 .0047.25
100 .00 72.00236277
.08.00 0.030.31
0 255 .00
M1 GO-G1
166 69 686
83.34 183.3447.64 34.30 200
1.3 8 724 .58 .95 10.32
0.0 0 202 .00
GO-G1 S-pha
197 1 se 9.8287 6 2 9.819.94 14.36 8.6
6 211 .52 2943.15211 .00
9.0 2 296 .00
S-pha se G2-M 3.1462
620 0 6 3.132.12 23.13 8.7
0 303 .86 3814.04306 .00
6.9 4 380 .50
G2-M
Gambar 4.5 Gambaran siklus sel MCF-7 kontrol 634 3.1 7 3.1 7 384 .07 7.1 5 379 .00
M5 128 0.6 4 0.6 4 623 .15 27.20 552 .50
GO-G1 G2-M
S-pha se
Fil e: 1 /2 EEADK MCF7 SS.00 3 Total Even ts: 2000 0


All 302 0 100 .00 15.10 257 .37 27.30 223 .00
GO-G1 192 6 63.77 9.6 3 211 .44 8.4 4 211 .00
S-pha se 557 18.44 2.7 9 304 .19 8.5 8 307 .00
G2-M 531 17.58 2.6 6 380 .80 6.2 6 377 .00
Gambar 4.6 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi ½ IC50 EEADK
Universitas
Sumatera Utara
Utara
R1
GO-G1
G2-M
S-pha se
M1
M5
Fil e: KOMB MCF7 SS.001 Total Even ts: 2000 0


All 200 00 100 .00 100 .00 7.2 8 680 .05 0.0 0
M1 195 51 97.76 97.76 0.4 1 135 3.73 0.0 0
GO-G1 222 1.1 1 1.1 1 210 .86 10.40
R1 211 .00
S-pha se 73 0.3 6 0.3 6 302 .64 8.7 2 301 .00
G2-M 123 0.6 1 0.6 1 393 .71 7.4 8 388 .00
Gambar 4.7 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi 1/10 IC EEADK
M5 36 0.1 8 0.1 8 601 .42
50
27.79 529 .50
GO-G1 G2-M
S-pha se G2-M
M1 S-pha se
M5
Fil e: KOMB MCF7 SS.001 Total Even ts: 2000 0

Fil e: 1 /2 DOXO MCF7 SS.018 Total Even ts: 2000 0
X Pa rameter: FL2-A
Marke FL2-Area
r Events(L inea
%r)Gated % Total Mean CV Media n
All 391 100 .00 1.9 6 276 .42 29.97 242 .00
GO-G1 213 54.48 1.0 6 210 .65 10.26 211 .00
All 200 00 100 .00 100 .00 0.6 8 187 1.78 0.0 0
S-pha se 71 18.16 0.3 6 303 .39 8.6 6 301 .00
M1 199 77 99.89 99.89 0.3 0 146 6.94 0.0 0
G2-M 108 27.62 0.5 4 391 .95 7.3 8 385 .50
GO-G1 11 0.0 6 0.0 6 227 .91 9.3 5 229 .00
Gambar 4.8 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi 1/8 IC
S-pha se 5 0.0 3 0.0 3 313 .80 EEADK dan ¼
8.6 950 312 .00
G2-M 5 0.0 3 0.0 3 419 .00 7.1 1 410 .00
IC50 doksorubisin
M5 2 0.0 1 0.0 1 663 .50 12.26 663 .50
GO-G1
G2-M
S-pha se
Fil e: 1 /2 DOXO MCF7 SS.018 Total Even ts: 2000 0


All 20 100 .00 0.1 0 273 .90 27.33 248 .00
GO-G1 11 55.00 0.0 6 219 .82 11.17 217 .00
S-pha se 6 30.00 0.0 3 304 .83 10.77 310 .00
G2-M 3 15.00 0.0 1 410 .33 6.2 1 410 .00
Gambar 4.9 Gambaran siklus sel MCF-7 yang diberi ½ IC50 doksorubisin
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Analisis data dilakukan secara deskriptif, yaitu dengan membandingkan
antara perlakuan dengan kontrol. Analisis siklus sel dilakukan pada fase siklus sel
dimana terjadi akumulasi sel terbesar pada masing-masing perlakuan.
Hasil akumulasi sel terbesar pada fase G0-G1 ditunjukkan pada Tabel 4.8,
baik perlakuan EEADK tunggal dan kombinasi EEADK-doksorubisin maupun

1
doksorubisin tunggal yaitu EEADK ½ IC50 sebesar 63,77%, EEADK /10 IC50
sebesar 69,89%, doksorubisin ½ IC50 sebesar 55,00% dan kombinasi EEADK-
doksorubisin sebesar 54,48%. Apabila dibandingkan dengan kontrol, akumulasi
sel pada fase G0-G1 sebesar 47,64%. Persentase yang lebih tinggi dibanding
kontrol menunjukkan bahwa sel mengalami penghambatan dalam persiapan
materi DNA yang akan disintesis. Penghambatan pada siklus G0-G1 memungkinan
terjadi pemacuan apoptosis. Penghentian siklus sel pada fase G0-G1 memberi
kesempatan sel memperbaiki DNA yang rusak dan memberikan kesempatan pada
sel yang mengalami kerusakan untuk dikenali lalu dilanjutkan proses apoptosis.
Kontrol checkpoint sangat penting untuk menjaga stabilitas genomik. Kesalahan
pada checkpoint akan meloloskan sel untuk berkembang biak meskipun terdapat
kerusakan DNA atau replikasi yang tidak lengkap atau kromosom tidak terpisah
sempurna sehingga akan menghasilkan kerusakan genetik. Hal ini kritis bagi
timbulnya kanker, oleh karena itu, proses regulasi siklus sel mampu berperan
dalam pencegahan kanker (Ruddon, 2007).
Hambatan regulasi daur sel pada fase G0-G1 oleh EEADK terjadi melalui
penurunan level ekspresi siklin D1 (berdasarkan pengujian imunositokimia)
sehingga tidak terjadi aktivasi CDK4 dan CDK6 yang berakibat pada
penghambatan fosforilasi pRb (protein retinoblastoma), Rb yang tidak
Universitas
Sumatera Utara
Utara
terfosforilasi akan berikatan dengan faktor transkripsi E2F mengikat DNA dan
menghambat transkripsi gen yang produknya diperlukan untuk fase S siklus sel
sehingga sel tertahan di fase G1 atau terjadi G1arrest (King, 2000). Penghambatan
daur sel ini kemungkinan dapat juga disebabkan oleh kemampuan senyawa yang
terkandung dari EEADK meningkatkan ekspresi Protein p21 dan p27 akan
membentuk ikatan kompleks dengan siklin D dan Cyclin Dependent Kinase 4/6
(Cdk), sehingga akan menghambat posporilasi pRb (protein retinoblastoma). Hal
ini mengakibatkan E2F inaktif, hal ini berakibat pada terhentinya daur sel
(Obakan, et al., 2017; King, 2000). Penghentian siklus sel pada fase G0-G1
memberi kesempatan kepada sel untuk memperbaiki DNA yang rusak apabila
tidak bisa diperbaiki lanjut ke proses apoptosis.
Akumulasi siklus sel pada fase S ditunjukkan pada Tabel 4.8 untuk
1
perlakuan tunggal EEADK ½ IC50 sebesar 18,44%, EEADK /10 IC50 sebesar
16,13%, dan kombinasi EEADK-doksorubisin sebesar 18,16%, lebih kecil
dibandingkan dengan kontrol akumulasi sel pada fase S sebesar 19,94%.
Penurunan persentase dibanding kontrol menunjukkan bahwa EEADK tunggal
dan kombinasi tidak mencegah terjadinya sintesa DNA. Sedangkan doksorubisin
½ IC50 akumulasi sel pada fase S sebesar 30,00% lebih besar dari kontrol.
Hambatan regulasi siklus sel pada fase S oleh doksorubisin kemungkinan
terjadi karena doksorubisin menyebabkan interkalasi DNA dan menghambat
topoisomerase II sehingga menyebabkan terhambatnya replikasi DNA sel kanker
yang terjadi pada fase S, hal ini menyebabkan siklus sel tertahan di fase S (Yang,
et al., 2014).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Pada fase G2-M, akumulasi sel untuk perlakuan EEADK ½ IC50 sebesar
1
17,58%, EEADK /10 IC50 sebesar 13,43%, doksorubisin ½ IC50 sebesar 15,00%
dan kombinasi EEADK-doksorubisin sebesar 27,62% lebih kecil dibandingkan
dengan kontrol sel sebesar 32,12%. Penurunan persentase perlakuan tunggal dan
kombinasi dibanding kontrol kemungkinan disebabkan perlakuan dengan ekstrak
tidak dapat menurunkan ekspresi siklin B sehingga menunjukkan tidak ada
perbaikan DNA yang rusak (DNA repair) pada sel kanker (Dipaola, 2002).
4.10 Uji Penghambatan Siklus Sel Terhadap Sel T47D
Pengujian siklus sel pada sel T47D dengan metode flowsitometri
dilakukan dengan berbagai perlakuan. Diantaranya adalah kontrol ditunjukkan
pada Gambar 4.10, EEADK pada konsentrasi ½ IC50 yaitu 93,28 μg/mL
ditunjukkan pada Gambar 4.11, EEADK pada konsentrasi 1/10 IC50 yaitu 18,66
1
μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.12, EEADK-doksorubisin ( /8 IC50 EEADK
1
dan /4 IC50 doksorubisin yaitu 23,32 μg/mL dan 0,35 μg/mL) ditunjukkan pada
Gambar 4.13, doksorubisin pada konsentrasi ½ IC50 yaitu 0,7 μg/mL ditunjukkan
pada Gambar 4.14. Profil penghambatan siklus sel T47D Tabel 4.9 dibawah ini.
Tabel 4.9 Distribusi sel T47D setelah perlakuan dengan berbagai konsentrasi
EEADK, doksorubisin dan kombinasi keduanya.
Fase sel (%)
Konsentrasi
G0 – G1 S G2 - M
Kontrol 43,84 23,86 32,36
EEADK ½ IC50 52,34 24,33 23,57
EEADK 1/10 IC50 55,04 27,26 18,07
Kb.EEADK- Dox (1/8 IC50EEADK-1/4 IC50doxo) 54,49 20,34 25,43
Doksorubisin ½ IC50 50,64 25,51 23,35
Universitas
Sumatera Utara
Utara
All 200 00 100 .00 100 .00 298 .47 45.27 285 .50
M1 123 0 6.1 5 6.1 5 34.43 137
R1.68 12.00
GO-G1 770 2 38.51 38.51 217 .18 8.9 6 214 .00
S-pha se 416 1 20.80 20.80 307 .11 8.7 7 307 .00
G2-M 601 9 30.09 30.09 388 .74 5.7 2 387 .00
M5 100 2 5.0 1 5.0 1 671 .17 25.24 631 .50
GO-G1
GO-G1
G2-M
S-pha se G2-M
M1
S-pha se
M5
Fil e:
Fil e: 1 /2 EEADK KS 1SS.004
T47D T4 7D SS.0 02 Total0Even ts: 2000 0
Total Even ts: 2000
X Pa rameter: X Pa rameter:
FL2-A FL2-AreaFL2-A FL2-Area
(L inea r) (L inea r)
Marke%
Marke r Events r Gated
Events% Total
% GatedMean% TotalCVMeanMedia nCV Media n
All 200 00 All 100 .00
170 34 100 .00
100 .00 85.1766.25
332 .97 R1
292 .29
284 26.56 280 .00
.00
M1 GO-G1
208 3 10.42746 810.4243.8423.16
37.34 216 .06 8.0 0 8.4 8 213 .00
158 .22
GO-G1 S-pha
695 6 se 34.78 406 434.7823.86 20.3210.71
209 .73 302 .04
207 .50 8.8 4 302 .00
S-pha se 330G2-M
8 16.54551 216.5432.36 27.56 8.3386
301 .18 0 .04301 .00 5.8 2 385 .00
G2-M 402 3 20.11 20.11 386 .61 7.7 5 383 .00
Gambar 4.10 Gambaran siklus sel T47D kontrol
M5 374 0 18.70 18.70 704 .67 25.91 649 .00
GO-G1
GO-G1 G2-M
S-pha se
M1 G2-M
S-pha se M5
Fil e: 1 /10 EKS Fil

T47 e:D
1 /2SS.00
EEADK3 T47D SS.004 Total Even ts: Total
2000 0Even ts: 2000 0
X Pa rameter:
X Pa rameter: FL2-A FL2-Area FL2-A FL2-Area
(L inea r) (L inea r)
Marke%r Gated
Marke r Events Events % Gated
% Total % TotalCVMeanMediaCV
Mean n Media n
All 200 00 All100 .00
132 01 100 .00
100 .00 66.0083.35
214 .59 271 .37 27.61 251 .00
216 .00
M1 GO-G1
655 0 32.75690 932.7552.3421.1434.54 209 .67 9.010.67
153 .98 0 207 .00
GO-G1 S-pha
662 9 se33.15321 233.1524.33 16.06 9.8
216 .77 300
7 .80
215 .008.2 9 301 .00
S-pha se 328 G2-M
0 16.40311 216.4023.57 15.56 9.0
304 .10 379
6 .46
303 .006.7 5 377 .00
G2-M 242 3 12.12 12.12 387 .25 6.9 3 381 .00
Gambar 4.11 Gambaran siklus sel T47D yang diberi ½ IC EEADK
M5 122 8 6.1 4 6.1 4 663 .15
50
25.89 617 .00
GO-G1
G2-M
S-pha se
Fil e: 1 /10 EKS T47 D SS.00 3 Total Even ts: 2000 0


All 115 48 100 .00 57.74 268 .48 25.72 246 .00
GO-G1 635 6 55.04 31.78 215 .51 9.4 4 214 .00
S-pha se 314 8 27.26 15.74 298 .61 9.0 8 297 .50
G2-M 208 7 18.07 10.44 381 .73 6.6 8 376 .00
Gambar 4.12 Gambaran siklus sel T47D yang diberi 1/10 IC50 EEADK
Universitas
Sumatera Utara
Utara

All 200 00 100 .00 100 .00 98.35 179 .83 12.00
M1 151 50 75.75 75.75 16.71 161 .99 7.0 0
GO-G1 217 0 10.85 10.85 209 .29 11.65 212 .00
R1
S-pha se 819 4.0 9 4.0 9 302 .85 7.9 9 305 .00
G2-M 107 0 5.3 5 5.3 5 392 .93 7.8 2 391 .00
M5 817 4.0 8 4.0 8 732 .84 25.78 684 .00
GO-G1
GO-G1
G2-M
S-pha se G2-M
M1 S-pha se
M5
Fil e: KOMB 1 T47D SS.005 Total Even ts: 2000 0

Fil e: 1 /2 DOXO T4 7D SS.0 06 Total Even ts: 1848 0
MarkeFL2-Area
X Pa rameter: FL2-A r Events(L inea
% Gated
r) % Total Mean CV Media n
All 333 8 100 .00 16.69 276 .59 28.38 241 .50
Marke r Events GO-G1 % Gated 181%9 Total54.49
Mean 9.1 0 CV213 .38 Media n9.3 5 214 .00
All 184 80 se100 .00679
S-pha 100 .0020.34
108 .943.4 0
137304
.23 .04 33.007.8 6 307 .00
M1 130 77
G2-M 70.7684970.7625.4326.934.2 5151388 .52 .91 4.0 07.3 4 387 .00
GO-G1 255 4 13.82 13.82 215 .31 10.14 215 .00
Gambar 4.13 Gambaran siklus sel T47D yang diberi 1/8 IC EEADK dan ¼ IC
S-pha se 130 0 7.0 3 7.0 3 306 .44 508.8 2 306 .00 50
doksorubisin G2-M 120 5 6.5 2 6.5 2 392 .38 6.9 1 390 .00
M5 391 2.1 2 2.1 2 646 .34 27.70 588 .00
GO-G1
G2-M
S-pha se
Fil e: 1 /2 DOXO T4 7D SS.0 06 Total Even ts: 1848 0


All 460 3 100 .00 24.91 279 .29 27.56 255 .00
GO-G1 233 1 50.64 12.61 214 .47 9.5 1 215 .00
S-pha se 117 4 25.51 6.3 5 301 .45 8.9 9 300 .00
G2-M 107 5 23.35 5.8 2 388 .49 6.9 8 386 .00
Gambar 4.14 Gambaran siklus sel T47D yang diberi ½ IC50 doksorubisin
Analisis data dilakukan secara deskriptif, yaitu dengan membandingkan
antara perlakuan dengan kontrol. Analisis siklus sel dilakukan pada fase siklus sel
dimana terjadi akumulasi sel terbesar pada masing-masing perlakuan.
Akumulasi sel terbesar pada fase G0-G1 ditunjukkan pada Tabel 4.9 yaitu
baik perlakuan EEADK tunggal dan kombinasi EEADK-doksorubisin maupun

1
doksorubisin tunggal yaitu EEADK ½ IC50 sebesar 52,34%, EEADK /10 IC50
sebesar 55,04%, doksorubisin ½ IC50 sebesar 50,64% dan kombinasi EEADK-
doksorubisin sebesar 54,49% apabila dibandingkan dengan kontrol dengan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
akumulasi sel pada fase G0-G1 sebesar 43,84%. Persentase yang lebih tinggi
dibanding kontrol menunjukkan bahwa sel mengalami penghambatan dalam
persiapan materi DNA yang akan disintesis. Penghambatan pada siklus G0-G1
memungkinan terjadi pemacuan apoptosis. Penghentian siklus sel pada fase G0-G1
memberi kesempatan sel memperbaiki DNA yang rusak dan memberikan
kesempatan pada sel yang mengalami kerusakan untuk dikenali lalu dilanjutkan
proses apoptosis. Kontrol checkpoint sangat penting untuk menjaga stabilitas
genomik. Kesalahan pada checkpoint akan meloloskan sel untuk berkembang biak
meskipun terdapat kerusakan DNA atau replikasi yang tidak lengkap atau
kromosom tidak terpisah sempurna sehingga akan menghasilkan kerusakan
genetik. Hal ini kritis bagi timbulnya kanker, oleh karena itu, proses regulasi
siklus sel mampu berperan dalam pencegahan kanker (Ruddon, 2007).
Pada perlakuan tunggal dan kombinasi ekstrak etil asetat daun kelor
1 1
dengan doksorubisin dengan dosis (EEADK /8 IC50 dan doksorubisin /4 IC50)
terjadi penghambatan pada siklus G0-G1, penghentian siklus sel pada fase G0-G1
kemungkinan terjadi pemacuan apoptosis. Penghentian siklus sel pada fase G1
akan memberikan kesempatan pada sel yang mengalami kerusakan untuk dikenali
dan melanjutkan proses apoptosis. Untuk mengetahui lebih jelasnya adanya
pemacuan apoptosis maka dilakukan pengujian apoptosis dengan metode
flowsitometri.
Hambatan regulasi daur sel pada fase G0-G1 oleh EEADK terjadi melalui
penurunan level ekspresi siklin D1 (berdasarkan pengujian imunositokimia)
sehingga tidak terjadi aktivasi CDK4 dan CDK6 yang berakibat pada
penghambatan fosforilasi pRb (protein retinoblastoma), Rb yang tidak
Universitas
Sumatera Utara
Utara
terfosforilasi akan berikatan dengan faktor transkripsi E2F mengikat DNA dan
menghambat transkripsi gen yang produknya diperlukan untuk fase S siklus sel
sehingga sel tertahan di fase G1 atau terjadi G1 arrest (King, 2000). Penghambatan
daur sel ini kemungkinan dapat juga disebabkan oleh kemampuan senyawa yang
terkandung dari EEADK meningkatkan ekspresi Protein p21 dan p27 akan
membentuk ikatan kompleks dengan siklin D dan Cyclin Dependent Kinase 4/6
(Cdk), sehingga akan menghambat posporilasi pRb (protein retinoblastoma). Hal
ini mengakibatkan E2F inaktif, hal ini berakibat pada terhentinya daur sel
(Obakan, et al., 2017; King, 2000). Penghentian siklus sel pada fase G0-G1
memberi kesempatan kepada sel untuk memperbaiki DNA yang rusak apabila
tidak bisa diperbaiki lanjut ke proses apoptosis.
Akumulasi sel pada fase S ditunjukkan pada Tabel 4.9 yaitu untuk
1
perlakuan tunggal EEADK ½ IC50 sebesar 24,33%, EEADK /10 IC50 sebesar
27,26%, dan doksorubisin ½ IC50 sebesar 25,65%, lebih tinggi dibandingkan
dengan kontrol akumulasi sel pada fase S sebesar 23,86%. Persentase yang lebih
tinggi dibanding kontrol menunjukkan bahwa sel mengalami penghambatan pada
fase S sehingga mencegah terjadinya sintesa DNA. Hambatan regulasi siklus sel
pada fase S kemungkinan terjadi karena penurunan level ekspresi siklin A
menyebabkan tidak terjadi aktivasi siklin A dengan CDK1/CDK2 sehingga siklus
sel tertahan di fase S (King, 2000). Sedangkan untuk kombinasi EEADK-
doksorubisin akumulasi sel pada fase S sebesar 20,34% lebih kecil dari pada
kontrol sel, penurunan persentase dibanding kontrol menunjukkan bahwa
kombinasi EEADK-doksorubisin tidak mencegah terjadinya sintesa DNA.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Pada fase G2-M, akumulasi sel untuk perlakuan EEADK ½ IC50 sebesar
1
23,57%, EEADK /10 IC50 sebesar 18,07%, doksorubisin ½ IC50 sebesar 23,35%
dan kombinasi EEADK-doksorubisin sebesar 25,43% lebih kecil dibandingkan
dengan kontrol sel sebesar 32,36%. Penurunan persentase dibanding kontrol
menunjukkan tidak ada perbaikan DNA yang rusak (DNA repair) (Dipaola, 2002).
4.11 Uji Apoptosis pada sel MCF-7
Pengamatan apoptosis dilakukan dengan metode flowsitometri. Metode ini
merupakan metode untuk menghitung sel hidup, sel nekrosis dan apoptosis secara
cepat. Pada uji ini digunakan suatu protein yaitu Annexin V yang dapat berikatan
secara spesifik pada fosfatidilserin yang terdapat pada membran plasma sel
selama proses apoptosis. DNA pada sel yang rusak baik nekrosis maupun
apoptosis akan diwarnai oleh propidium iodida (PI) yang menghasilkan
fluoresensi oranye hingga merah. Saat melewati sinar laser, sel akan tereksitasi
dan menghamburkan cahayanya menghasilkan cahaya fluoresensi (Brussaard, et
al., 2000; Demo, et al., 1999).
Pengujian apoptosis pada sel MCF-7 dilakukan dengan berbagai
perlakuan. Diantaranya adalah kontrol ditunjukkan pada Gambar 4.15, EEADK
pada konsentrasi ½ IC50 yaitu 74,63 μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.16,
1
EEADK pada konsentrasi /10 IC50 yaitu 14,93 μg/mL ditunjukkan pada Gambar
1 1
4.17, EEADK-doksorubisin ( /8 IC50 EEADK dan /4 IC50 doksorubisin yaitu
18,66 μg/mL dan 1,45 μg/mL) ditunjukkan pada Gambar 4.18, doksorubisin pada
konsentrasi ½ IC50 yaitu 2,9 μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.19. Hasil uji
apoptosis pada berbagai konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 4.10.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Tabel 4.10 Hasil pengujian apoptosis EEADK pada sel MCF-7
Jenis Perlakuan Konsentrasi (g/mL) R1 (%) R2 (%) R3 (%) R4 (%)
Kontrol 90,70 4,25 2,60 2,50
EEADK ½ IC50 74,63 0,27 0,18 42,83 56,99
EEADK 1/10 IC50 14,93 10,48 20,59 58,64 10,39
Kb EEADK-Dox 18,66-1,45 4,71 41,47 13,89 40,08
Doksorubisin ½IC50 2,9 64,61 17,04 12,80 5,58
Keterangan: R1 = sel hidup, R2 = sel yang mengalami apoptosis awal, R3 = sel
yang mengalami apoptosis akhir dan nekrosis awal, R4 = sel yang mengalami
nekrosis akhir (late nekrosis).
Gambar 4.15 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 kontrol
R3 Fil e: 1 /2 EEADK MCF7 APOPT.0 03

R4
Pati ent ID: 04 09.1 8
Acquis itio n Date : 09 -Apr-18
Gate: No Gate
Total Even ts: 2000 0
R2 Regio n % Gated % Total

R1 0.2 7 0.2 7
R1 R2 0.1 8 0.1 8
R3 42.83 42.83
R4 56.99 56.99
Gambar 4.16 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7

Fil e: 1 /2 yang
EEADKdiberi ½ IC50 03
MCF7 APOPT.0
EEADK Pati ent ID: 04 09.1 8
R3 Gate:
Fil No Gate
e: 1 /10 EEADK MCF7 APOPT.006
R4
Total
Pati Even
ent ts: 09.1
ID: 04 2000 80
Quad Locatio
Acquis n: 6
itio n Date 4, 7
: 09 9
-Apr-18
Gate: No Gate
Quad % Gated % Total
UL 59.48 59.48
URn %40.08
Regio Gated % 40.08
Total
R2
LL
R1 0.2 8
10.48 0.2 8
10.48
LRR2 0.1 7
20.59 0.1 7
20.59
R1
R3 58.64 58.64
R4 10.39 10.39
Gambar 4.17 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang

Fil e: 1 /10diberi
EEADK 1/10 ICAPOPT.006
MCF7 50
Gate: No Gate
Quad Locatio n: 6 4, 7 9

UL 10.78 10.78
UR 58.07 58.07
LL 10.82 10.82
LR 20.33 20.33
R3 Fil e: KOMB MCF7 APOP.002
R4
Gate: No Gate
Regio n % Gated % Total

R1 4.7 1 4.7 1
R1 R2 41.47 41.47
R3 13.89 13.89
R4 40.08 40.08
Gambar 4.18 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7

Fil e: KOMByang diberi 1/8 IC50
MCF7 APOP.002
EEADK- ¼ IC50 doksorubisin Pati ent ID: 04 19.1 8
Gate: No Gate
R3 Fil e: 1 /2 DOXO MCF7 APOPT.004
R4 Quad Locatio n: 1 08, 92
Acquis %
Quad itioGated
n Date :%
09Total
-Apr-18
Gate:
UL No Gate 39.91 39.91
Total
UREven13.64 ts: 2000 13.64
0
LL 4.7 9 4.7 9
LR 41.66 41.66
R1 64.61 64.61
R1 R2 17.04 17.04
R3 12.80 12.80
R4 5.5 8 5.5 8
Gambar 4.19 Gambaran persentase kondisi sel Fil

MCF-7
e: 1 /2 DOXOyang
MCF7 diberi ½ IC50
APOPT.004
doksorubisin Pati ent ID: 04 09.1 8
Gate: No Gate
Persentase jumlah sel yang hidup pada Tabel 4.10 menunjukkan hasil
untuk kontrol sebesar 90,70%, pada perlakuan dengan

QuadEEADK ½Total
% Gated % IC50 (0,27%),
UL 5.5 7 5.5 7
UR 12.71 12.71
EEADK 1/10 IC50 (10,48%), perlakuan dengan EEADK - doksorubisin (4,71%)
LL 64.75 64.75
LR 16.96 16.96
sedangkan dengan doksorubisin ½ IC50 (64,61%). Penggunaan EEADK baik
dengan tunggal dan kombinasi menunjukkan persentase jumlah sel hidup yang
rendah dibandingkan dengan kontrol. Sedangkan penggunaan tunggal
doksorubisin menunjukkan persentase jumlah sel hidup yang lebih tinggi
dibanding perlakuan dengan EEADK.
Pada sel MCF7 yang diberi EEADK ½ IC50 terlihat persentase sel yang
mengalami apoptosis awal (0,18%), EEADK 1/10 IC50 (20,59%) sedangkan yang
diberi EEADK-doksorubisin terlihat persentase sel yang mengalami apoptosis
Universitas
Sumatera Utara
Utara
awal (41,47%), doksorubisin ½ IC50 (17,04%), dibandingkan kontrol (4,25%).
1
Terlihat EEADK pada konsentrasi /10 IC50 dan kombinasinya dengan
doksorubisin meningkatkan jumlah sel yang mengalami apoptosis awal dan
kombinasi EEADK-doksorubisin lebih meningkatkan jumlah sel yang mengalami
apoptosis dibandingkan dengan EEADK tunggal dengan konsentrasi ½ IC50.
Persentase sel yang mengalami apoptosis akhir dan nekrosis awal pada
pemberian EEADK ½ IC50 (42,83%), EEADK 1/10 IC50 (58,64%), yang diberi
EEADK-doksorubisin terlihat persentase sel yang mengalami apoptosis akhir dan
nekrosis awal (13,89%), doksorubisin ½ IC50 (12,80%), sedangkan pada kontrol
sel (2,60%). Sel yang mengalami late necrosis pada sel MCF7 yang diberi
EEADK ½ IC50 (56,99%), EEADK 1/10 IC50 (10,39%), yang diberi EEADK-
doksorubisin terlihat persentase sel yang mengalami late necrosis (40,08%),
doksorubisin ½ IC50 (5,58%), sedangkan pada kontrol (2,50%).
EEADK dan kombinasinya menunjukkan aktivitas positif dalam apoptosis
dengan metode flowsitometri menggunakan annexin V. Prinsip dari pelabelan
annexin V adalah pewarnaan pada phosphatidylserines (PS) yang terdapat pada
membran luar sel. Sel apoptosis awal mengekspresikan PS pada luar membran
plasma. PS dapat terwarnai oleh label annexin V. Sel yang mengalami apoptosis
akhir dan sel nekrosis akan kehilangan integritas membran selnya dan permeabel
terhadap pewarna annexin V (Zimmermann and Meyer, 2011). Mekanisme kerja
dari EEADK, doksorubisin dan kombinasi kemungkinan berada pada fase
apoptosis awal, apoptosis akhir dan nekrosis sel.
Dari hasil yang diperoleh, terlihat jelas perbedaan penggunaan tunggal
ekstrak dan yang dikombinasikan dengan doksorubisin. Penggunaan kombinasi
Universitas
Sumatera Utara
Utara
lebih bagus daripada penggunaan tunggal ekstrak. Kombinasi EEADK-
doksorubisin lebih memacu terjadinya apoptosis awal dibandingkan penggunaan
tunggal EEADK dan doksorubisin. Hasil ini kemungkinan disebabkan EEADK
mengandung senyawa flavonoid (kuersetin, kaempferol), glukosinolat
(glukomoringin), isotiosianat (benzyl isotiosianat, phenetil isotiosianat) yang
memiliki aktifitas antitumor yang tinggi yang telah diuji kemampuannya
memblok nuclear factor-kappa B, menginduksi apoptosis, menghambat
proliferasi dan angiogenesis. (Brunelli, 2010; Obakan, et al., 2017).
4.12 Uji Apoptosis pada sel T47D
Pengujian apoptosis pada sel T47D dilakukan dengan berbagai perlakuan.
Diantaranya adalah kontrol ditunjukkan pada Gambar 4.20, EEADK pada
konsentrasi ½ IC50 yaitu 93,30 μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.21, EEADK
1
pada konsentrasi /10 IC50 yaitu 18,66 μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.22,
1 1
EEADK-doksorubisin ( /8 IC50 EEADK dan /4 IC50 doksorubisin yaitu 23,32
μg/mL dan 0,35 μg/mL) ditunjukkan pada Gambar 4.23, doksorubisin pada
konsentrasi ½ IC50 yaitu 0,7 μg/mL ditunjukkan pada Gambar 4.24. Hasil uji
apoptosis pada berbagai konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 4.11.
Tabel 4.11 Hasil pengujian apoptosis EEADK pada sel T47D

Jenis Perlakuan Konsentrasi (g/mL) R1 (%) R2 (%) R3 (%) R4 (%)
Kontrol 90,46 0,80 4,70 4,06
EEADK ½ IC50 93,30 0,66 1,07 24,68 73,69
EEADK 1/10 IC50 18,66 2,83 17,76 16,96 62,58
Kb EEADK-Dox 23,32-0,35 2,58 7,66 32,02 57,90
Doksorubisin ½IC50 0,7 18,08 67,88 8,71 5,44
Keterangan: R1 = sel hidup, R2 = sel yang mengalami apoptosis awal, R3 = sel
yang mengalami apoptosis akhir dan nekrosis awal, R4 = sel yang mengalami
nekrosis akhir (late nekrosis).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
R3 Fil e: KS 1 T4 7D APOPT.0 07
R4
Gate: No Gate

R1 90.46 90.46
R1 R2 0.8 0 0.8 0
R3 4.7 0 4.7 0
R4 4.0 6 4.0 6
Gambar 4.20 Gambaran persentase kondisi sel T47DFilkontrol

e: KS 1 T4 7D APOPT.0 07
R3 Fil e: 1No
Gate: /2 EKS
GateAPOPT.0 05
R4
Pati ent
Total ID: ts:
Even 04 04.1
200080
AcquisLocatio
Quad itio n Date
n: 6: 4,
047-Apr-18
9
Gate: No Gate
Quad
Total Even% Gated
ts: 2000 %0Total
UL 4.0 3 4.0 3
R2 Regio
UR n % Gated 4.6 4 %4.6
Total
4
LLR1 0.6 6 90.61
90.61 0.6 6
R1 LRR2 1.0
0.7 27 1.0
0.7 27
R3 24.68 24.68
R4 73.69 73.69
Gambar 4.21 Gambaran persentase kondisi sel T47DFilyang diberi

e: 1 /2 EKS ½ IC50
APOPT.0 05EEADK
R3 Gate: No
Fil e: 1 /10 Gate
EKS APOPT.0 03
R4 Total Even ts: 2000
Pati ent ID: 04 04.108
Quad
Acquis Locatio n: 6 4,
itio n Date 7 9-Apr-18
: 04
Gate: %
Quad NoGated
Gate % Total
Total
UL Even ts: 2000
74.69 0
74.69
UR 23.57 23.57
LL 0.6 8 0.6 8
R1 2.8 3 2.8 3
LR 1.0 7 1.0 7
R1 R2 17.76 17.76
R3 16.98 16.98
R4 62.58 62.58
Gambar 4.22 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang

Fil e: 1 /10 diberi 1/10
EKS APOPT.0 03 IC50
Gate: No Gate

UL 63.15 63.15
UR 16.13 16.13
LL 3.1 9 3.1 9
LR 17.53 17.53
Gambar 4.23 Gambaran persentase kondisi sel T47D yang diberi 1/8 IC50
EEADK- ¼ IC50 doksorubisin
Universitas
Sumatera Utara
Utara
R3 Fil e: 1 /2 DOXO APOPT.006
R4
Gate: No Gate

R1 18.08 18.08
R1 R2 67.88 67.88
R3 8.7 1 8.7 1
R4 5.4 4 5.4 4
Gambar 4.24 Gambaran persentase kondisi sel FilT47D yang

e: 1 /2 DOXO diberi ½ IC50
APOPT.006
doksorubisin Pati ent ID: 04 04.1 8
Gate: No Gate
Persentase jumlah sel yang hidup pada Tabel 4.11 menunjukkan hasil
untuk kontrol sebesar 90,46%, pada perlakuan dengan

Quad EEADK ½Total
% Gated % IC50 (0,66%),
UL 5.7 4 5.7 4
UR 8.2 5 8.2 5
EEADK 1/10 IC50 (2,83%), perlakuan dengan EEADK - doksorubisin (2,58%)
LL 18.40 18.40
LR 67.60 67.60
sedangkan dengan doksorubisin ½ IC50 (18,08%). Penggunaan tunggal EEADK,
doksorubisin dan kombinasinya menunjukkan persentase jumlah sel hidup yang
rendah dibandingkan dengan kontrol sel.
Pada sel T47D yang diberi EEADK ½ IC50 terlihat persentase sel yang
1
mengalami apoptosis awal (1,07%), EEADK /10 IC50 (17,76%), EEADK-
doksorubisin (7,66%) dan doksorubisin ½ IC50 sebesar 67,88% lebih tinggi
dibandingkan kontrol sel sebesar 0,80%. Terlihat perlakuan dengan tunggal
EEADK dan kombinasi meningkatkan jumlah sel yang mengalami apoptosis
awal.
Persentase sel yang mengalami apoptosis akhir dan nekrosis awal pada
pemberian EEADK ½ IC50 (24,68%), EEADK 1/10 IC50 (8,71%), EEADK-
doksorubisin sebesar 71,67%, doksorubisin ½ IC50 (8,71%), Hasilnya lebih tinggi
dibandingkan dengan kontrol sel (4,70%). Sel yang mengalami late necrosis pada
sel T47D yang diberi EEADK ½ IC50 (73,69%), EEADK 1/10 IC50 (62,58%),
Universitas
Sumatera Utara
Utara
EEADK-doksorubisin sebesar 25,94%, doksorubisin ½ IC50 (5,44%), sedangkan
pada kontrol (4,06%).
EEADK dan kombinasinya menunjukkan aktivitas positif dalam apoptosis
dengan metode flowsitometri menggunakan annexin V. Prinsip dari pelabelan
annexin V adalah pewarnaan pada phosphatidylserines (PS) yang terdapat pada
membran luar sel. Sel apoptosis awal mengekspresikan PS pada luar membran
plasma. PS dapat terwarnai oleh label annexin V. Sel yang mengalami apoptosis
akhir dan sel nekrosis akan kehilangan integritas membran selnya dan permeabel
terhadap pewarna annexin V (Zimmermann dan Meyer, 2011). Mekanisme kerja
dari EEADK, doksorubisin dan kombinasi kemungkinan berada pada fase
apoptosis awal, apoptosis akhir dan nekrosis sel.
Dari hasil yang diperoleh, terlihat jelas perbedaan penggunaan tunggal
ekstrak dan yang dikombinasikan dengan doksorubisin. Penggunaan tunggal lebih
memacu apoptosis awal dibandingkan kombinasi sedangkan penggunaan
kombinasi lebih memacu terjadinya apoptosis akhir dan nekrosis awal. Hasil ini
kemungkinan disebabkan EEADK mengandung senyawa flavonoid (kuersetin,
kaempferol), glukosinolat (glukomoringin), isotiosianat (benzyl isotiosianat,
phenetil isotiosianat) yang memiliki aktifitas antitumor yang tinggi yang telah
diuji kemampuannya memblok nuclear factor-kappa B, menginduksi apoptosis,
menghambat proliferasi dan angiogenesis. (Brunelli, 2010; Obakan, et al., 2017).
4.13 Pengamatan Ekspresi Protein Siklin D1 dan Bcl-2
Suatu sel masuk ke fase proliferasi dapat dideteksi dengan penelusuran
ekspresi gen siklin D1 yang berperan pada awal siklus sel (fase G1). Selanjutnya
Universitas
Sumatera Utara
Utara
untuk mengetahui suatu sel kanker mempertahankan kehidupannya dalam kaitan
dengan apoptosis perlu diperiksa ekspresi Bcl-2.
Pengamatan ekspresi protein regulator siklus sel Siklin D1 pada sel T47D
dengan EEADK 1 kali IC50, ½ IC50, kombinasi EEADK dengan doksorubisin dan
doksorubisin menggunakan metode imunositokimia dengan prinsip pengikatan
antibodi spesifik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa EEADK mampu
menurunkan ekspresi Siklin D1 pada sel T47D yang ditunjukkan pada Gambar
4.25 dan pada sel MCF7 pada Gambar 4.26 secara visual menunjukkan bahwa
sitoplasma sel perlakuan uji mempunyai warna transparan kebiruan/ungu berbeda
signifikan dengan kontrol sel dengan antibodi spesifik Siklin D1 yang berwarna
gelap/coklat.
a b
c d
Universitas
Sumatera Utara
Utara
e f
Gambar 4.25 Ekspresi Siklin D1 yang diberi berbagai perlakuan pada sel T47D
Keterangan: : ekspresi (+) : ekspresi (-)
a. Kontrol tanpa antibodi d. EEADK ½ IC50
b. Kontrol + antibodi Siklin D1 e. Doksorubisin ½ IC50
c. EEADK 1 IC50 f. 1/8 IC50 EEADK-1/4 IC50 doksorubisin
a b
c d
e f
Gambar 4.26 Ekspresi Siklin D1 yang diberi berbagai perlakuan pada sel MCF7
Keterangan : : ekspresi (+) : ekspresi (-)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Perjalanan teratur sel melalui berbagai fase siklus sel ini dikendalikan oleh
CDK yang telah diaktifkan. CDK menyebabkan fosforilasi berbagai protein
sasaran yang penting dan diekspresikan selama siklus sel tetapi dalam bentuk
inaktif. Sebaliknya berbagai siklin baru disintesis sewaktu fase tertentu siklus sel.
Siklin ini berfungsi untuk mengaktifkan CDK dengan berikatan dan kadar siklin
dengan cepat turun. Karena sifat pembentukan dan penguraiannya yang siklis,
protein ini disebut siklin. Sementara siklin membangkitkan CDK, inhibitor siklin
yang banyak jenisnya, menekan CDK dan menimbulkan kontrol negatif terhadap
siklus sel (Budityastomo, 2010). Walaupun setiap fase siklin dipantau dengan
cermat, transisi dari G1 ke S diperkirakan merupakan tahap yang sangat penting
dalam siklus sel. Apabila suatu sel menemukan sinyal yang mendorong
pertumbuhan, kadar siklin D meningkat dan CDK4 dan CDK6 menjadi aktif.
Tahap ini dijaga oleh produk protein retinoblastoma (pRB). Fosforilasi pRB yang
ditimbulkan oleh CDK mengalahkan hambatan G1 menuju S sehingga sel dapat
masuk ke dalam fase sintesis DNA (Padanilam, 2003).
Siklin D1 merupakan siklin yang berperan dalam siklus G0-G1. Kompleks
siklin D/CDK4, siklin D/CDK6 dan siklin E/CDK2 mengatur transisi fase G1 ke
fase S. Cyclin D1-CDK4 komplek adalah protein yang bertanggung jawab dalam
phosphorilasi Rb yang akan menentukan G0 lengkap sehingga siklus sel dapat
dilanjutkan pada fase S. Faktor pertumbuhan akan meregulasi siklin D dan E
sehingga menyebabkan proliferasi sel (King, 2000). NF-kB adalah salah satu
faktor transkripsi yang mempromosikan progresi siklus sel melalui pengaturan
gen yang terlibat dalam siklus sel seperti cyclin D1, D2, D3 dan cyclin E, c-myc
dan c-mycb. NF-kB diduga berhubungan pula dengan aktivitas pRb melalui cyclin
Universitas
Sumatera Utara
Utara
D1. Hambatan regulasi daur sel oleh EEADK dan kombinasi dengan doksorubisin
terjadi melalui penghambatan NF-kB sehingga menghambat progresi siklus sel
(Ratnasari, et al., 2016; Park and Hong, 2016) dimana pada penelitian sebelumnya
telah dibuktikan bahwa ekstrak etanol daun kelor dapat menurunkan jumlah NF-
kB aktif pada sel MCF7 (Andjani, et al., 2016).
Hambatan regulasi daur sel oleh EEADK dan kombinasinya dengan
doksorubisin dapat juga terjadi melalui penurunan level ekspresi siklin D1 yang
berakibat pada penghambatan fosforilasi pRb, melalui pembentukan kompleks
dengan Cdk4/6. Penghambatan fosforilasi pRb berakibat terhentinya daur sel
karena E2F tidak terlepas dari ikatan dengan pRb sehingga sel tidak mampu
mentranskrip gen-gen yang diperlukan pada proses daur sel maupun proliferasi sel
(King, 2000).
Hasil penelitian menunjukkan EEADK mampu menurunkan ekspresi Bcl-
2 pada sel T47D yang ditunjukkan pada Gambar 4.27 dan pada sel MCF7 yang
ditunjukkan pada Gambar 4.28 secara visual menunjukkan bahwa sitoplasma sel
uji mempunyai warna transparan kebiruan berbeda signifikan dengan kontrol sel
dengan antibodi spesifik Bcl-2 yang berwarna gelap/coklat.
a b
Universitas
Sumatera Utara
Utara
c d
e f
Gambar 4.27 Ekspresi Bcl-2 yang diberi berbagai perlakuan pada sel T47D
a b
c d
Universitas
Sumatera Utara
Utara
e f
Gambar 4.28 Ekspresi Bcl-2 yang diberi berbagai perlakuan pada sel MCF7
EEADK dapat menginduksi apoptosis pada sel kanker payudara T47D.
Penelusuran jalur apoptosis pada penelitian ini melalui pengamatan ekspresi Bcl-2
yang didapat menurun akibat perlakuan ekstrak dengan warna sitoplasma biru.
Protein proapoptosis (Bax, Bak, Bad) dapat menginduksi pelepasan sitokrom C
yang bersama Apaf-1 menginduksi apoptosis melalui aktivasi caspase namun
keberadaan Bcl-2 sebagai protein antiapoptosis beraksi kebalikan (Padanilam,
2003).
Apabila ekspresi Bax atau Bak dinaikkan dan Bcl-2 atau Bcl-XL
diturunkan, maka akan terjadi regulasi sel ke arah kematian melalui apoptosis. Hal
ini semakin membuktikan bahwa EEADK berpotensi sebagai agen ko-kemoterapi
karena meningkatkan aktivitas sitotoksik sel kanker payudara terhadap agen
kemoterapi melalui pemacuan apoptosis dengan penurunan ekspresi protein Bcl-2.
Protein Bcl-2 merupakan salah satu jenis protein anti apoptosis yang
terlibat dalam proses apoptosis. NFκB merupakan faktor transkripsi yang penting
dalam transkripsi protein antiapoptosis seperti Bcl-2, IAP dan Bcl-XL (Park dan
Hong, 2016). Terjadinya penghambatan jalur NFκB dapat menekan ekspresi
protein Bcl-2. Keberadaan EEADK dapat menurunkan ekspresi protein Bcl-2
Universitas
Sumatera Utara
Utara
dapat terlihat secara visual dibandingkan dengan kontrol sel yang diberi antibodi
Bcl-2. Apoptosis yang terjadi kemungkinan juga melibatkan adanya peningkatan
ekspresi protein pro apoptosis seperti Bad, Bax, Bak (Park dan Hong, 2016). Oleh
karena itu, masih membutuhkan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui
pengaruh pemberian EEADK terhadap ekspresi protein pro apoptosis (Bax dan
Bak).
Universitas
Sumatera Utara
Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh pada penelitian ini adalah:
a. ENDK, EEADK dan EEDK memiliki aktivitas antikanker pada sel MCF-7
dengan nilai IC50 ENDK sebesar 367,73±23,58 µg/mL; EEADK sebesar
149,29±24,41 µg/mL; EEDK sebesar 1604,22±18,34 µg/mL, pada sel T47D
dengan nilai IC50 ENDK sebesar 1053,76±24,05 µg/mL; EEADK sebesar
186,56±33,09 µg/mL; EEDK sebesar 2738,89±21,35 µg/mL, ekstrak yang
paling potensial dan paling selektif dalah EEADK.
b. EEADK yang dikombinasikan dengan doksorubisin memberikan efek
sinergis sangat kuat terhadap sel MCF-7 terdapat pada konsentrasi
EEADK - doksorubisin 18,66 µg/mL – 1,45 µg/mL (1/8 IC50 - 1/4 IC50) dan
sinergis terhadap sel T47D terdapat pada konsentrasi EEADK -
doksorubisin 23,32 µg/mL – 0,35 µg/mL (1/8 IC50 - 1/4 IC50).
c. EEADK dengan konsentrasi 1/10 IC50 (14,93 µg/mL), ½ IC50 (74,63
µg/mL) dan kombinasinya dengan doksorubisin menghambat siklus sel
MCF-7 pada fase G0-G1 dengan persentase berturut-turut 69,89%, 63,77%
dan 54,48%; EEADK dengan konsentrasi 1/10 IC50 (18,66 µg/mL), ½ IC50
(93,26 µg/mL) dan kombinasinya dengan doksorubisin menghambat siklus
sel T47D pada fase G0-G1 dengan persentase berturut-turut 55,04%, 52,34%
dan 54,49%.
1
d. EEADK dengan dosis 1/10 IC50, /2 IC50 dan kombinasinya dengan
doksorubisin memacu apoptosis awal terhadap sel MCF-7 dengan
Universitas
Sumatera Utara
Utara
persentase berturut-turut sebesar 20,59%; 0,18%; 41,47%; untuk apoptosis
akhir 58,64%; 42,83%; 13,89%; dan untuk nekrosis akhir berturut-turut
10,39%; 56,99%; 40,08% sedangkan terhadap sel T47D memacu apoptosis
awal dengan persentase berturut-turut 17,76%; 1,07%; 7,66% ; apoptosis
akhir 16,98%; 24,68%; 32,02%, untuk nekrosis akhir berturut-turut 62,58;
73,69% dan 57,90%.
e. EEADK dan kombinasinya dengan doksorubisin dapat menekan ekspresi
siklin D1 sehingga menghambat siklus sel pada fase G0-G1.
f. EEADK dan kombinasinya dengan doksorubisin dapat menekan ekspresi
Bcl-2 sehingga memacu apoptosis pada sel kanker.
5.2 Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk:
a. Melakukan uji lanjutan efek kombinasi terhadap ekspresi protein
proapoptosis (Bax, Bak) dan ekspresi p53 yang berperan dalam proliferasi
dan apoptosis sel kanker payudara.
b. Melakukan isolasi senyawa aktif yang ada pada ekstrak etil asetat daun
kelor.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A.K., and Lichtman, A.H. (2003). Cellular and Molecular Immunology.
Edisi kelima. Philadelphia: Saunders. Hal. 522-534.
Abcam. (2007). T47D (Human Ductal Breast Epithelial Tumor Cell Line) Whole
Cell Lysate (ab14899) data sheet. Diunduh tanggal 18 September 2017
dari: http://www.abcam.com/T47D-Human-ductal-breast-epithelial
tumor cell line- Whole-Cell-Lysate-ab14899.html.
Abdull R.A.F, Ibrahim, M.D., and Kntayya, S.B. (2014). Health benefit of
Moringa oleifera. Asian Pac J Cancer Prev, 20, 8571-6.
Allen, J.D., Arnold, V.L., Jeany, M.L., Martin, V.D.V., Olaf, V.T., Glen, R., et al.
(2002). Potent and Specific Inhibition of the Breast Cancer Resistance
Protein Multidrug Transporter In Vitro and In Mouse Intestine by A
Novel Analogue of Fumitremorgin C. Molecular Cancer Therapeutics.
1(6): 417-425.
Aka, J.A., and Lin, X.S. (2012). Comparison of Functional Proteomic Analyses
of Human Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF-7. Proteomic
Analyses of Breast Cancer Cell Lines. 7(2): e31532.
Amundson, S.A., Myers, T.G., Scudiero, D., Kitada, S., Reed, J.C., and Fornace,
A.J. (2000), An Informatics Approach Identifying Markers of
Chemosensitivity in Human Cancer Cell Lines. Cancer Res. 60:6101-
6110.
Andjani, N., Sujuti, H., and Winarsih, S. (2016). Efek ekstrak etanol daun kelor
(M.oleifera) terhadap nuclear factor kappa beta (NF-kB) aktif dan
apoptosis cell line kanker MCF-7. Biokimia FKUB. Vol.3 No.4. Hal.204-
212.
Anonim, (2007), ATCC Cell Biology, available from

http://www.atcc.org/common /catalog/numSearch/numResults.cfm?atcc
Num=HTB-22, diunduh 24 September 2017.
Anonim. (2014). Kanker-Pengertian, Penyebab, Jenis Kanker. Diunduh tanggal

11 Mei 2017 dari http://mediskus.com/penyakit/kanker-pengertian-
penyebabjenis. html.
ATCC. (2008), Cell Biology, ATCC® Number: HTB-22TM, Designations: MCF-

7,http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tab
id/452/Default.aspx?ATCCNum=HTB-22&Template=cellBiology.
Diunduh 24 September 2017.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Awodele, O., Oreagbe I.A., and Odoma, S. (2012). Toxicological evaluation of
aquaeous leaf extract of Moringa oleifera Lam. (Moringaceae).
J.Ethnopharmacol. 139: 300-306.
Aziz, F., Andrijono, dan Saifuddin, A.B. (2010). Buku Acuan Nasional Onkologi
Ginekologi. Edisi Pertama. Cetakan Kedua. Jakarta: PT. Bina Pustaka
Sarwono. Hal. 17.
Baumforth and Crocker, (2003). Molecular and Immunological Aspects of Cell

Proliferation, in Molecular Biology in Cellular Pathology, Wiley
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0470867949.ch6/summary
Bennett, R.N., Mellon, F.A., Foidl, N., Pratt, J.H., Dupont, M.S., Perkins, L., et al.
(2003). Profiling glucosinolates and phenolics in vegetative and
reproductive tissues of the multi-purposetrees Moringa oleifera L.
(Horseradish Tree) and Moringa stenopetala L. J. Agric. Food Chem.,
51, 3546–3553.
Berkovich, L., Earon, G., Ron, I., Rimmon, A., Vexler, A., and Levari S. (2013).
Moringa oleifera aqueous leaf extract down-regulates nuclear factor-
kappaB and increases cytotoxic effect of chemotherapy in pancreatic
cancer cells. BMC Complementary and Alternative Medicine. 13:212.
Bose, C.K., (2007). Possible role of Moringa Oleifera L. root in epithelial ovarian
cancer, MedGenMed, 9(1): 26.
Broin. (2010). Growing and processing moringa leaves. France: Imprimerie

Horizon. Hal. 25-26
Brunelli, D., Tavecchio, M., Falcioni, C., Frapolli, R., Erba, Iori, R., et al. (2010).
The isothiocyanate produced from glucomoringin inhibit NF-kB and
reduces myeloma growth in nude mice in vivo. Biochemical
Pharmacology. 79(8): 1141-1148.
Brussaard, C., Marie, D., and Bratbak, G. (2000). Flowcytometric Detection of

Viruses. Journal of Virological Methods. 85: 175-182.
Budityastomo, H. (2010). Pemberian Fraksi Etanolik Ekstrak Bawang Dayak

Terhadap Tingkat Ekspresi Cyclin-E Galur Sel Kanker Serviks Uteri
Hela. Tesis. Surakarta. Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret.
Hal. 58.
Butt, A.J., Firth, S.M., King, M.A., and Baxter, R.C. (2000). Insulin-Like Growth
Factor-Binding Protein-3 Modulates Expression of Bax and Bcl-2 and
Potentiates P53-Independent Radiation-Induced Apoptosis In Human
Breast Cancer Cells. J. Biol Chem, 275(50):39174-39181.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Centre). (2009). Protokol Kultur Sel.
Yogyakarta: Cancer Chemoprevention Research Centre. Hal. 1-7.
Charoensin, S. (2014). Antioxidant and anticancer activities of Moringa oleifera

leaves. J. Med. Plants Res. Vol. 8(7): 318-325
Childs, A.C., Phaneuf, S.L., Dirks, A.J., Phillips, T., and Leeuwenburgh. (2002).
Doxorubicin Treatment In Vivo Causes Cytochrome c Release and
Cardiomyocyte Apoptosis, as well as Increased Mitochondrial
Efficiency, Superoxide Dismutase Activity, and Bcl-2:Bax Ratio. Cancer
Res, 62: 4592-4598.
Choi, Y. (2005). ABC Transporters as Multidrug Resistance Mechanism and the

Development of Chemosensitizers for Their Reversal. Cancer Cell
International. 5: 30.
Chou, C.T., and Martin, N. (2004). Compusyn For Drug Combinations User’s
Guide. Combosyn, Inc USA. Hal. 24-33.
Clarke, L.H. (2000). Estrogens, BRCA1 and Breast Cancer. Cancer Research. 60:
4993-5001.
Conseil, G., Helene, B.C., Guila, D., Jean, M.J., Denis, B., and Attilio, D.P.
(1998). Flavonoids: A Class of Modulators with Bifunctional Interactions
at Vicinal ATP-and Steroid-Binding Sites on Mouse P-glycoprotein.
Proceedings of the National Academy of Science of the United States of
America. 95(17): 9831-9836.
Cooper ,G.M., and Hausman R.E. (2009). The Cell: A Molecular Approach, Fifth
Edition, ASM Press and Sinauer Associates, Inc. Hal. 52.
Demo, S.D., Masuda, E., Rossi, A.B., Throndset, B.T., Gerard, A.L., and Chan,
E.H. (1999). Quantitative Measurement of Mast Cell Degranulation
Using a Novel Flow Cytometric Annexin-V Binding Assay. Cytometry.
36: 340-348.
Deng, L., Linlee, Y.C., Claret, F.X., and Kuo, M.T. (2001). 2
Acetylaminofluorene Up-regulates Rat mdr1b Expression through
Generating Reactive Oxygen Species That Activate NF-κB Pathway. The
Journal of Biological Chemistry. 276(1): 413-420.
Depkes RI. (1979). Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Ditjen POM. Hal. 33.
Depkes RI. (1986). Sediaan Galenik. Jakarta: Ditjen POM. Hal. 1,7, 10, 19, 21.
Depkes RI. (1989). Materia Medika Indonesia. Jilid V. Jakarta: Departemen

Kesehatan RI. Hal. 348-351.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Depkes RI. (1995). Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Jakarta: Departemen
Kesehatan RI. Hal. 299-304, 321-325, 333-335.
Depkes RI. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan
Pertama. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal. 10-17.
Depkes RI. (2008). Farmakope Herbal Indonesia. Edisi I. Jakarta: Departemen

Kesehatan RI. Hal. 174-175.
Dhulipala, V.C., Welshons, W.V., and Reddy, C.S. (2006). Cell Cycle Proteins in
Normal and Chemically Induced Abnormal Secondary Palate
Development: a Review, Human Exp. Toxicol. 25: 675-682.
Diananda, R. (2009). Mengenal Seluk Beluk Kanker. Cetakan ketiga. Yogyakarta:

Katahati. Hal. 15, 22, 29-30.
Dipaola, S.R. (2002). To Arrest or Not to G2-M Cell-Cycle Arrest. Clinical

Cancer Research. 8: 3311-3314.
Divi, M. S., Bellamkonda, R., and Dasireddy, K.S. (2012). Evaluation of

antidiabetic and antihyperlipedemic potential of aqueous extract of
Moringa oleifera in fructose fed insulin resistant and STZ induced
diabetic wistar rats: acomparative study, Asian J. Pharm. Clin. Res. 5
67–72.
Doyle, A., Griffiths, J.B., and Newell, D.G. (2000). Cell and Tissue Culture:
Laboratory Procedures. Edisi ke III. New York: John Wiley & Son. Hal.
23-24.
Ekowati, H., Sarmoko., and Widiastuti, R. (2013). Combination of Three Species

of Zingiberaceae Prevents Doxorubicin-Induced Hepatotoxicity.
Universa Medicina. 32(1): 11-19.
Elwood, J.C., and Richardson, A. (1993). The Effectiveness of Breast Cancer

Screening by Mammography in Younger Woman. Online J Curr Clin
Trials. Hal. 32.
Farnsworth, N.R. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants.

Journal of Pharmaceutical Sciences. 55(3): 225-276.
Fikriansyah.,Widiastuti, M.,Wulandari, N., Tirtanirmala, P., and Murwanti, R.

(2015). Cardioprotective Effect of Kelor (Moringa oleifera) Leaf
Ethanolic Extract against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity in Rats.
Indonesian journal of Cancer Chemoprevention, 6(2): 53-57.
Fogli, S., Nieri P., and Breschi M.C. (2004). The role of nitric oxide in
anthracycline toxicity and prospects for pharmacologic prevention of
cardiac damage. FASEB J, 18 (6), 664-75
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Freshney, I.A. (2000). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique.
Edisi ke IV. Toronto: Willey-Liss. Hal. 329-344.
Frias, M.A., Lang, U., Gerber-Wicht, C., and James, R.W. (2009). Native and
reconstituted HDL protect cardiomyocytes from doxorubicin-induced
apoptosis, Cardiovasc Res. 85: 118-26.
Ghassami, E., Asghari, G., and Jafarain, A. (2014). Evaluation of cytotoxicity of

Moringa oleifera lams. callus and leaf extracts on HeLa cells. Advanced
Biomedical Research. 3(194): 1-5.
Ghosh, N. (2013). Anticancer effect of moringa oleifera leaf extract on human

breast cancer cell, Thesis, Kolkata India, School of Bioscience and
Engineering Jadavpur University. Hal. 1-57.
Gibbs, J.B. (2000). Mechanism-Based Target Identification and Drug Discovery

in Cancer Research. Science. 287(5460): 1969-1973.
Givan, A.L. (2001). Flowcytometry First Principles. New York: Wiley-Liss Inc.
Hal. 115-116,123.
Goncalves, E.M., Ventura, C.A., Yano. T., Macedo, M.L.D., and Ganeri, S.C.
(2006). Morphological and Growth Alterations In Vero Cells
Transformed by Cysplatin. Cell Biology International. 30(6): 485-494.
Hahn, W.C., and Weinberg, R.A. (2002). Modelling The Molecular Circuitry of
Cancer. Nature Reviews Cancer. 2(5): 331-341.
Hanani, E. (2017). Analisis Fitokimia. Jakarta: Penerbit buku kedokteran (EGC).

Hal. 11-13
Handayani, R., Sugiyanto., dan Salamah, N. (2001). Uji Sitotoksisitas Senyawa

Aktif Komponen Daun Gynura procumbens (Lour) Merr Terhadap
Beberapa Cell Line. Majalah Farmasi Indonesia. 12(3): 140-151.
Harborne, J.B. (1996). Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisa

Tumbuhan. Penerjemah Kosasih Padmawinata. Edisi II. Bandung: ITB
Press. Halaman 152-153.
Hartono, N.W.B. (2009). Pengaruh Alpinia galanga (Lengkuas) Terhadap

Aktivitas Proliferasi Sel dan Indeks Apoptosis pada Adenokarsinoma
Mamma Mencit C3H. Tesis. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas
Diponegoro. Hal. 31-35, 46-47.
Hermawan, A., Nur, K.A., Samoko, D.D., Putri, P., and Meiyanto, E. (2012),
Ethanolic Extract of Moringa oleifera Increased Cytotoxic Effect of
Doxorubicin on Hela Cancer Cells. Journal of Natural Remedies.
12(2):106–114.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Hossain, N., Mirghani, M.E.S., and Raus, B.R., (2015). Optimization of Moringa
oleifera Leaf Extraction and Investigation of Antibreast Cancer Activity
with Leaf Extract. Engineering International. Vol.3.No.2: 97-103
Hostanska, K., Nisslein, T., Freudenstein, J., Reichling, J., and Saller, R. (2004).
Evaluation of Cell Death Caused by Triterpene Glycosides and Phenolic
Substances from Cimifuga racemosa Extract in Human MCF-7 Breast
Cancer Cells. Biologycal & Pharmaceutical Bulletin. 27(12): 1970-1975.
Huang, Y., Bruyne, T.D., Apers, S., Ma, Y., Claeys, M., Berghe, V., Pieters, L.,
and Vlietinck, A. (1998). Complement Inhibiting Cucurbitacin
Glycosides from Picriafel-terrae. J.Nat. Prod. 61: 757-761.
Imai, Y., Ishikawa, E., Asada, S., and Sugimoto, Y. (2005). Estrogen Mediated
Post Transcriptional Down-Regulation of Breast Cancer Resistance
Protein/ABCG2. Cancer Research. 65(2): 596-604.
Ingvarsson, S., Sigbjornsdottir., Bjarnveig, I., Huiping, C., Hafsteindottir, S.H.,

Ragnarson, G., et al. (2002). Mutation Analysis of The CHK2 Gene in
Breast Carcinoma ang Other Cancers. Breast Cancer Research. 4: R4.
Juliano, R.L., and Ling, V. (1976). A Surface Glycoprotein Modulating Drug

Permeability in Chinese Hamster Ovary Cell Mutants. Biochimica et
Biophysica Acta. 455(1): 152-162.
Junedi, S., Susidarti, R.A., dan Meiyanto, E. (2010). Naringenin Meningkatkan

Efek Sitotoksik Doxorubicin pada Sel Kanker Payudara T47D Melalui
Induksi Apoptosis. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 8(2): 85-90.
Karim, A.A.N., Ibrahim, D.M., Kntayya, B.S., Rukayadi, Y., Hamid, A.H., and
Razis, A.F.A. (2016). Moringa oleifera Lam: Targeting
Chemoprevention. Asian Pasific Journal of Cancer Prevention. 17(8):
3675-3686.
Kemenkes RI. (2015). Kanker Pembunuh Papan Atas. Edisi 55. Jakarta:
Kemenkes RI Mediakom. Hal. 11, 25.
Khalafalla, M. M., Abdellatef, E., Dafalla, H. M., Nassrallah, A. A., Aboul-Enein,

K. M., Lightfoot, D. A., et al. (2010). Active principle from Moringa
oleifera Lam leaves effective against two leukemias and a
hepatocarcinoma. Afr J Biotechnol; 9(49), 8467-8471.
King, R.J.B. (2000). Cancer Biology. Edisi 2. London School of Biological

Sciences, University of Surrey. Hal. 228-231, 263-264.
Kitagawa, S. (2006). Inhibitory Effect of Polyphenols on P-Glycoprotein

Mediated Transport. Biologycal & Pharmaceutical Bulletin. 29(1): 1-6.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Kresno, B.S. (2014). Biomarker Keganasan Patobiologi, Patofisiologi dan
Aplikasi Klinik. Edisi Pertama. Badan Penerbit FKUI. Jakarta. Hal. 46-
51.
Krisnadi, A. D. (2015). Kelor Super Nutrisi. Pusat Informasi dan Pengembangan

Tanaman Kelor Indonesia. Blora. Hal. 8-11.
Kumar, R., Babu, B.P.,Bharavi, R., Venkateswarlu, U., Devi, V. R., and Srilatha,
C. (2011) Protective Effect of Moringa oliefera Lam Leaf Extract in
Paracetamol Induced Hepatotoxic Rat. IJPI’s Journal of Pharmacology
and Toxicology. 1:5.
Kupcsik, L., and Martin, J.S. (2011). Mammalian Cell Viability: Methods and
Protocols. New York: Humana Press. Hal. 13-18.
Kurniasih. (2013). Khasiat dan Manfaat Daun Kelor. Yogyakarta: Pustaka Baru
Press. Hal. 166-169.
Lapenna, S., and Giordano, A. (2009). Cell Cycle Kinases as Therapeutic Targets
for Cancer, Nat. Rev. Drug Discov. 8(7): 547-566.
Lay, B.W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo

Persada. Hal. 57-58, 109.
Leone, A.,Spada, A., Battezzatti, A., Schiraldi, A.,Aristil, J., and Bertoli, S.
(2015). Cultivation, Genetic, Ethnopharmacology, Phytochemistry and
Pharmacology of Moringa oleifera Leaves: An Overview. International
Journal of Molecular Science. 16, 12791-12835
Luqman, S., Srivastava, S., Kumar, R., Maurya, A. K., and Chanda, D. (2012).
Experimental assessment of Moringa oleifera leaf and fruit for its
antistress, antioxidant, and scavenging potential using in vitro and in vivo
assays. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.
Article ID 519084. doi:10.1155/2012/519084. Hal. 1-12.
Machana,S., Natthida,W., Sahapat, B.,Bungorn S., and Thaweesak, T. (2011).

Cytotoxic And Apoptotic Effects of Six Herbal Plants Against The
Human Hepatocarcinoma (HepG2) Cell Line. Chinese Medicine. 6:39.
Marzban, H., Belgio, D.R.M., Alizadeh, J., Ghavami, S., Zachariah, M.R., and
Rastegar, M. (2015). Cellular commitment in developing cerebellum.
Frontiers in Cellular Neuroscience. 8(450): 1-26.
Mechetner, E., Kyshtoobayeva, A., Zonis, S., Kim, H., Stroup, R., Garcia, R., et
al. (1998). Levels of Multidrug Resistance (MDR1) PGlycoprotein
Expression by Human Breast Cancer Correlate with in vitro Resistance to
Taxol and Doxorubicin. Clinical Cancer Research. 4(2): 389-398.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Meiyanto, E., Susidarti, A.R., Handayani, S., and Rahmi, F. (2008). Ekstrak
Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat
Proliferasi dan Memacu Apoptosis Sel MCF-7. Majalah Farmasi
Indonesia. 19(1): 12-19.
Mutiara, T., Harijono. Estiasih, T., and Sri, E.W. (2013) Effect lactagogue
moringa leaves (Moringaoleifera Lam) powder in rats, J. Basic Appl. Sci.
Res. 3(4). ISSN 2090-4304. 430–434.
Nair, S., and Varalakshmi, K. N. (2011). Anticancer, cytotoxic potential of

Moringa oleifera extracts on HeLa cell line. Journal of Natural
Pharmaceuticals. 2(3), 138-142.
Nilius, B., Amana, G.S., Guderman, T., Jahn, R., Lill, R., Offermanns, S., et al.
(2013). Review of Physiology, Biochemistry and Pharmacology.
Springer International Publishing Switzerland. Hal. 44.
Nugroho, A.E., Hermawan, A., Putri, D.D.P., Novika, A., and Meiyanto, E.
(2013). Combinational Effects of Hexane Insoluble Fraction of Ficus
septica Burm. F. and Doxorubicin Chemotherapy on T47D Breast Cancer
Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 3(4): 297-302.
Obakan, P., Arisan, D.E., Gurkan, C.A., and Unsal, P.N. (2017). Breast cancer
and flavonoid as treatment strategy. Intech Open Science. Hal. 305-326.
Onuki, R., Kawasaki, H., Baba, T., and Taira, K. (2004). Analysis of A
Mitochondrial Apoptotic Pathway Using Bid-Targeted Ribozymes in
Human MCF7 Cells in the Absence of A Caspase-3-Dependent Pathway.
Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 13 (2): 75-82.
Osman, H.M., Shayoub, M.E., Babiker, E.M., Faiza, A.O., Ahmed, M.E.,
Elhassan, M., et al. (2015). Assesment of acute toxicity and LD50 of
Moringa oleifera ethanolic leave extract in albino rats and rabbits.
Journal of Medicinal and Biological Science Research. 1(4): 38-43.
Padanilam, B.J. (2003). Cell Death Induced by Acute Renal Injury: A Perspective
on the contributions of Apoptosis and Necrosis. Am J Physiol Renal
Physiol. 284: 608–627.
Pao, M.L., Clamon, G., Maclndoe, J., White, M., Hukku, B., and Peterson, W.D.
(1985). Development of A New Human Breast Cancer Line Ia-270.
Breast Cancer Researh and Treatment. 5(1): 23-29.
Park, M.H., and Hong, H.J. (2016). Roles of NF-kB in Cancer and Inflamatory
Diseases and Their Therapeutic Approaches. Cell.5(15): 1-13.
Petronelli,A.,Pannitteri, G., and Testa, U. (2009). Triterpenoids as New Promising

Anticancer Drugs. PubMed. 20(10):880-892.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Quiles, J.L, Huertas, J.R., Battino, M., Mataix, J., and Ramerez. M.C. (2002).
Antioxidant Nutrients and Adriamycin Toxicity. Toxicol, 180 : 79-95.
Rao, A. V., Devi, P. U., and Kamath, R. (2001). In vivo radioprotective effect of
Moringa oleifera leaves. Indian Journal of Experimental Biology,; 39(9),
858-863.
Rasjidi, I. (2010). Epidemiologi Kanker Pada Wanita. Cetakan pertama. Jakarta:

CV. Sagung Seto. Hal. 130-131.
Ratnasari A.A., Winarto, H., Purbadi, S., Sekarutami, M.S., dan Sutrisna, B.
(2016). Hubungan Ekspresi NF-kB dengan Respons Radiasi Kanker
Serviks Stadium Lokal Lanjut. Departemen Obstetri dan Ginekologi FK
Universitas Sebelas Maret. 4(1): 31-36.
Reynolds, C.P., and Maurer, B.J. (2005). Evaluating Response to Antineoplastic

Drug Combinations in Tissue Culture Models. Methods in Molecular
Medicine. 110: 173-183.
Ruddon, R.W. (2007). Cancer Biology. New York: Oxford University Press. Hal.
117-196.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning A

Laboratory. Edisi Kedua. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Hal. 75-79.
Sari, I.D.,Yasin, H.A., Arovia, A.R., Mayani, I.U., dan Darmawan, E. (2015).
Peningkatan Sistem Imun oleh Kombinasi Ekstrak Etanol Awar-Awar
(Ficus septica burm. F) dan Ekstrak etanol Daun Kelor (Moringa
oleifera) Sebagai Kokemoterapi Kanker pada Tikus Betina Galur
Sprague Dawley yang Diinduksi Doksorubisin. Pharmaciana. Vol.5. No.
2: 147-152.
Satyanarayana, A., and Kaldis, P. (2009). Mammalian Cell-cycle Regulation:

Several Cdks, Numerous Cyclins, and Diverse Compensatory
Mechanisms. Oncogene. 28: 2925-2939.
Sayed, M.D., El-Attar, M.M., and Husein, M.A. (2009). Evaluation of

Flowcytometric Immunophenotyping and DNA Analysis for Detection of
Malignant Cells in Serosal Cavity Fluids. Diagn cytopathol. 37(7): 498-
504.
Schafer, J.M., Lee, E.S., Regan, R.M., Yao, K., and Jordan, V.C. (2000). Rapid
Development of Tamoxifen-stimulated Mutant p53 Breast Tumors
(T47D) in Athymic Mice. Clinical Cancer Research. 6: 4373-4380.
Sekti, D.A., Mubarok, M.F., Armandani, I., Junedy, S., dan Meiyanto, E. (2010).
Ekstrak Etanolik Daun Awar-Awar (Ficus septica Burm. F) Memacu
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Apoptosis Sel Kanker Payudara MCF-7 Melalui Penekanan Ekspresi
Bcl-2. Majalah Obat Tradisional. 15(3): 100-104.
Sharma, R.A. (2000). Cancer Chemoprevention: A Clinical Reality. Journal of the

Royal Society of Medicine. 93(10): 518-520.
Sharma, G., Tyagi, A.K., Singh, R.P., Chan, D.C.F., and Agarwal, R. (2004).
Synergistic Anti-Cancer Effect of Grape sedd Extract and Covenentional
Cytotoxic Agent Doxorubicin Against Human Breast Carcinoma Cells,
Breast Cancer Research and Treatment. 85(1): 1-12.
Singal, P.K., and Iliskovic, N. (1998). Doxorubicin-Induced Cardiomyopathy. The

New England Journal of Medicine. 339: 900-905.
Singal, P.K., Li, T., Kumar, D., Danelisen, I., and Iliskovic, N. (2000).
Adriamycin-induced heart failure: mechanism and modulation. Mol Cell
Biochem. 207: 77–86.
Sinha, M., Das, D. K., Bhattacharjee, S., Majumdar, S., and Dey, S. (2011). Leaf
extract of Moringa oleifera prevents ionizing radiation-induced oxidative
stress in mice. Journal of Medicinal Food. 14(10), 1167-1172.
Sinha, M., Das, D. K., Datta, S., Ghosh, S., and Dey, S. (2012). Amelioration of
ionizing radiation induced lipid peroxidation in mouse liver by Moringa
oleifera Lam. leaf extract. National Journal of Medicinal Food. vol 50:
209-215
Siu, W.Y., Yam, C.H., and Poon, R.Y.C. (1999). G1 versus G2 Cell Cycle After
Adriamycin-induced Damage in Mouse Swiss3T3 Cells. Federation of
European Biochemical Societies. 461: 299-305.
Sreelatha, S.A., Jeyachitra, B., and Padma, P.R. (2011). Antiproliferation and
induction of apoptosis by Moringa oleifera leaf extraction human cancer
cells. Food Chem Toxicol. 6: 1270-5.
Srivastava, S.K., and Singh, S.V. (2004). Cell cycle arrest, apoptosis induction
and inhibition of nuclear factor kappa B activation in antiproliverative
activity of benzyl isothiocyanate against human pancreatic cancer cells.
Carcinogenesis. 25(9): 1701-1709.
Stitcha, K.R., Kenney, P.M., Boysen, G., Liang, H., Su, X., Wang, M., et al.
(2002). Effects of benzyl isothiocyanate phenethyl isothiocyanate on
DNA adduct formation by a mixture of benzo[a]pyrene and 4-
(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in A/J mouse lung.
Carcinogenesis. 23(9): 1433-1439.
Sudiana, I.K. (2011). Patobiologi Molekuler Kanker. Jakarta: Salemba Medika.

Hal. 1, 45-52.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Suismono, Widaningrum, dan Miskiyah. (2007). Bahaya Kontaminasi Logam
Berat dalam Sayuran dan Alternatif Pencegahan Cemarannya. Buletin
Teknologi Pascapanen Pertanian. 3: 16-27.
Surh, Y.J. (1999). Molecular Mechanism of Chemopreventive Effect of Selected

Dietary and Medicinal Phenolic Substances. Mutation Research. 428(1-
2): 305-327.
Sutalangka, C. Wattanathorn, J. Muchimapura, S., and Thukham-mee. (2013)

Moringa oleifera mitigates memory impairment and neurodegenerationin
animal model of age-related dementia, Oxid. Med. Cell. Longev. : 1–9.
Tsao, A.S., Kim, E.S., and Hong, W.K. (2004). Chemoprevention of Cancer. CA
Cancer Journal for Clinicians. 54(3): 150-180.
Torosian, M.H. (2002). Breast Cancer: A Guide to Detection and Multidiciplinary

Theraphy. New Jersey: Humana Press Inc. Hal. 12-13.
Tyagi, A.K., Agarwal, C., Chan, D.C.F., and Agarwal, R. (2004). Synergistic
Anti-Cancer Effects of Silibinin with Conventional Cytotoxic Agents
Doxorubicin, Cisplatin and Carboplatin against Human Breast
Carcinoma MCF-7 and MDA-MB468 Cells. Oncology Reports. 11(2):
493-499.
Vermeulen, K., Berneman, Z.N., and Bockstaele, D.R. (2003). Cell Cycle and
Apoptosis, Cell Prolif. 36(3): 165-175.
Wargasetia, T.L. (2005). Terapi Gen pada Penyakit Kanker. JKM. 4(2): 24- 37.
Wattanapitayakul, S.K., Chularojmontri, L., Niumsakul, S., Herunsalee, A.,

Charuchongkolwongse, S., and Bauer, J.A. (2005). Screening of
Antioxidants from Medicinal Plants for Cardioprotective Effect Against
Doxorubicin Toxicity. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology.
96(1): 80-87.
Weerapreeyakul, N., Nonpunya, A., Barustux, S., Thitimetharoch, T., and

Sripanidkulchai, B. (2012). Evaluation of The Anticancer Potential of Six
Herbs Against A Hepatoma Cell Line. Chinese Medicine. 7(15): 1-7.
World Health Organization. (1998). Quality Control Methods For Herbal

Materials. WHO/PHARM/92.559. Geneva: WHO. Hal. 33-35.
Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M., Xue, H.Y., Babakhanian, K., and Wu,
X.Y. (2006). A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake and
Retention in Multidrug Resistant Breast Cancer Cells Using A Polymer-
Lipid Hybrid Nanoparticle System. The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics. 317(3): 1372-1381.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Xiao, Z., Chen, Z., Gunasekera, A.H., Sowin, T.J., Rosenberg, S.H., Fesik, S., et
al. (2003). Chk1 Mediates S and G2 Arrest Through Cdc25A
Degradation in Response to DNA-Damaging Agents. J. Biol. Chem.
278(24): 21767-21773.
Yang, F., Teves, S.S., Kemp, J.C., and Henikoff, S. (2014). Doxorubicin, DNA
Torsion, and Chromatin Dynamics. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA). 1845(1): 84-89.
Yudissanta, A., dan Ratna, M. (2012). Analisis Pemakaian Kemoterapi pada

Kasus Kanker Payudara dengan Menggunakan Metode Regresi Logistik
Multinominal (Studi Kasus Pasien di Rumah Sakit “X” Surabaya. Jurnal
Sains dan Seni ITS. 1(1): D112-D117.
Yurina, V., Sujuti, H., Rahmani, E. and Nopitasari, A.R. (2014). The Role of
Moringa oleifera Extract Leaves in Inducing Apoptosis in Breast Cancer
Cell Line. International Journal of Pharmacological and Pharmaceutical
Science. Vol.1, No. 12: 204-211
Zampieri, L., Bianchi, P., Ruff, P., and Arbuthnot, P. (2002). Differential
Modulation by Estradiol of P-glycoprotein Drug Resistance Protein
Expression in Cultured MCF7 and T47D Breast Cancer Cells. Anticancer
Res. 22(4): 2253-9.
Zhang, N., Fu, J.N., and Chou, C.T. (2016). Synergistic Combination of
Microtubule Targeting Anticancer Fludelone with Cytoprotective
Panaxytriol Derived from Panax Ginseng Against Mx-1 Cells in vitro:
Experimental Design and Data Analysis Using the Combination Index
Method. Am. J. Cancer. Res. 6(1): 97-104.
Zhao, L., Wientjes, M.G., and Au, J.L.S. (2004). Evaluation of Combination
Chemotherapy: Integration of Nonlinear Regression, Curve Shift,
Isobologram, and Combination Index Analyses. Clinical Cancer
Research. 10: 7994-8004.
Zhou, J., Liu, M., Aneja, R., Chandra, R., Lage, H., and Joshi, H.C. (2006).
Reversal of P-glycoprotein Mediated Multidrug Resistance in Cancer
Cells by The c- Jun-NH2-Terminal Kinase. Cancer Research. 66(1): 445-
452.
Zimmermann, M., and Meyer, N. (2011). Mammalian Cell Viability Annexin

V/7-AAD Staining in Keratinocytes. Editor Martin James
Stoddart.Switzerland: Humana Press. Hal.57-63.
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 1. Hasil identifikasi daun kelor (Moringa oleifera L.)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 2. Gambar daun kelor (Moringa oleifera L.)
Keterangan:
a. Gambar daun kelor
b. Gambar simplisia daun kelor (SDK)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 3. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk SDK
Untano
Keterangan (Perbesaran 10 x 40):

1. Berkas pembuluh dan mesofil
2. Rambut penutup
3. Epidermis atas dengan jaringan palisade
4. Epidermis bawah dengan stomata tipe anomositik
5. Mesofil dengan sel minyak
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 4. Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi bertingkat
Serbuk simplisia
dimaserasi dengan n-heksana
Ampas Maserat
dimaserasi dengan etil asetat dipekatkan
Ampas Maserat Ekstrak n-heksana
dimaserasi dengan etanol dipekatkan diskrining
Hasil
Maserat Ampas
dipekatkan
Ekstrak etil asetat*
Ekstrak etanol diskrining
Hasil
diskrining
Hasil
Keterangan : * = Uji Sitotoksik dan Uji Kombinasi dengan doksorubisin
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 5. Perhitungan kadar air SDK
Volume air (mL)

%Kadar air = x100%
Berat sampel (g)
Nama Berat Volume Volume Selisih Kadar Rata-

Sampel awal (ml) akhir volume air (%) rata (%)
(g) (ml) (ml)
5,0017 2,10 2,40 0.30 5,99
SDK 5,0019 2,40 2,65 0,25 4,99 5,32
5,0020 2,65 2,90 0,25 4,99
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 6. Perhitungan kadar sari larut air SDK
Berat sari (g) 100

% Kadar sari larut air = x x 100%
Berat sampel (g) 20
Nama Berat sampel Berat sari (g) Kadar sari Rata-rata (%)
(g) larut dalam air
(%)
5,0130 0,3148 31,40
SDK 5,0160 0,3464 34,55 32,78
5,0140 0,3249 32,40
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 7. Perhitungan kadar sari larut etanol SDK
Berat sari (g) 100

% Kadar sari larut dalam etanol = x x 100%
Berat sampel (g) 20
Nama Berat sampel Berat sari (g) Kadar sari Rata-rata (%)
(g) larut dalam
etanol (%)
5,0160 0,1457 14,55
SDK 5,0150 0,1435 14,30 14,42
5,0150 0,1444 14,40
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 8. Perhitungan kadar abu total SDK
Berat abu (g)

% Kadar abu total = x 100%
Berat sampel (g)
Nama Berat sampel Berat abu (g) Kadar abu Rata-rata (%)
(g) total (%)
2,0232 0,2178 10,77
SDK 2,0225 0,2127 10,52 10,67
2,0226 0,2168 10,72
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 9. Perhitungan kadar abu tidak larut asam SDK
Berat abu (g)

% Kadar abu tidak larut asam = x 100%
Berat sampel (g)
Nama Berat sampel Berat abu (g) Kadar abu Rata-rata (%)
(g) total (%)
2,0232 0,0190 0,94
SDK 2,0225 0,0197 0,97 0,95
2,0226 0,0189 0,93
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 10. Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7
a. Kontrol sel dan kontrol media
Absorbansi Rata-rata Absorbansi Rata-rata Absorbansi

kontrol sel absorbansi kontrol media absorbansi kontrol sel
kontrol sel kontrol media dikurangi kontrol
media
0,463 0,097
0,438 0,447 0,098 0,097 0,350
0,441 0,096
b. EEADK
Contoh pada kadar 1000 ug/mL:
0,137 - 0,097
% Sel Hidup = x 100%
0,350
% Sel Hidup = 11,51%
Kadar % sel hidup

Absorbansi Absorbansi rata-rata
(µg/mL) rata-rata
1000 0,134 0,136 0,142 0,137 11,51
500 0,179 0,183 0,175 0,179 23,41
250 0,284 0,281 0,292 0,286 53,85
125 0,305 0,304 0,307 0,305 59,47
62.5 0,330 0,347 0,354 0,344 70,41
31.25 0,343 0,342 0,344 0,343 70,22
15.625 0,388 0,362 0,377 0,376 79,54
c. Doksorubisin
0,249 - 0,097
0,350
Kadar % sel hidup

(µg/mL) rata-rata
24 0,248 0,248 0,251 0,249 43,39
12 0,268 0,262 0,258 0,263 47,29
6 0,267 0,260 0,271 0,266 48,24
3 0,288 0,289 0,272 0,283 53,09
1,5 0,310 0,293 0,308 0,304 58,99
0,75 0,283 0,302 0,298 0,294 56,33
0,375 0,333 0,321 0,315 0,323 64,51
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 11. Perhitungan persen sel hidup sel T47D

media
0,833 0,070
0,782 0,797 0,071 0,070 0,727
0,777 0,069
b. EEADK
0,102 - 0,070
0,797
% Sel Hidup = 4,35%
Kadar % sel hidup

(µg/mL) rata-rata
1000 0,099 0,103 0,103 0,102 4,35
500 0,161 0,189 0,179 0,176 14,62
250 0,480 0,527 0,567 0,525 62,51
125 0,569 0,564 0,642 0,592 71,72
62.5 0,627 0,600 0,667 0,631 77,18
31.25 0,637 0,763 0,672 0,691 85,34
15.625 0,723 0,749 0,726 0,733 91,11
c. Doksorubisin
0,215 - 0,070
0,797
Kadar % sel hidup

(µg/mL) rata-rata
24 0,234 0,209 0,202 0,215 19,94
12 0,183 0,188 0,187 0,186 15,95
6 0,236 0,235 0,229 0,233 22,46
3 0,402 0,399 0,360 0,387 43,58
1,5 0,523 0,523 0,523 0,523 62,28
0,75 0,500 0,516 0,521 0,512 60,82
0,375 0,523 0,486 0,493 0,501 59,21
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 12. Perhitungan persen sel hidup sel Vero

media
0,405 0,105
0,407 0,405 0,108 0,116 0,289
0,402 0,135
b. EEADK
0,143 - 0,116
0,289
% Sel Hidup = 9,47%
Kadar % sel hidup

(µg/mL) rata-rata
1000 0,142 0,143 0,145 0,143 9,47
500 0,367 0,382 0,379 0,376 90,07
250 0,395 0,387 0,388 0,390 94,92
125 0,401 0,388 0,399 0,396 96,99
62.5 0,381 0,400 0,354 0,378 90,88
31.25 0,384 0,380 0,403 0,389 94,57
15.625 0,367 0,383 0,381 0,377 90,42
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 13. Bagan pembuatan media RPMI
RPMI Sachet* 2 g Hepes 2 g NaHCO3
Dimasukkan ke dalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 mL aquabidest steril
Dihomogenkan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1 N atau NaOH 1 N)
Ditambahkan aquabidest steril sampai 1 liter

Larutan media
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2 – 8oC
Media RPMI
Keterangan : * = dapat diganti media DMEM atau M199 tergantung sel
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 14. Bagan pembuatan media komplit (MK) RPMI
Fetal Bovine Penisilin- Fungizone RPMI ad

Serum (FBS) Streptomisin (amphotericin B) 100%
(10%) (2%) (0,5%)
%)
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK
Disimpan pada suhu 2 – 8oC
Media Komplit (MK)
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 15. Bagan penumbuhan sel
Sel MCF-7, T47D dan Vero
Diambil dari freezer
Diambil beberapa tetes
Konikel
Dimasukkan ke dalam konikel yg berisi RPMI
Disentrifus 6000 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatan
Ditambahkan 4 mL MK RPMI
Diresuspensi hingga homogen

Flask
Dimasukkan ke dalam flask
Ditambahkan 5 mL MK ke dalam setiap flask
Dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO2
Sel MCF-7, T47D

dan Vero
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 16. Bagan panen sel
Sel MCF-7,
T47D dan Vero
Dipersiapkan dan dikondisikan
Diamati apakah sel telah konfluen 80%
Dibuang MK dari flask dengan mikropipet

Sel yang melekat
Dicuci sel 2 x dengan PBS
Ditambahkan 400 µL trypsine-EDTA 0,25%
Diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 5 menit
Ditambahkan 4 mL MK
Di resuspensi dengan mikropipet
Diamati sel dibawah mikroskop inverted
Diresuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
Ditransfer sel ke dalam tabung konikel
Panen Sel MCF-7,

T47D dan Vero
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 17. Bagan penghitungan sel
Kultur Sel T47D,

MCF-7 dan Vero
Diambil 10 µL panenan sel
Dipipetkan ke dalam hemositometer
Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel
T47D, MCF-7
dan Vero
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 18. Bagan pembuatan larutan uji
EEADK
Ditimbang sebanyak 10 mg
Dimasukkan ke dalam polytube
Dilarutkan dalam 200 µL DMSO
Divortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi

1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL,
62,5 µg/mL, 31,25 µg/mL, dan 15,625 µg/mL
Larutan Uji
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 19. Bagan pengujian sitotoksik
Sel
Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan

kepadatan 1 x 104/ sumuran
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang medium
Ditambahkan medium baru
Ditambahkan larutan uji
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
Dicuci dengan PBS
Ditambahkan 100 µL MK dan 10 µL MTT (5 mg/mL)
Diinkubasi selama 4 - 6 jam
Ditambahkan SDS (sebagai stopper)
Dibungkus dengan aluminium foil
Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan Microplate reader (λ=595 nm)
Absorbansi
Dihitung % sel hidup
Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan

SPSS 24
IC50
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 20. Bagan pengujian flowsitometri
Sel
Ditanam pada microplate 6 sumuran dengan

kepadatan 1 x 106 / sumuran
Dibuang medium
Ditambahkan medium baru
Larutan dipindahkan ke dalam tabung konikel

berdasarkan konsentrasi
Dicuci dengan 1000 µL PBS. Hasil cucian

dipindahkan konikel berdasarkan konsentrasi
Ditambahkan 250 µL Tripsin - EDTA
Ditambahkan MK untuk menginaktivasi Tripsin.

Kumpulkan ke dalam konikel berdasarkan konsentrasi
Dicuci lagi dengan PBS. Hasil cucian dipindahkan

konikel berdasarkan konsentrasi
Larutan yang terkumpul di masing-masing konikel

disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 2500
rpm
Medium dibuang, ditambahkan PBS, diresuspensi.

Suspensi dikumpulkan dalam polytube
disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 3000

rpm
larutan dibuang. Endapan di staining dengan

Propidium Iodida
diukur dengan Flowsitometer

Profil Siklus Sel
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 21. Bagan pengujian imunositokimia
Sel
Dimasukkan 5 x 104 sel tiap sumuran yang telah diberi

coverslip pada bagian dasarnya
Dibuang medium lalu ditambah dengan medium baru
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
Dicuci dengan PBS
Difiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit
Metanol dibuang.
Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL
Dicuci dengan aquades masing-masing 500 µL,
dikeringkan
Ditambahkan 300 µL H2O2 (1 : 9 dalam aquades).
Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL,
dikeringkan
Ditambahkan prediluted blocking serum. Disimpan
pada temperatur kamar. Didiamkan selama 15 menit.
Ditambahkan antibodi primer Bcl-2/siklin D1.
Didiamkan selama 60 menit. Dicuci dengan PBS 2 x
masing-masing 500 µL, dikeringkan
Ditambahkan antibodi sekunder. Didiamkan 20 menit.
Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL,
dikeringkan.
Ditambahkan 100 µL larutan label. Didiamkan 10
menit. Dicuci dengan PBS 2 x masing-masing 500 µL,
dikeringkan.
Ditambahkan 100 µL campuran 1 : 100 DAB
Substrat. Didiamkan 10 menit. Dicuci dengan
aquadest masing-masing 500 µL, dikeringkan.
Digenangi dengan 100 µL Mayer Hematoxicilin.
Didiamkan 10 menit. Dicuci dengan aquadest hingga
bersih masing-masing 500 µL,
Coverslip diambil dari masing-masing sumuran
menggunakan pinset. Coverslip diletakkan di atas kaca
objek dikeringkan.
Ditambahkan etanol absolut
Ditambahkan xylol
Ditambahkan entelan untuk melekatkan coverslip
Diamati di bawah mikroskop cahaya
Ekspresi Bcl2/siklin
D1
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 22. Sel MCF-7, T47D dan sel Vero di bawah mikroskop
a b
Keterangan: a. Sel MCF-7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10)
b. Sel MCF-7 setelah diberi larutan uji (sel mengalami
perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)
a b
Keterangan: a. Sel T47D sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10)
b. Sel T47D setelah diberi larutan uji (sel mengalami
a b
Keterangan: a. Sel Vero sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10)
b. Sel Vero setelah diberi larutan uji (sel mengalami
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 23. Microplate-96 sumuran
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

a. 1000 µg/mL
b. 500 µg/mL
c. 250 µg/mL
d. 125µg/mL
e. 62,5 µg/mL
f. 31,25 µg/mL
g. 15,625 µg/mL
h. Kontrol media
i. Kontrol sel
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 24. Hasil IC50 EEADK pada sel MCF-7 dengan analisis probit SPSS
24
Confidence Limits
95% Confidence Limits for Konsentrasi ekstrak 95% Confidence Limits for log ( Konsentrasi
etil asetat daun kelor terhadap MCF 7 ekstrak etil asetat daun kelor terhadap MCF 7b)
Probability Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound
a
PROBIT 0.01 26306.351 10540.278 101626.276 4.420 4.023 5.007
0.02 14350.659 6331.778 47908.449 4.157 3.802 4.680
0.03 9769.830 4580.054 29746.051 3.990 3.661 4.473
0.04 7315.951 3588.469 20791.048 3.864 3.555 4.318
0.05 5782.181 2941.715 15540.436 3.762 3.469 4.191
0.06 4732.834 2483.366 12132.866 3.675 3.395 4.084
0.07 3970.683 2140.216 9767.706 3.599 3.330 3.990
0.08 3393.024 1873.069 8045.467 3.531 3.273 3.906
0.09 2940.971 1658.902 6745.419 3.468 3.220 3.829
0.1 2578.285 1483.242 5736.137 3.411 3.171 3.759
0.15 1495.114 931.278 2938.110 3.175 2.969 3.468
0.2 969.588 641.209 1732.119 2.987 2.807 3.239
0.25 668.690 463.846 1104.769 2.825 2.666 3.043
0.3 478.979 345.317 740.884 2.680 2.538 2.870
0.35 351.591 261.298 514.378 2.546 2.417 2.711
0.4 262.193 199.197 366.330 2.419 2.299 2.564
0.45 197.398 151.880 266.077 2.295 2.181 2.425
0.5 149.286 115.074 196.314 2.174 2.061 2.293
0.55 112.900 86.138 146.608 2.053 1.935 2.166
0.6 85.000 63.377 110.351 1.929 1.802 2.043
0.65 63.387 45.612 83.246 1.802 1.659 1.920
0.7 46.529 31.924 62.486 1.668 1.504 1.796
0.75 33.328 21.538 46.239 1.523 1.333 1.665
0.8 22.985 13.799 33.300 1.361 1.140 1.522
0.85 14.906 8.162 22.851 1.173 .912 1.359
0.9 8.644 4.192 14.310 .937 .622 1.156
0.91 7.578 3.566 12.789 .880 .552 1.107
0.92 6.568 2.991 11.321 .817 .476 1.054
0.93 5.613 2.465 9.904 .749 .392 .996
0.94 4.709 1.985 8.532 .673 .298 .931
0.95 3.854 1.551 7.199 .586 .191 .857
0.96 3.046 1.160 5.899 .484 .064 .771
0.97 2.281 .811 4.620 .358 -.091 .665
0.98 1.553 .504 3.340 .191 -.298 .524
0.99 .847 .238 2.006 -.072 -.624 .302
a. A heterogenity factor is used.
b. Logarithm base = 10
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 25. Hasil IC50 Doksorubisin pada sel MCF-7 dengan analisis probit
SPSS 24
Confidence Limits
95% Confidence Limits for Konsentrasi 95% Confidence Limits for log ( Konsentrasi
doksorubisin terhadap MCF 7 doksorubisin terhadap MCF 7b)
a
PROBIT 0.01 1.419E9 1.502E7 2.088E13 9.152 7.022 13.320
0.02 1.475E8 1901150.767 7.343E11 8.169 6.279 11.866
0.03 3.509E7 641849.903 8.781E10 7.545 5.807 10.944
0.04 1.191E7 283528.783 1.777E10 7.076 5.453 10.250
0.05 4948534.292 145847.985 4.847E9 6.694 5.164 9.685
0.06 2342401.672 82816.975 1.604E9 6.370 4.918 9.205
0.07 1215799.522 50416.036 6.085E8 6.085 4.703 8.784
0.08 675862.068 32323.914 2.555E8 5.830 4.510 8.407
0.09 396225.327 21573.231 1.160E8 5.598 4.334 8.065
0.1 242361.327 14867.107 5.612E7 5.384 4.172 7.749
0.15 31666.757 3178.650 2777002.853 4.501 3.502 6.444
0.2 6282.607 930.669 255230.322 3.798 2.969 5.407
0.25 1568.515 323.542 33021.580 3.195 2.510 4.519
0.3 451.117 124.775 5283.894 2.654 2.096 3.723
0.35 142.163 51.273 973.362 2.153 1.710 2.988
0.4 47.524 21.786 197.859 1.677 1.338 2.296
0.45 16.462 9.261 43.531 1.216 .967 1.639
0.5 5.799 3.690 10.609 .763 .567 1.026
0.55 2.043 1.189 3.198 .310 .075 .505
0.6 .708 .293 1.212 -.150 -.533 .084
0.65 .237 .062 .496 -.626 -1.208 -.305
0.7 .075 .012 .200 -1.128 -1.936 -.698
0.75 .021 .002 .077 -1.669 -2.728 -1.115
0.8 .005 .000 .027 -2.271 -3.615 -1.576
0.85 .001 .000 .008 -2.974 -4.650 -2.110
0.9 .000 .000 .002 -3.858 -5.955 -2.781
0.91 .000 .000 .001 -4.071 -6.270 -2.943
0.92 .000 .000 .001 -4.303 -6.613 -3.119
0.93 .000 .000 .000 -4.558 -6.990 -3.312
0.94 .000 .000 .000 -4.843 -7.410 -3.528
0.95 .000 .000 .000 -5.168 -7.891 -3.774
0.96 .000 .000 .000 -5.549 -8.455 -4.062
0.97 .000 .000 .000 -6.018 -9.148 -4.417
0.98 .000 .000 .000 -6.642 -10.071 -4.889
0.99 .000 .000 .000 -7.625 -11.524 -5.632
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 26. Hasil IC50 EEADK pada sel T47D dengan analisis probit SPSS 24
Confidence Limits
etil asetat daun kelor terhadap T47D ekstrak etil asetat daun kelor terhadap T47Db)
a
PROBIT 0.01 5369.694 2648.687 15995.479 3.730 3.423 4.204
0.02 3622.178 1910.949 9673.375 3.559 3.281 3.986
0.03 2821.555 1552.450 7035.154 3.450 3.191 3.847
0.04 2338.204 1327.280 5538.727 3.369 3.123 3.743
0.05 2006.791 1168.077 4560.986 3.303 3.067 3.659
0.06 1761.984 1047.442 3866.979 3.246 3.020 3.587
0.07 1572.036 951.760 3346.652 3.196 2.979 3.525
0.08 1419.403 873.360 2941.026 3.152 2.941 3.468
0.09 1293.496 807.538 2615.434 3.112 2.907 3.418
0.1 1187.494 751.221 2348.067 3.075 2.876 3.371
0.15 833.467 555.776 1505.531 2.921 2.746 3.178
0.2 629.068 436.060 1060.783 2.799 2.640 3.026
0.25 494.162 353.033 787.982 2.694 2.548 2.897
0.3 397.860 291.068 605.362 2.600 2.464 2.782
0.35 325.459 242.500 475.908 2.512 2.385 2.678
0.4 268.980 203.070 380.370 2.430 2.308 2.580
0.45 223.683 170.206 307.722 2.350 2.231 2.488
0.5 186.559 142.270 251.175 2.271 2.153 2.400
0.55 155.596 118.183 206.296 2.192 2.073 2.314
0.6 129.393 97.223 170.042 2.112 1.988 2.231
0.65 106.939 78.899 140.241 2.029 1.897 2.147
0.7 87.478 62.862 115.288 1.942 1.798 2.062
0.75 70.431 48.848 93.972 1.848 1.689 1.973
0.8 55.326 36.636 75.352 1.743 1.564 1.877
0.85 41.758 26.022 58.647 1.621 1.415 1.769
0.9 29.309 16.800 43.092 1.467 1.225 1.634
0.91 26.907 15.102 40.036 1.430 1.179 1.602
0.92 24.520 13.446 36.972 1.390 1.129 1.568
0.93 22.140 11.831 33.885 1.345 1.073 1.530
0.94 19.753 10.252 30.752 1.296 1.011 1.488
0.95 17.343 8.703 27.543 1.239 .940 1.440
0.96 14.885 7.175 24.209 1.173 .856 1.384
0.97 12.335 5.656 20.671 1.091 .753 1.315
0.98 9.609 4.119 16.769 .983 .615 1.225
0.99 6.482 2.495 12.078 .812 .397 1.082
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 27. Hasil IC50 doksorubisin pada sel T47D dengan analisis probit
SPSS 24
Confidence Limits
95% Confidence Limits for Konsentrasi 95% Confidence Limits for log ( Konsentrasi
doksorubisin terhadap T47D doksorubisin terhadap T47Db)
a
PROBIT 0.01 1059.196 345.891 6006.264 3.025 2.539 3.779
0.02 487.024 182.184 2226.091 2.688 2.261 3.348
0.03 297.485 121.206 1186.814 2.473 2.084 3.074
0.04 205.313 89.156 739.820 2.312 1.950 2.869
0.05 151.850 69.419 503.907 2.181 1.841 2.702
0.06 117.466 56.082 363.544 2.070 1.749 2.561
0.07 93.788 46.498 273.134 1.972 1.667 2.436
0.08 76.667 39.303 211.505 1.885 1.594 2.325
0.09 63.826 33.721 167.668 1.805 1.528 2.224
0.1 53.916 29.278 135.432 1.732 1.467 2.132
0.15 26.811 16.246 56.175 1.428 1.211 1.750
0.2 15.387 10.100 28.116 1.187 1.004 1.449
0.25 9.556 6.656 15.670 .980 .823 1.195
0.3 6.230 4.521 9.385 .795 .655 .972
0.35 4.191 3.106 5.935 .622 .492 .773
0.4 2.877 2.130 3.924 .459 .328 .594
0.45 2.000 1.445 2.692 .301 .160 .430
0.5 1.398 .965 1.897 .145 -.015 .278
0.55 .977 .634 1.360 -.010 -.198 .133
0.6 .679 .409 .981 -.168 -.388 -.008
0.65 .466 .258 .706 -.332 -.589 -.151
0.7 .314 .157 .502 -.504 -.803 -.299
0.75 .204 .092 .349 -.689 -1.036 -.457
0.8 .127 .051 .234 -.896 -1.297 -.631
0.85 .073 .025 .147 -1.138 -1.602 -.832
0.9 .036 .010 .082 -1.441 -1.988 -1.085
0.91 .031 .008 .072 -1.514 -2.081 -1.145
0.92 .025 .007 .061 -1.594 -2.183 -1.211
0.93 .021 .005 .052 -1.681 -2.294 -1.284
0.94 .017 .004 .043 -1.779 -2.419 -1.365
0.95 .013 .003 .035 -1.891 -2.562 -1.457
0.96 .010 .002 .027 -2.022 -2.729 -1.565
0.97 .007 .001 .020 -2.183 -2.935 -1.698
0.98 .004 .001 .013 -2.397 -3.208 -1.874
0.99 .002 .000 .007 -2.734 -3.640 -2.152
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 28. Hasil IC50 EEADK pada sel Vero dengan analisis probit SPSS 24
Confidence Limits
etil asetat daun kelor terhadap sel Vero ekstrak etil asetat daun kelor terhadap sel Verob)
a
PROBIT 0.01 80057.511 8193.918 6.003E8 4.903 3.913 8.778
0.02 47812.449 5893.529 1.658E8 4.680 3.770 8.220
0.03 34475.319 4777.757 7.335E7 4.538 3.679 7.865
0.04 26956.446 4077.903 3.973E7 4.431 3.610 7.599
0.05 22067.439 3583.633 2.414E7 4.344 3.554 7.383
0.06 18611.324 3209.475 1.580E7 4.270 3.506 7.199
0.07 16029.352 2912.969 1.090E7 4.205 3.464 7.037
0.08 14022.983 2670.220 7818513.251 4.147 3.427 6.893
0.09 12417.181 2466.576 5780590.354 4.094 3.392 6.762
0.1 11102.084 2292.403 4378442.908 4.045 3.360 6.641
0.15 6984.107 1689.374 1389105.747 3.844 3.228 6.143
0.2 4832.025 1321.170 559597.693 3.684 3.121 5.748
0.25 3522.727 1066.599 257325.175 3.547 3.028 5.410
0.3 2652.309 877.165 128509.074 3.424 2.943 5.109
0.35 2038.967 729.062 67784.359 3.309 2.863 4.831
0.4 1588.655 609.007 37106.564 3.201 2.785 4.569
0.45 1247.888 508.877 20829.490 3.095 2.707 4.319
0.5 983.968 423.349 11885.677 2.993 2.627 4.075
0.55 775.866 348.720 6849.786 2.890 2.542 3.836
0.6 609.438 282.284 3969.058 2.785 2.461 3.599
0.65 474.845 222.018 2307.613 2.677 2.346 3.363
0.7 365.038 166.562 1348.515 2.562 2.222 3.130
0.75 274.842 115.616 797.892 2.439 2.063 2.903
0.8 200.370 70.815 483.601 2.302 1.850 2.684
0.85 138.628 35.788 301.472 2.142 1.554 2.479
0.9 87.208 13.398 188.272 1.941 1.127 2.275
0.91 77.972 10.425 170.330 1.892 1.018 2.231
0.92 69.043 7.905 153.414 1.839 .828 2.186
0.93 60.401 5.807 137.322 1.781 .764 2.138
0.94 52.022 4.097 121.859 1.716 .612 2.086
0.95 43.874 2.740 106.813 1.642 .438 2.029
0.96 35.917 1.700 91.935 1.555 .230 1.963
0.97 28.084 .940 76.876 1.448 -.027 1.886
0.98 20.250 .425 61.027 1.306 -.372 1.786
0.99 12.094 .120 42.877 1.083 -.921 1.632
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 29. Nilai Persen hidup sel MCF-7 dengan pemberian kombinasi
EEADK-Doksorubisin
Kontrol sel
0,447 0,459 0,439 0.433 0.438 0,432
Kontrol media
0,086 0,095 0,088 0,097 0,096 0,097
a. Absorbansi dan persen hidup perlakuan tunggal
µg/mL EEADK % µg/mL %

Doksorubisin
Hidup Hidup
74,63 0,360 0,356 0,402 80,28 2,90 0,302 0,303 0,302 60,08
55,97 0,379 0,371 0,373 80,76 2,18 0,294 0,308 0,307 60,27
37,31 0,390 0,395 0,392 85,93 1,45 0,298 0,310 0,304 60,56
18,66 0,397 0,432 0,438 94,54 0,73 0,328 0,318 0,320 65,73
b. Absorbansi dan persen hidup perlakuan kombinasi EEADK-Doksorubisin
Dokso 2,90 µg/mL % %

Dokso 2,18 µg/mL
Hidup Hidup
EEADK 74,63 0,270 0,275 0,503 50,79 0,284 0,276 0,282 53,85
µg/mL 55,97 0,264 0,261 0,267 49,07 0,274 0,255 0,253 48,11
37,31 0,271 0,253 0,267 48,97 0,261 0,244 0,242 44,76
18,66 0,267 0,273 0,271 50,89 0,241 0,245 0,236 42,37

Dokso 0,73 µg/mL
Hidup Hidup
EEADK 74,63 0,166 0,167 0,146 19,10 0,287 0,274 0,266 52,42
µg/mL 55,97 0,155 0,152 0,137 15,75 0,276 0,277 0,265 51,56
37,31 0,164 0,136 0,140 15,37 0,266 0,256 0,244 46,58
18,66 0,162 0,153 0,137 16,52 0,244 0,245 0,245 43,51
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 30. Nilai Persen hidup sel T47D dengan pemberian kombinasi
EEADK-Doksorubisin
Kontrol sel
0,820 0,843 0,835 0.875 0.840 0,835
Kontrol media
0,079 0,077 0,083 0,084 0,087 0,093
a. Absorbansi dan persen hidup perlakuan tunggal

% µg/m %
µg/mL EEADK Doksorubisin
Hidup L Hidup
93,28 0,689 0,697 0,668 79,32 0,70 0,128 0,119 0,119 5,04
69,96 0,771 0,756 0,728 88,16 0,53 0,127 0,127 0,124 5,57
46,64 0,747 0,812 0,781 91,90 0,35 0,127 0,154 0,148 7,811
23,32 0,786 0,803 0,798 93,58 0,18 0,383 0,348 0,354 36,68
b. Absorbansi dan persen hidup perlakuan kombinasi EEADK-Doksorubisin

Dokso 0,53 µg/mL
Hidup Hidup
EEADK 93,28 0,135 0,136 0,144 7,20 0,129 0,128 0,132 6,02
µg/mL 69,96 0,147 0,160 0,155 9,26 0,126 0,134 0,140 6,54
46,64 0,165 0,171 0,164 10,94 0,135 0,129 0,127 6,14
23,32 0,163 0,177 0,176 11,64 0,141 0,137 0,135 7,12

Dokso 0,18 µg/mL
Hidup Hidup
EEADK 93,28 0,146 0,152 0,154 8,82 0,344 0,360 0,324 34,17
µg/mL 69,96 0,145 0,140 0,133 7,33 0,315 0,304 0,318 30,17
46,64 0,139 0,134 0,137 6,98 0,302 0,318 0,264 27,83
23,32 0,140 0,130 0,130 6,54 0,264 0,273 0,243 23,26
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 31. Indeks kombinasi (IK) EEADK - doksorubisin pada sel MCF-7
dengan Compusyn system version 1
Experiment Name: sherly

Date: 05042018
File Name: E:\sherly kombinasi MCF-7.cse
Description Kombinasi Doxorubisin dan EEADK
Drug: Doksorubisin (Dox) [ppm]
Drug: Etilasetat Daun Kelor (EEADK) [ppm]
Drug Combo: Kombinasi Dox EEADK MCF-7 (CI) (Dox+EEADK)
Data for Drug: Dox [ppm]

Dose Effect
2.9 0.6
2.18 0.6
1.45 0.61
0.73 0.66
4 data points entered.
X-int: 1.28432
Y-int: 0.24857 +/- 0.01547
m: -0.1935 +/- 0.05066
Dm: 19.2450
r: -0.9378
Data for Drug: EEADK [ppm]

Dose Effect
74.63 0.8
55.97 0.81
37.31 0.86
18.66 0.95
X-int: 2.32436
Y-int: 2.70584 +/- 0.34226
m: -1.1641 +/- 0.20976
Dm: 211.035
r: -0.9690
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 31. (Lanjutan)
CI Data for Non-Constant Combo: CI (Dox+EEADK)

Dose Dox Dose EEADK Effect CI
2.9 74.63 0.51 0.55129
2.9 55.97 0.49 0.37881
2.9 37.31 0.48 0.26470
2.9 18.66 0.51 0.27680
2.18 74.63 0.53 0.60282
2.18 55.97 0.48 0.32250
2.18 37.31 0.45 0.18897
2.18 18.66 0.42 0.08838
1.45 74.63 0.19 0.10181
1.45 55.97 0.16 0.06384
1.45 37.31 0.15 0.03985
1.45 18.66 0.17 0.02267
0.73 74.63 0.52 0.43617
0.73 55.97 0.52 0.34145
0.73 37.31 0.47 0.17985
0.73 18.66 0.44 0.08279
Combination Index Plot
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 32. Indeks kombinasi (IK) EEADK - doksorubisin pada sel T47D
dengan Compusyn system version 1
Experiment Name: Sherly

Date: 5 April 2018
File Name: E:\sherly compusyn T47D.cse
Description Kombinasi Doxorubisin dan EEADK
Drug: Doxorubisin (DOX) [ppm]
Drug: etilasetat daun kelor (EEADK) [ppm]
Drug Combo: Kombinasi Doxo dan EEADK (CI) (DOX+EEADK)
Data for Drug: DOX [ppm]

Dose Effect
0.7 0.05
0.525 0.055
0.35 0.078
0.175 0.37
X-int: -0.9469
Y-int: -1.6892 +/- 0.19487
m: -1.7838 +/- 0.41472
Dm: 0.11300
r: -0.9500
Data for Drug: EEADK [ppm]

Dose Effect
93.28 0.79
69.96 0.88
46.64 0.92
23.32 0.94
X-int: 2.67270
Y-int: 2.57295 +/- 0.44849
m: -0.9627 +/- 0.25960
Dm: 470.656
r: -0.9344
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 32. (Lanjutan)
CI Data for Non-Constant Combo: CI (DOX+EEADK)

Dose DOX Dose EEADK Effect CI
0.7 93.28 0.07 1.46653
0.7 69.96 0.093 1.74194
0.7 46.64 0.11 1.93005
0.7 23.32 0.12 2.03372
0.525 93.28 0.061 1.01501
0.525 69.96 0.065 1.05161
0.525 46.64 0.062 1.01912
0.525 23.32 0.071 1.10257
0.35 93.28 0.088 0.85253
0.35 69.96 0.073 0.75577
0.35 46.64 0.07 0.73327
0.35 23.32 0.065 0.69797
0.175 93.28 0.34 1.16729
0.175 69.96 0.3 1.02478
0.175 46.64 0.28 0.94923
0.175 23.32 0.23 0.80080
Combination Index Plot
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 33. LAF (Laminar Air Flow), mikroskop inverted, dan inkubator CO2
Keterangan: Laminar Air Flow
Keterangan : Mikroskop inverted
Keterangan : Inkubator CO2
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Lampiran 34. Microplate reader dan Flowsitometer
Keterangan : Microplate reader
Keterangan: Flowsitometer
Universitas
Sumatera Utara
Utara
Universitas
Sumatera Utara
Utara

Skripsi Kelor

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Skripsi Kelor

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

TESIS

EFEK KOMBINASI EKSTRAK DAUN KELOR (Moringa

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

Nama Mahasiswa : Sherly H. Hutagaol

Nomor Induk Mahasiswa : 167014003

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Efek Kombinasi Ekstrak Daun Kelor (Moringa

Komisi Penguji Tesis

Ketua Komisi Penguji : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.

Sekretaris Komisi Penguji : Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.

Anggota Komisi Penguji : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hasibuan, S.Si., Apt.

Yuandani, M.Si., Ph.D., Apt

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama Mahasiswa : Sherly H. Hutagaol

Nomor Induk Mahasiswa : 167014003

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Efek Kombinasi Ekstrak Daun Kelor (Moringa

menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.

Medan, September 2018

terhingga sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis

Doksorubisin Terhadap Penekanan Ekspresi Siklin D1 Dan Bcl-2 Pada Sel

Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Selama

Sumatera Utara yang sekaligus sebagai pembimbing yang telah menyediakan

fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi

Magister Farmasi Fakultas Farmasi serta yang membimbing, mengarahkan,

memberikan dorongan dan semangat sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan tesis ini.

Farmasi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera.

membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat sehingga

penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan tesis ini.

masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini.

6. Bapak Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt., sebagai Kepala Laboratorium

Farmakognosi beserta staf.

Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada

Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan,

pengetahuan khususnya bidang farmasi.

Medan, September 2018

Penggunaan kombinasi kemoterapi, yaitu senyawa kemoprevensi

Kata kunci: Daun kelor, doksorubisin, T47D, MCF-7, sitotoksik, indeks

The application of a combination chemotherapy which chemoprevention

Keywords: Kelor leaves, doxorubicin, T47D, MCF-7, cytotoxic, combination

LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ........................................................... iii

LEMBAR PENGESAHAN TESIS ............................................................ iv

SURAT PERNYATAAN ........................................................................... v

KATA PENGANTAR ................................................................................ vi

ABSTRAK ................................................................................................. vii

DAFTAR ISI .............................................................................................. x

DAFTAR TABEL ...................................................................................... xvi

DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xvii

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xix

DAFTAR SINGKATAN ................................................................ ............ xxi

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ...................................................................... 1

1.2 Kerangka Pikir Penelitian ..................................................... 7

1.3 Perumusan Masalah .............................................................. 8

1.4 Hipotesis ............................................................................... 8

1.5 Tujuan Penelitian .................................................................. 9

1.6 Manfaat Penelitian ................................................................ 9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................... 11

2.1 Siklus Sel .............................................................................. 11