1.

Mikroorganisme yang diisolasi dari tanah, air atau

udara, contoh : Streptomyces yang memproduksi
streptomisin dan tetrasiklin.
2. Semisintesis : molekul prekursor diproduksi melalui
fermentasi mikroorganisme, lalu dimodifikasi secara
kimia, contoh : penisilin dan sefalosporin
3. Sintesis, contoh : kloramfenikol
4. Bakteriofaga
5. Metabolit sekunder dari tumbuhan atau hewan yang
berkhasiat sebagai zat antimikroba
§ Penggunaan secara empiris oleh masyarakat
§ Buku/pustaka pengobatan tradisional
§ Media massa : cetak dan elektronik
§ Penelitian lanjutan yang disarankan
Seleksi Zat Antimikroba dari Tanah/Air/Udara
§ Seleksi/skrining antimikroba
§ Pembuatan kurva pertumbuhan
§ Uji aktivitas antimikroba

§ Pemisahan antimikroba
§ Pemurnian antimikroba

§ Identifikasi antimikroba
§ Uji banding antimikroba
 SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

encerkan inokulasi inkubasi

dekantasi 4x24 jam

suspensi tanah supernatan Supernatan Media agar Koloni bakteri

encer dicungkil
+ NaCl fis

Uji aktivitas
antibakteri

inkubasi isolasi inkubasi

inokulasi

Zona hambat Media+bakteri

Biakan murni Media uji
bakteri
§ Biakan murni diinokulasikan ke medium cair
(fermentasi)à tiap satu jam disampling
§ Sampel-sampel disentrifugasi dan ditentukan
PMV (Packed Mycelia Volume) dengan
menentukan % volume endapan/volume
sampel (v/v %)
§ Plot PMV terhadap waktu pengambilan
sampel (t) dalam suatu kurva pertumbuhan
§ Supernatan dari berbagai sampel disaring dengan filter
bakteri à diuji aktivitas antimikrobanya untuk menentukan
titik maksimum untuk panen zat antimikroba
§ Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara,
yaitu melalui metode turbidimetri dan metode difusi agar à
seperti penentuan potensi antibiotika
Perbedaannya :
§ Uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan
ada/tidaknya aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba
terbaik dari suatu kelompok bahan
§ Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan
prosentase kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika
pembanding dari jenis yang sama
§ Biakan murni difermentasi dalam volume medium
cair yang lebih banyak sampai titik maks fermentasi
à disentrifugasi
§ Supernatan diekstraksi dengan berbagai pelarut
organik dalam corong pisah
§ Berbagai ekstrak diuji aktivitas antimikrobanya
kembali
§ Setelah diperoleh pelarut yang cocok, supernatan
diekstraksi dengan pelarut tersebut à dipekatkan
dengan rotary evaporator/freeze drying à EKSTRAK
KENTAL
Dan lain-lain….
§ Seleksi/skrining antimikroba
§ Uji aktivitas antimikroba
§ Pemisahan & pemurnian antimikroba

§ Identifikasi antimikroba
§ Uji banding antimikroba
§ Tumbuhan dideterminasi, bagian tumbuhan
diambil dan dibuat simplisia
§ Simplisia dihaluskan dan diayak sampai
derajat kehalusan tertentu
§ Serbuk simplisia diekstraksi dengan
berbagai pelarut organik
§ Ekstrak dipekatkan dengan rotary
eveporator/freeze drying à EKSTRAK
KENTAL
§ Ekstrak kental diuji aktivitas antimikrobanya
terhadap mikroba tertentu

§ Skrining fitokimia dilakukan terhadap

konsentrat untuk mengetahui golongan senyawa
yang terkandung di dalam ekstrak
 PEMURNIAN ZAT ANTIMIKROBA

KLT KLT Fraksi dgn Rf

Ekstrak pekat fraksi2 sama digabung
K. kolom

evaporasi

Fraksi pekat

Uji aktivitas

Larutan2 dari kaca+penampak KLT preparatif

pita bercak -> kerok pita Fraksi prospektif
pelarut organik
Uji aktivitas,
evaporasi
KLT 2 dimensi Uji aktivitas
konsentrat Zat murni Kristal
KLT prep 2 murni
kristalisasi
dimensi
Uji kemurnian kristal
Penentuan struktur
§ Ekstrak ditutulkan pada KLT à dipisahkan
menggunakan berbagai pengembang à disemprot
penampak noda à diperoleh pengembang yang
dapat memisahkan berbagai noda pada ekstrak à
pengelusi pada kromatografi kolom
§ Ekstrak dikromatografi kolom à tiap fraksi
ditampung à KLT kembali à fraksi2 dengan Rf sama
digabungkan, dipekatkan dan diuji aktivitas
antimikrobanya à fraksi di KLT preparatif
 PEMURNIAN ZAT ANTIMIKROBA

KLT KLT Fraksi dgn Rf

Ekstrak pekat fraksi2 sama digabung
K. kolom

evaporasi

Fraksi pekat

Uji aktivitas
Larutan2 dari kaca+penampak KLT preparatif
pita bercak -> kerok pita Fraksi prospektif
pelarut organik
Uji aktivitas,
evaporasi
KLT 2 dimensi Uji aktivitas
konsentrat Zat murni Kristal
KLT prep 2 murni
kristalisasi
dimensi
Uji kemurnian kristal
Penentuan struktur
§ Fraksi prospektif di KLT preparatif à
tutup sebagian
KLT dengan kaca, lalu semprot dengan penampak
noda à pita-pita yang tertutup kaca dikerok &
dimasukkan dalam vial à tambah pelarut organik
yang mengendapkan silika gel
§ Supernatan diuji aktivitas antimikrobanya à yang
terbaik dipekatkan
§ Konsentrat
di KLT 2 dimensi untuk mengetahui
kemurniannya à jika belum murni (terbentuk ekor),
dimurnikan dengan KLT preparatif 2 dimensi
§ Hasil pemurnian diuji aktivitas antimikrobanya à dipekatkan
untuk memperoleh kristal
§ Kemurnian kristal diuji melalui penentuan TL (titik lelehnya) à
jika rentang TL lebar, dilakukan rekristalisasi
§ Kristal antimikroba di KLT bersama dengan zat-zat antimikroba
lain yang telah ada à dilihat kesamaan Rf nya
§ Jika tidak ada yang sama, dilakukan elusidasi struktur
§ MIC dan MBC digunakan untuk menghitung
dosis minimal/MEC zat antimikroba dalam
suatu sediaan
§ Penentuan MIC dan MBC sebaiknya
dilakukan terhadap fraksi atau kristal murni,
setelah uji aktivitas antimikroba
§ Variasi konsentrasi yang digunakan untuk
penentuan MIC dan MBC dimulai dari
konsentrasi yang dipakai untuk uji aktivitas
antimikroba
§ Uji stabilitas
mikrobiologi à perhitungan koloni
mikroba. Uji ini dilakukan pada rentang waktu tertentu
utk mengetahui pengaruh waktu penyimpanan thd
stabilitas mikrobiologi sediaan atau mengetahui
efektivitas zat pengawet dalam sediaan
§ Uji aktivitas
antimikroba dari sediaan à aktivitas
antimikroba sediaan dibandingkan aktivitas zat aktif
saja à utk mengetahui pengaruh formulasi sediaan thd
aktivitas antimikroba zat aktifnya
§ Penentuan koefisien fenol dilakukan terhadap sediaan
antiseptika atau desinfektan
§ Untuk mendapatkan uji aktivitas mikroba yang bernilai
semi kuantitatif, maka dilakukan uji banding fraksi atau
kristal murni zat antimikroba terhadap antibiotika
pembanding dari jenis berbeda à seperti uji potensi
antibiotika
Perbedaannya :
§ Uji banding antimikroba bersifat semi kuantitatif, artinya
perhitungan matematis yang dihasilkan harus duji
kebenarannya kembali secara mikrobiologi
§ Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang
menghasilkan prosentasi kekuatan suatu antibiotika
terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama
 PROSEDUR UJI BANDING AKTIVITAS

Pengenceran zat uji dan antibiotik pembanding

Uji aktivitas antimikroba

Pengukuran zona hambat

Pembuatan grafik dan persamaan garis (x = logaritma

konsentrasi (ppm); y = diameter hambat zat antimikroba (mm))

Nilai banding aktivitas

§ Zat uji maupun antibiotika pembanding
diencerkan dalam berbagai konsentrasi (yang
sama), lalu diujikan ke mikroba uji yang sama
dalam cawan petri berukuran besarà diameter
hambat diukur
§ Data diameter hambat antibiotika pembanding
(mm) diplot ke sumbu y dan logaritma
konsentrasinya (ppm) diplot ke sumbu x à buat
grafik à hitung persamaan garisnya
§ Lakukan hal yang sama terhadap zat uji
§ Dengan menggunakan persamaan garis antibiotika
pembanding, tentukan diameter hambat antibiotika
pembanding pada suatu konsentrasi ttt. Contoh : y =
7,4561x -2,1559, maka pada 10 ppm (x = 1)
diperoleh diameter hambat y = 5,3 mm
§ Masukkan nilai y tsb ke dalam persamaan garis zat
uji. Contoh : y = 4,8588x -12,99, maka jika y = 5,3
mm, diperoleh nilai x = 3,674. Antilog 3,674 adalah
5812 ppm à konsentrasi zat uji
§ Nilai banding : konsentrasi zat uji/konsentrasi zat pembanding
§ Pada contoh : 5812/10 = 1 : 0,00172 Artinya : kekuatan 1 ppm
zat uji sebanding dengan 0,00172 ppm antibiotika pembanding
PELESTARIAN KULTUR MIKROBA
§ Transfer Periodik dan Pendinginan
§ Minyak Mineral Miring
§ Pembekuan dalam Media Pertumbuhan

§ Pengeringan
§ Lyofilisasi

§ Ultracold Freezing
PRESERVATION OF MICROBIAL CULTURES:
TRANSFER PERIODIK & PENDINGINAN
§ Banyak laboratorium menggunakan "agar miring;"
perawatan harus diambil untuk menghindari
kontaminasi
§ Kultur stok dipindahkan secara
aseptik pada interval
yang sesuai ke media segar dan diinkubasi,
kemudian disimpan pada suhu 4 ° C sampai
dipindahkan lagi
§ Masalah utamadengan kemungkinan perubahan
genetik pada galur; sebagian besar laboratorium
membutuhkan cara untuk menyimpan penyimpanan
"jangka panjang" dari stok genetik asli
PRESERVATION OF MICROBIAL CULTURES:
MINYAK MINERAL OIL MIRING
§ Minyak mineral steril ditempatkan di atas
pertumbuhan pada agar miring untuk mengawetkan
kultur untuk jangka waktu yang lebih lama di lemari
es
§ Masalah kontaminasi; berantakan; banyak organisme
sensitif terhadap hal ini; umumnya itu adalah teknik
yang buruk dan terkadang tidak berfungsi dengan
baik
PRESERVATION OF MICROBIAL CULTURES:
PEMBEKUAN DALAM MEDIA
PERTUMBUHAN
§ Digunakan sebagai strategi penyimpanan "jangka
panjang"
§ Kultur kaldu organisme dibekukan pada -20°C
§ Seringkali, gliserin steril (gliserol)
ditambahkan
pada konsentrasi akhir 25 – 50%; ini membantu
mencegah pembentukan kristal es dan
meningkatkan kelangsungan hidup banyak
organisme
PRESERVATION OF MICROBIAL CULTURES:
PENGERINGAN
§ Cocok untuk beberapa spesies bakteri
§ Sampel ditumbuhkan pada disk kertas steril yang
jenuh dengan nutrisi, kemudian disk dibiarkan
kering di udara dan disimpan secara aseptik
§ Dilarutkan dengan menjatuhkan disk ke media kaldu
nutrisi
PRESERVATION OF MICROBIAL CULTURES:
LYOFILISASI
§ Cocok untuk banyak spesies bakteri serta jamur dan
virus
§ Kultur kaldu ditempatkan dalam ampul khusus dan
dipasang pada pompa vakum; vakum
menghilangkan semua air dari sel meninggalkan
bubuk "beku-kering"
§ Kultur dilarutkan dengan menambahkan kaldu ke
bubuk terliofilisasi dan menginkubasinya
§ Dianggap sebagai metode penyimpanan jangka
panjang terbaik untuk sebagian besar spesies
bakteri
PRESERVATION OF MICROBIAL CULTURES:
ULTRACOLD FREEZING

§ Mirip
dengan pembekuan, tetapi pada suhu yang
sangat dingin
§ Pada sekitar -70 hingga -80 °C, dalam nitrogen cair
atau dalam unit freezer ultra dingin