MAKALAH FITOKIMIA 1

DENSITOMETRI

Disusun Oleh :

Vattrik Aldiansyah 19330107

Nurul Badriyah 19330110

Alifia Farhani Az Zuhri 19330112

Devi Estriani 19330115

Cecilia Benedicta D S 19330118

Nurjuliana Maulidia 19330121

Rohman Wakid 19330122

Lusi Maharani 19330123

Angela Fransisca COS 19330124

Dosen Pengampu :
Apt. Dr. Tiah Rachmatiah, M.Si.,

PROGRAM STUDI FARMASI

INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL

JAKARTA

2021/2022
 KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas kuasa-Nya kami
dapat menyelesaikan Makalah Fitokimia 1 dengan judul Densitometri dengan tepat waktu.

Kami menyadari bahwa makalah ini tidak dapat terwujud tanpa bantuan dan dukungan dari
berbagai pihak, khususnya dosen pengampu kami yang telah memberikan arahan dan inspirasi
untuk membuat makalah ini. Oleh karena itu, kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-
besarnya kepada pihak-pihak yang telah berpartisipasi dalam pembuatan makalah ini, sehingga
makalah ini dapat selesai dengan baik.

Kami juga menyadari bahwa isi dari makalah ini masih jauh dari kesempurnaan, maka dari
itu kritikan dan saran dari pembaca yang bersifat membangun sangat diharapkan demi
kesempurnaan karya kami selanjutnya.

Jakarta, Desember 2021

Penyusun
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.2 Rumusan Masalah
1.3 Tujuan Penelitian

BAB II PEMBAHASAN

2.1 Pengertian densitometer

2.2 Prinsip Kerja KLT - Densitometri

2.3 Deteksi Bercak dan Komponen dari KLT- Densitometri

2.3.1 Deteksi Bercak

2.3.2 Komponen dari KLT - Densitometri

2.4 Kelebihan dan Kekurangan KLT- Densitometri

2.4.1 Kelebihan KLT – Densitometri

2.4.2 Kekurangan KLT - Densitometri

2.5 Metode Analisis KLT- Densitrometri

2.5.1 Analisis Kualitatif KLT – Densitrometri

2.5.2 Analisis Kuantitatif KLT – Densitrometri

2.5.3 Scanning Pengujian Kuantitatif

2.5.4 Cara Ekstraksi

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan

3.2 Saran

DAFTAR PUSTAKA
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Untuk analisis maupun kontrol kualitas dilaboratorium banyak menggunakan
kromatografi lapis tipis. Hal ini karena mudah dilakukan, reagen yang digunakan sensitive
dan selektif. Untuk penetapan kadar dapat menggunakan kombinasi KLT dan Densitometri
(KLT-Densitometri). Apabila dibandingkan dengan KCKT, KLT fase gerak yang
digunakan tidak ada batasan, sampel dapat ditetapkan kadarnya secara langsung, cepat,
ekonomis. Metode yang banyak digunakan untuk penetapan kadar aktif adalah KLT-
Densitometri.
KLT-Densitometri adalah salah satu metode yang cocok digunakan untuk kontrol
kualitas botani ekstrak karena akuisisi data yang cepat, sederhana, dan dapat diandalkan.
Metode densitometri memiliki kelebihan yaitu spesifikasi yang tinggi, hasil yang
didapatkan dipercaya, dapat dilakukan dengan mudah serta cepat, pemilihan fase gerak
akan memberikan fleksibilitas yang besar, dalam melakukan optimasi pemisahan dapat
dilakukan dengan berbagai macam teknik, biaya yang dikeluarkan dalam pengoperasian
relative murah salah satunya karena pelarut yang digunakan sedikit dan silica gel sebagai
fase diam dapat di dapat di daur ulang, serta mengubah polaritas pelarut dengan pelarut
campuran dapat dilakukan dalam waktu singkat.
Dengan metode KLT-Densitometri memberikan ketelitian, linearitas, serta
ketetapan untuk memenuhi persyaratan dan nilai LOD (Limit of Detection) dan LOQ
(Limit of Quantitation).

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud KLT-Densitometri?
2. Bagaimana prinsip Kerja KLT-Densitometri?
3. Bagaimana deteksi bercak dan komponen dari KLT-Densitometri?
4. Apa saja kelebihan dan kekurangan KLT-Densitometri?
 5. Apa saja metode analisis KLT-Densitometri?
6. Bagaimana cara ekstraksi KLT-Densitometri?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui dan memahami pengertian KLT-Densitometri.
2. Untuk mengetahui dan memahami prinsip kerja KLT-Densitometri.
3. Untuk mengetahui dan memahami deteksi bercak dan komponen dari KLT-
Densitometri.
4. Untuk mengetahui dan memahami kelebihan dan kekurangan KLT-Densitometri.
5. Untuk mengetahui dan memahami metode analisis KLT-Densitometri.
6. Untuk mengetahui dan memahami cara ekstraksi pada KLT-Densitometri
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian Densitometri (KLT-Densitometri)

Densitometri merupakan metode analisis instrumental pengukuran konsentrasi zona
kromatografi pada lapisan KLT tanpa merusak senyawa-senyawa yang telah terpisah. Meskipun
pada awalnya istrumen ini berdiri sendiri, namun sekarang telah terintegrasikan dengan komputer
yang mengontrol instrumen ini sehingga membuat instrumen ini makin reproduktif dan akurat
(standar deviasi ~1%). Prinsip dasar dari teknik densitometri ini adalah radiasi elektromagnetik
dengan panjang gelombang yang telah ditetapkan (biasanya, UV/Visible dari panjang gelombang
190 – 800 nm) yang bergerak sepanjang zona kromatografi yang sebelumnya telah ditentukan atau
sementara radiasi dilakukan lapisan KLT digerakkan oleh motor yang mengatur gerakan lempeng.

KLT-Densitometri Alat untuk pengukur kuantitatif secara langsung pada lempeng KLT
adalah densitometer yang terdiri dari alat mekanik yang menggerakkan lempeng atau alat pengukur
sepanjang sumbu x dan sumbu y, perekam, integrator atau komputer yang sesuai. Untuk zat yang
memberikan respon terhadap UV-cahaya tampak, fotometer dengan sumber cahaya, digunakan alat
optik yang mampu menghasilkan cahaya monokromatis dan foto sel dengan sensitivitas yang sesuai,
untuk mengukur pantulan. Pada pengukuran fluoresensi, diperlukan filter untuk mencegah cahaya
eksitasi mencapai fotosel dan hanya membiarkan emisi spesifik saja yang dapat lewat (Courtney,
2012).

Dalam densitometri penyerapan bintik-bintik pada pelat klt adalah dipindai oleh seberkas
cahaya monokromatik yang dibentuk menjadi gambar celah dengan panjang celah yang dipilih
sesuai dengan diameter tempat terbesar. Karena respon dari reflektansi- absorbansi pemindaian
nonlinier dengan konsentrasi, standar kalibrasi disertakan dengan setiap sampel berjalan. Akibatnya,
semua sampel, baik standar maupun yang tidak diketahui, mengalami kondisi kromatografi yang
persis sama, dan kesalahan sistematis tetap sangat sedikit. Minimum tipikal tingkat deteksi untuk
pengukuran penyerapan terlihat atau ultraviolet berkisar dari 100 pg hingga 100 ng per tempat
(Samples et al., 2004).
 Densitometer dan Autosampler (Wall, 2005)

2.2 Prinsip Kerja KLT-Densitometri

Prinsip kerja dari densitometri itu sendiri mengetahui luas area dan kromatogram pada plat
KLT. KLT yang sudah berisi bercak noda sampel dimasukkan kedalam alat TLC Scanner untuk
dilihat peak kromatogram dan luar area (AUC) kromatogram yang terdapat dalam plat KLT
tersebut. Plat KLT yang sudah mengandung kafein didalam suplemen pembakar lemak selanjutnya
dihitung kadarnya menggunakan densitometri. Plat KLT tersebut dimasukkan kedalam densitometer
dan dideteksi menggunakan sinar UV 254 nm.

Metode analisis instrumental berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit
yang merupakan noda pada KLT. Alat dilengkapi spektrofotometer yang mempunyai pancaran sinar
dengan panjang gelombang diatur dari 200-700nm. Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan,
sinar yang diserap di pantulkan atau sinar yang dipendarkan. Susunan optic densitometer tidak
banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection
photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer.

2.3 Deteksi Bercak dan Komponen dari KLT-Densitometri

2.3.1 Deteksi Bercak
Deteksi bercak dapat langsung dilakukan pada akhir eluasi jika senyawa tersebut memiliki
warna. Sedangkan untuk senyawa yang tidak berwana deteksi dapat dilakukan secara fisika ataupun
kimia. Secara fisika, deteksi bercak komponen umumnya dilakukan dengan melakukan pengamatan
di bawah sinar ultraviolet sebelum dan sesudah elusi. Panjang gelombang yang umum digunakan
adalah 366 nm dan 254 nm. Beberapa senyawa terlihat sebagai bintik fosforescen atau fluorescen.

Deteksi dibawah sinar UV merupakan metode deteksi pilihan pertama karena senyawa pada
KLT tidak akan rusak berbeda dengan deteksi secara kimia. Pada deteksi secara kimia dapat
merusak, karena reagen yang digunakan bisa saja merusak senyawa yang dipisahkan. Keuntungan
dari KLT yaitu fleksibilitas dalam penggunaan beberapa metode untuk identifikasi dan deteksi zona
dari senyawa yang dipisahkan.

Deteksi secara kimia, dilakukan dengan menyemprotan pereaksi kimia tertentu yang
memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua komponen. Penyemprotan dilakukan dari
samping ke samping atau dari atas ke bawah. Pada kondisi ideal, tiap komponen memberikan
warna yang khas bila diberi suatu pereaksi, kecuali untuk komponen-komponen yang memiliki
struktur kimia yang hampir sama akan memberikan warna yang hampir sama pula.

2.3.2 Komponen dari KLT-Densitometri

1) Detektor
Detektor pada alat TLC Scanner 3 CAMAG menggunakan photomultipliers. Komponen
didalam plot photomultipliers (PMT) sendiri adalah photomultipliers tube (tabung vakum
photomultiplier), photocathode (katoda metalik yang terbuat dari bahan logam multi alkali),
struktur dynode (berbentuk lempengan cekung) dan anoda (memiliki spectral sensitivity 185-
850 nm) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2) Monokromator
Monokromator adalah alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi
dengan satu panjang gelombang . Monokromator untuk radiasi ultraviolet, sinar tampak, dan
inframerah adalah serupa, yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin, dan prisma atau grating.
Terdapat 2 macam monokromator yaitu monokromator prisma Bunsen dan monokromator
grating Czerney-Turney (Estika, 2017).
3) Absorbansi
Berkas radiasi elektromagnet bila dilewatkan pada sampel kimia maka sebagian akan
terabsorpsi. Energi elektromagnet yang ditransfer ke molekul sampel akan menaikan tingkat
energi (tingkat tereksitasi). Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang
diserapnya (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.4 Kelebihan dan Kekurangan KLT-Densitometri

2.4.1 Kelebihan KLT-Densitometri
1) Spesifitasnya yang tinggi
2) Pengerjaan relatif cepat
3) Biaya pengoperasian relatif murah
 4) Polaritas pelarut atau pelarut campuran dapat diubah dalam waktu singkat dan jumlah pelarut
yang digunakan sedikit
5) Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin
kesahihanya dibanding metode KCKT, karena area noda kromatogram diukur pada posisi
lurus atau zig-zag menyeluruh.

2.4.2 Kekurangan KLT-Densitometri

1) Peralatan yang cukup kompleks
2) Harga yang terlalu mahal
3) Dapat diatasi menggunakan metode DETLC (Digitally Enhanced Thin Layer
Chromatograpy)

2.5 Metode Analisis KLT-Densitometri

2.5.1 Analisis Kualitatif KLT-Densitometri
Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau dilakukan penyarian
dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara spektroskopi. Tetapi adanya densitometer,
spektrogramnya dapat diuji.

Pada penggunaan KLT Densitometri dengan metode Analisis kuantitatif, analit-analit

dengan kadar sangat kecil yang merupakan hasil pemisahan dengan KLT. S.Levi dan Reisfeld
telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif ultramikro. Keduanya telah
berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250) ng, LSD
dengan kadar (2-150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda
(kromatogram) KLT.
2.5.2 Analisis Kuantitatif KLT-Densitometri
Suatu senyawa yang telah dipisahkan dari komponennya dapat dianalisis secara kuantitaf
dengan menggunakan analisis instrumental yang didasarkan pada radiasi elektromagnetik dengan
terndapat noda analit pada plat. KLT Densitometri digunakan untuk menentukan kadar senyawa
dengan cara noda yang terpisah pada plat KLT tersebut dimasukkan kedalam instrument yang
kadarnya ditentukan berdasarkan hubungan Area Under Curve (AUC) masing-masing noda pada
plat (Sherma, 1994).

KLT Densitometri dan Spektrofotometri memiliki mekanisme kerja yang sama tapi memiliki
perbedaaan pada sampel kompartemennya yaitu kuvet digunakan pada spektrofotometri sedangkan
KLT-Densitometri menggunakan lempeng. Baik KLT-Densitometri maupun Spektofotometri
memiliki rangkaian alat berupa sumber cahaya akan menuju monokromator untuk diubah dari
cahaya polikromatik menjadi cahaya monokromatik, selanjutnya cahaya yang telah diubah
dipancarkan ke dalam sampel kompartemen yaitu suatu lempeng kemudian dipantulkan dan cahaya
akan terdeteksi dengan detektor. Pembacaan yang didapatkan akan diperkuat dengan menggunakan
amplivier kemudian hasil yang didapat dibaca pada layar baca atau visual display (Sherma, 1994).

Dengan melakukan validasi terhadap metode analisa, linieritas akan ditentukan dengan
mengukur konsentrasi analit dan didapatkan gambaran serta informasi linieritas dengan
berdasarkan nilai slope (b), intersep (a), dan koefisien kolerasi (r). LOD merupakan jumlah terkecil
dari analit yang dapat terdeteksi dan LOQ adalah jumlah sampel terkecil yang digunakan untuk
penetapan secara kuantitatif dengan menggunakan presisi serta akurasi yang baik. Untuk parameter
ketelitian dapat digunakan tiga kadar dan dihitung nilai CV nya. Suatu metode dengan ketelitian
yang baik jika memiliki nilai CV kurang dari 5%. Selanjutnya dilakukan juga metode Recovery
untuk akurasi metode analisis dengan melihat ukuran kedekatan hasil yang uji yang didapatkan
dengan nilai yang sebenarnya dapat diterima (Sugihartini, et al., 2012)

2.5.3 Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara :

a. Cara memanjang
Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi sepanjang
garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik bila bercak berbentuk
bulat semetris.
b. Sistem zig-zag
Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok -belok sampai
garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1-X2.
2.5.4 Cara Ekstraksi

 Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung
pensil, kemudian diambil lapisan tipis bersama bercaknya.
 Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah pelarut yang sesuai
(etanol/ kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring kedalam labu takar, dan cairan
dijadikan volume sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji dengan alat
spektrofotometer
 Larutan yang daidapat di uji dengan spektrofotometer pada Panjang gelombang serapan
maksimumnya
 Karena pengenceran merupakan factor penting untuk perhitungan kadar senyawa yang di uji
secara kuantitatif
 BAB III
PENUTUP
3.1 kesimpulan
Densitometri merupakan metode analisis instrumental pengukuran konsentrasi zona
kromatografi pada lapisan KLT tanpa merusak senyawa-senyawa yang telah terpisah. Meskipun
pada awalnya istrumen ini berdiri sendiri, namun sekarang telah terintegrasikan dengan
komputer yang mengontrol instrumen ini sehingga membuat instrumen ini makin reproduktif dan
akurat (standar deviasi ~1%). Prinsip dasar dari teknik densitometri ini adalah radiasi
elektromagnetik dengan panjang gelombang yang telah ditetapkan (biasanya, UV/Visible dari
panjang gelombang 190 – 800 nm) yang bergerak sepanjang zona kromatografi yang sebelumnya
telah ditentukan atau sementara radiasi dilakukan lapisan KLT digerakkan oleh motor yang
mengatur gerakan lempeng.

Prinsip kerja dari densitometri itu sendiri mengetahui luas area dan kromatogram pada
plat KLT. KLT yang sudah berisi bercak noda sampel dimasukkan kedalam alat TLC Scanner
untuk dilihat peak kromatogram dan luar area (AUC) kromatogram yang terdapat dalam plat
KLT tersebut.

Metode analisis instrumental berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit
yang merupakan noda pada KLT. Alat dilengkapi spektrofotometer yang mempunyai pancaran
sinar dengan panjang gelombang diatur dari 200-700nm. Pengukuran sinar yang diserap dan
diteruskan, sinar yang diserap di pantulkan atau sinar yang dipendarkan. Susunan optic
densitometer tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan
alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer.

3.2 Saran

Alat densitometer harus dijaga dengan baik sesuai dengan prosedur pemeliharaan alat.
Densitometer juga harus selalu dikalibrasi untuk mengurangi kemungkinan kerusakan software
pada alat. Dan juga semoga makalah ini dapat menjadi pedoman bagi seluruh tenaga
laboratorium medik agar dapat lebih memahami tentang penggunaan dan perawatan alat
densitometer.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Sirait, M., 2007, Penuntunan Fitokimia dalam Farmasi, Bandung: ITB, 60-61.

2. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian,1 (3): 117-135.