PRAKTIKUM

KLT – VIDEO DENSITOMETRI

Sabtu, 30 November 2019

I. TUJUAN
Menentukan kadar paracetamol dan kafein pada sampel dengan metode KLT (Kromatografi Lapis
Tipis) – Video Densitometer

II. PRINSIP
Kromatografi merupakan metode pemisahan campuran komponen kimia yang dibawa fase gerak
melalui fase diam, berdasar pada perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam
oleh pengaruh fase gerak. Perbedaan migrasi ini disebabkan oleh perbedaan distribusi komponen-
komponen dalam kedua fase tersebut.

III. DASAR TEORI

Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT. Interaksi radiasi elektromagnetik
dengan noda KLT yang ditentukan adalah absorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau
pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Densitometri lebih dititik beratkan untuk analisis
kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih
dahulu dengan KLT. Densitometri merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa pada
lempeng kromatografi , menggunakan instrumen TLC scanner, pengukuran dilakukan dengan cara
mengukur serapan analit (cahaya yang diukur dapat berupa cahaya yang dipantulkan atau yang
diteruskan), pemadaman fluoresensi untuk lapisan yang mengandung bahan berfluorsensi analit
atau hasil eaksi analit.
Densitometri adalah alat pelacak kuantitatif yang sangat terkenal. Alat ini dilengkapi
dengan spektrofotometer yang panjang gelombangnya dapat diatur dari 200-700 nm. Alat tersebut
dinamakan TLC Scanner. Teknik penggunaannya didasarkan pada pengukuran sinar yang
diteruskan, diserap dan dipantulkan atau yang dipendarkan. Sinar yang dipantulkan mengalami
hambatan oleh pendukung lempeng dan keseragaman fase diamnya. Sinar yang dipantulkan
 dengan arah yang sudah pasti menuju bercak, maka arah pantulannya sehingga dapat dipantau
jumlah sinar yang diserap. Sinar ini sangat sensitif, maka untuk setiap senyawa dapat dicari dengan
serapan maksimalnya. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan
spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusu yaitu reflection photomultiflier,
sebagai pengganti photomultiflier pada spektrofotometer yang dapat memperbesar tenaga beda
potensial listrik sehingga mampu menggerakkan integrator
S. LEVI dan R. Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat analisis
kualitatif ultrmikro. Prinsipnya analisis kuantitatif dengan metode densitometri hampir sama
dengan spektrofotometri.
Penentuan kadar anlalit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT akan lebih terjamin
kesahihannya dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada
posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah
terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati
parabola (mulja,1985).

IV. ALAT DAN BAHAN

A. Alat :
1. Plat silica gel GF254 4. Lampu UV 254 dan 355 nm
2. Pipa kapiler volumetric 5. Hair dyer
3. Chamber 6. Kertas saring
B. Bahan :
1. Paracetamol 4. Aqaudest
2. Kafein 5. Etanol
3. Sediaan tablet kombinasi paracetamol dan kafein 6. Methanol

V. PROSEDUR
Penyiapan larutan baku
1. Larutan induk: Siapkan 200mg parasetamol dan 100mg kafein dan larutkan dalam 100mL
air-etanol (80:20, v/v).
 2. Larutan baku kerja: Siapkan larutan baku kerja dengan rentang konsentrasi parasetamol
200-800 [200, 300, 400, 500, 600, 700] ppm dan kafein 100-400 [100, 150, 200, 250, 300,
350] ppm.
3. Larutan baku parasetamol tunggal: Siapkan larutan baku parasetamol 50 mg dalam 50 mL
air-etanol (80:20, v/v). larutan baku ini untuk mengidentifikasi bercak parasetamol.

Penyiapan sampel
1. Gerus sampel sediaan dan timbang sebanyak 50mg
2. Larutan dalam 100mL air-etanol (80:20, v/v).
4. Encerkan sampai dengan rentang konsentrasi parasetamol dalam rentang 300-500ppm.

Penyiapan fase gerak

1. Siapkan fase gerak sebanyak 100 mL berupa campuran pelarut metanol:asam asetat
glasial:air= 25:4,3:70,7 (v/v).
2. Masukan ke dalam chamber, sehingga tinggi fase gerak dalam chamber dalam rentang 0,5-
1,0 cm.
3. Masukan kertas saring ke bagian pinggir dari chamber dan menyentuh ke dasar fase gerak.
4. Tutup chamber dan biarkan sampai jenuh dengan fase gerak.

Penotolan
1. Siapkan plat silika gel dengan ukuran 8 x 7 cm.
2. Tandai sebanyak 9 titik penotolan menggunakan pencil dengan jarak antara titik totol 0,5
cm.
3. Enam buah titik totol pertama digunakan untuk menotol 6 buah larutan baku kerja, 1 buah
titik totol untuk larutan baku parasetamol tunggal dan 2 buah titik totol digunakan untuk
menotol sampel.
4. Volume penotolan larutan baku kerja dan sampel sebanyak 2 L.
5. Setelah ditotol, biarkan plat silika gel menguap semua pelarut dari larutan baku kerja dan
sampel. Dapat digunakan hairdryer untuk mempercepat proses pengeringan.
6. Tandai, batas atas dari pengembang menggunakan pensil
 Pengembangan
1. Masukan plat yang telah ditotol dan dikeringkan kedalam chamber.
2. Tunggu sampai larutan pengembang/fase gerak sampai ke tanda batasnya.
3. Keluarkan plat silika dari chamber dan biarkan mongering di suhu ruang. Untuk
mempercepat pengeringan dapat digunakan hairdryer.

Penampakan dan perekaman bercak

1. Masukan plat silika yang telah kering ke bawah sinar uv (258 dan 366 nm)
2. Amati bercak dan rekam dengan camera.
3. Usahakan untuk merekam dalam posisi kamera yang stabil/tidak bergoyang dan focus ke
plat silika.

Analisa kromatogram
1. File gambar yang telah direkam, untuk selanjutnya dianalisis menggunakan software
TLCAnalyzer.
2. Pilih track 1 (konsentrasi 1) atur lebar dan jarak scan/pemindaian (dari titik penotolan
sampel sampai ke tanda batas pengembang).
3. Akan muncul 3 jenis kervu berdasarkan warna dasarnya; hijau, biru dan merah. Pilihlah
kurva dengan bentuk yang paling bagus memberikan kromatogramnya.
4. Ekspor nilai-nilai dari kurva terpilih ke dalam Microsoft excel.
5. Buka data tersebut dalam Microsoft excel dan plot menjadi kurva.
6. Hitung luas dibawah kurva (AUC).
7. Lakukan hal yang sama untuk track selanjutnya.
8. Catat nilai AUC dari tiap track.

VI. HASIL PENGAMATAN

A. Pembuatan larutan induk paracetamol – kafein ( 2000 ppm – 500 ppm ) dalam labu
ukur 100 ml (0,1 L)
Paracatemol Kafein
2000 ppm : mg/L 500 ppm : mg/L
2000 ppm : mg/0,1 L 500 ppm : mg/0,1 L
Mg : 2000 x 0,1 Mg : 500 x 0,1
Mg : 200 mg Mg : 50 mg
B. Pembuatan kurva kalibrasi (larutan series)
1. Paracetamol : Kafein (200 ppm : 50 ppm) ad 5 ml
Paracatemol Kafein
V1 x C1 = V2 x C2 V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 2000 = 5 x 200 V1 x 500 = 5 x 50
V1 = 0,5 ml V1 = 0,5 ml

2. Paracetamol : Kafein (300 ppm : 75 ppm) ad 5 ml

Paracatemol Kafein
V1 x C1 = V2 x C2 V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 2000 = 5 x 300 V1 x 500 = 5 x 75
V1 = 0,75 ml V1 = 0,75 ml

3. Paracetamol : Kafein (400 ppm : 100 ppm) ad 5 ml

Paracatemol Kafein
V1 x C1 = V2 x C2 V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 2000 = 5 x 400 V1 x 500 = 5 x 75
V1 = 1 ml V1 = 1 ml

4. Paracetamol : Kafein (500 ppm : 125 ppm) ad 5 ml

Paracatemol Kafein
V1 x C1 = V2 x C2 V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 2000 = 5 x 500 V1 x 500 = 5 x 125
V1 = 1,25 ml V1 = 1,25 ml

5. Paracetamol : Kafein (600 ppm : 150 ppm) ad 5 ml

Paracatemol Kafein
V1 x C1 = V2 x C2 V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 2000 = 5 x 600 V1 x 500 = 5 x 150
V1 = 1,5 ml V1 = 1,5 ml

6. Paracetamol : Kafein (700 ppm : 175 ppm) ad 5 ml

Paracatemol Kafein
V1 x C1 = V2 x C2 V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 2000 = 5 x 700 V1 x 500 = 5 x 175
V1 = 1,75 ml V1 = 1,75 ml
C. Pembuatan larutan baku tunggal paracetamol

Pct 50 mg

50 mg/25 ml = 50.000 µg/25 ml

= 2000 ppm

V1 x N1 = V2 x N2
V1 x 2000 = 5 x 500
V1 = 1,25 ml

D. Pembuatan pelarut campur air : methanol (80 : 20) sebanyak 200 ml

80
1. Air : 100 𝑥 200 𝑚𝑙 = 160 𝑚𝑙
20
2. Metanol : 100 𝑥 200 𝑚𝑙 = 40 𝑚𝑙

E. Pembuatan sampel
Panadol : Paracetamol = 500 mg
Kafein = 65 mg
Bobot tablet = 695 mg
Massa teoritis paracetamol Massa teoritis kafein

500 mg x 695 mg 65 mg x 695 mg

= 500 𝑚𝑔 = 65 𝑚𝑔
695 𝑚𝑔 695 𝑚𝑔
F. Kurva kalibrasi paracetamol dan % kadar paracetamol

KONSENTRASI AUC
KURVA KALIBRASI PARACETAMOL
200 ppm 3499,569
7000
300 ppm 4084,953 y = 4.5733x + 2544.2
6000
400 ppm 4178,426 R² = 0.9223
5000
500 ppm 4.503,477 4000

AUC
600 ppm 5649,518 3000
700 ppm 5697,154 2000
1000
0
0 200 400 600 800
KONSENTRASI

1. Sampel 1
AUC : 4442,811
Dari kurva kalibrasi didapat persamaan regresi :
y = 4,5733x + 2544,2
a = 2544,2
b = 4,5733
Nilai x y = 4,5733x + 2544,2
𝑦− 2544,2
x= 4,5733
4442,811− 2544,2
x= 4,5733
1898,611
x= 4,5733
x = 415,1512 ppm
 Massa sampel : mg = x X Fp X LU
= 415,1512 x 25 x 50
= 518939 µg
= 518,939 mg
𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
 % kadar paracetamol terhadap sampel : 𝑚𝑔 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 𝑥 100%
518,939 𝑚𝑔
: 𝑥 100%
500 𝑚𝑔
: 103,787 % (b/b)

2. Sampel 2
AUC : 5101,134
Dari kurva kalibrasi didapat persamaan regresi :
y = 4,5733x + 2544,2
a = 2544,2
b = 4,5733
 Nilai x y = 4,5733x + 2544,2
𝑦− 2544,2
x= 4,5733
5101,134 − 2544,2
x= 4,5733
2556,934
x= 4,5733
x = 559,1004 ppm
 Massa sampel : mg = x X Fp X LU
= 559,1004 x 25 x 50
= 698875,5 µg
= 698,875 mg
𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
 % kadar paracetamol : 𝑥 100%
𝑚𝑔 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠
698,875 𝑚𝑔
: 𝑥 100%
500 𝑚𝑔
: 139,775% (b/b)

103,787 + 139,775
 Rata-rata % kadar paracetamol : = 121,781% b/b
𝟐

G. Kurva kalibrasi kafein dan % kadar kafein

KONSENTRASI AUC
50 223,678 KURVA KALIBRASI KAFEIN
1800
75 490,163
1600
100 598,82 y = 9.8859x - 309.41
1400
R² = 0.9522
125 904,648 1200
150 1031,477 1000
AUC

800
175 1567,761 600
400
200
0
0 50 100 150 200
KONSENTRASI
1. Sampel 1
AUC : 550,678
Dari kurva kalibrasi didapat persamaan regresi :
y = 9,8859x - 309,41
a = 309,41
b = 9,885
Nilai x y = 9,8859x - 309,41
𝑦−309,41
x= 9,8859
550,678− 309,41
x= 9,8859
241,268
x= 9,8859

 Massa sampel
 % kadar kafein
x = 24,4052 ppm
: mg = x X Fp X LU
= 24,4052 x 25 x 50
= 30506,25 µg
= 30,5062 mg
𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
: 𝑚𝑔 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 𝑥 100%
30,5062 𝑚𝑔
: 𝑥 100%
65 𝑚𝑔
: 46,932 % (b/b)

2. Sampel 2
AUC : 397,385
Dari kurva kalibrasi didapat persamaan regresi :
y = 9,8859x - 309,41
a = 309,41
b = 9,885
Nilai x Rasa y = 9,8859x - 309,41
𝑦−309,41
x= 9,8859
397,385− 309,41
x= 9,8859
87,9758
x= 9,8859
x = 8,8991 ppm
 Massa sampel : mg = x X Fp X LU
= 8,8991 x 25 x 50
= 11123,875 µg
= 11,123 mg
𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
 % kadar kafein : 𝑚𝑔 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 𝑥 100%
11,123 𝑚𝑔
: 65 𝑚𝑔
𝑥 100%
: 17,112 % (b/b)

46,932 + 17,112
 Rata-rata % kadar kafein : = 32,202% b/b
𝟐

VII. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan suatu kadar sampel multikomponen
dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis videodensitometri. Padaprinsipnya
berdasarkan interaksi antara sinar radiasi elektromagnetik dari kamera dengan area noda pada plat
klt yang dapat terjadi korelasi.
Pada percobaan kali ini sampel yang digunakan adalah Panadol dimana mengandung
paracetamol dan kafein. Kemudia dari kedua zat aktif tersebut dapat ditentukan kadarnya dengan
klt densitometry ini. Pada prosesnya sampel terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut yang sesuai
untuk ditotolkan pada plat KLT, selain itu dibuat larutan series yang akan ditotolkan juga pada plat
KLT yang kemudian dikembangkan pada fase gerak yang sesuai dan setelah sampai tanda lalu
dibaca pada lampu UV dan noda KLT yng terbentuk akan diambil gambarnya dengan kamera dan
setelah itu akan muncul gambar yang dapat ditentukan nilai AUC. Nilai tersebut berasal dari
korelasi sinar radiasi elektromagnetik dan area noda bercak yang timbul. Sehingga nilai AUC
tersebut dapat digunakan untuk menghitung kadar masing-masing zat aktif pada sampel.
Berdasarkan farmakope, kedua komponen yang terkandung dalam sampel memiliki ciri
dan struktur yang berbeda. Dapat dilihat di bawah ini.

Gambar: struktur parasetamol Gambar: struktur kafein

Pada analisis kuantitatif dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan kafein dalam sampel
berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kurva kalibrasi larutan deretstandar yang
didapat dan pengenceran larutan induk paracetamol dan kafein 10.000 ppm dan kafein 1.300 ppm
dalam 50 ml labu ukur dan dilakukan pengenceran 25 x kadar analit dapat ditentukan dengan
menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan garis y = bx + a yang diperoleh dari kurva
kalibrasi larutan deret standar.
Berdasarkan data pengamatan diperoleh kadar paracetamol sebesar 121,781% b/b dimana
hasil ini tidak sesuai dengan persyaratan yang tercantum dalam farmakope Indonesia edisi IV
karena tidak masuk dalam rentang <90% dan >110%. Sedangkan untuk kadar kafein yang didapat
sebesar 32,202% b/b dimana hasil ini juga tidak sesuai dengan persyaratan yang tercantum dalam
farmakope.