METODE PEMISAHAN

BAHAN ALAM (FF032029)

Rubi Biologi Farmasi

 DAFTAR PENYUSUN

Metode Pemisahan Bahan Alam (FF032029)

Edited by

Dadang Juanda, M.Si., Apt

Fakultas Farmasi, Universitas Bhakti Kencana
Rubi Biologi Farmasi

R. Herni Kusriani, M.Si., Apt

Fakultas Farmasi, Universitas Bhakti Kencana
Rubi Biologi Farmasi

Asep Roni, M.Si., Apt

Fakultas Farmasi, Universitas Bhakti Kencana
Rubi Biologi Farmasi

i
 LEMBAR REVISI
MODUL PANDUAN PRAKTIKUM
METODE PEMISAHAN NBAHAN ALAM (FF032029)

No. Keterangan Revisi Tanggal Revisi Paraf

ii
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat
rahmat, taufik dan hidayah-Nya, penulisan buku Panduan Praktikum Metode
Pemisahan Bahan Alam (FF032029) ini dapat diselesaikan. Panduang praktikum
ini untuk digunakan di lingkungan Fakultas Farmasi universitas Bhakti Kencana
Bandung.

Panduan Praktikum Metode Pemisahan Bahan Alam (FF032029) disusun

berdasarkan Rancangan Pembelajaran Semester (RPS) yang telah disusun
sebelumnya oleh Tim Dosen Rubi Biologi Farmasi. Praktikum ini memberikan
bekal secara umum kepada mahasiwa pendekatan yang dilakukan untuk
identifikasi dan isolasi senyawa dari bahan alam yang memiliki khasiat secara
farmakologi, ataupun senyawa bahan alam yang berpotensi untuk dikembangkan
sebagai kandidat obat.

Kami mengucapkan banyak terima kasih kepada pihak-pihak yang telah

membantu atas penyelesaian panduan penuntuk praktikum ini. Koreksi dan saran
sangat kami harapkan untuk perbaikan di masa yang akan datang.

Bandung, Mei 2020

Penulis

iii
 DAFTAR ISI

Halaman
Daftar Penyusun ....................................................................................................... i
Lembar Revisi ......................................................................................................... ii
Kata Pengantar ....................................................................................................... iii
Modul 1 Pembuatan Pereaksi Untuk Penapisan Fitokimia.................................. 2
Modul 2 Penapisan Fitokimia ............................................................................ 11
Modul 3 Ekstraksi & Pemekatan Ekstrak .......................................................... 25
Modul 4 Pemantauan Ekstrak ............................................................................ 39
Modul 5 Fraksinasi Metode Ekstraksi Car-Cair ................................................ 50
Modul 6 Pemantauan Fraksi .............................................................................. 59
Modul 7 SubFraksinasi Metode KCV & KK..................................................... 68
Modul 8 Pemantauan SubFraksi ........................................................................ 81
Modul 9 Pemurnian ........................................................................................... 90
Modul 10 Uji Kemurnian................................................................................... 101
Modul 11 Karakterisasi & Identifikasi .............................................................. 111
Lampiran ............................................................................................................ 121

iv
 JADWAL PRAKTIKUM
METODE PEMISAHAN BAHAN ALAM (FF032029)

Nama

NPM
Kelas
No Kontak

TOPIK PRAKTIKUM*
1 Responsi
2 Pembuatan Pereaksi Penapisan Fitokimia
3 Penapisan Fitokimia
4 Ekstraksi
5 Pemekatan Ekstrak & Pemantauan Ekstrak
6 Fraksinasi 1 (Ekstraksi Cair-Cair)
7 Review & Diskusi Terstruktur
8 UTS
9 Pemantauan Fraksinasi Hasil ECC
10 Fraksinasi 2 (KVC & KK)
11 Pemantauan SubFraksi Hasil KCV & KK
12 Isolasi/Pemurnian
13 Isolasi/Pemurnian
14 Uji Kemurnian Secara Kromatografi Lapis Tipis
15 Karakterisasi & Identifikasi Isolat
(Spektrofotometer UV-Sinar Tampak & Infra Merah
16 Review & Diskusi Terstruktur
17 UAS
*)kepastian topik praktikum akan disampaikan ketika responsi

1
 MODUL 1
PEMBUATAN PEREAKSI DAN PENYIAPAN BAHAN
UNTUK PENAPISAN FITOKIMIA

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu membuat perekasi yang diperlukan untuk penapisan
fitokimia
1.2 Tujuan Praktikum
Pembuatan pereaksi yang digunakan untuk skrining/penapisan fitokimia
metabolit sekunder golongan alkaloid, flavonoid, kuinon, tanin, saponin,
dan steroid/triterpenoid.

2. Prinsip
Melarutkan dan mencampurkan zat-zat untuk membuat pereaksi yang akan
digunakan dalam praktikum penapisan fitokimia.
Pembuatan pereaksi dikatakan berhasil, kalau sudah di uji terhadap contoh
sampel yang harus memberikan hasil uji positif terhadap reagen yang diujikan.

3. Pendahuluan
Salah satu pendekatan untuk penelitian tumbuhan obat adalah penapisan
senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman. Penapisan fitokimia atau
skrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa yang
terdapat dalam suatu sampel (simplisia, ekstrak, fraksi, subfraksi dan isolat),
meliputi pemeriksaan golongan alkaloid, flavanoid, saponin, tanin, kuinon,
steroid/triterpenoid, kumarin dan senyawa lainnya.

Deteksi awal kandungan metabolit sekunder memerlukan pereaksi tertentu, zat

dalam pereaksi yang digunakan akan bereaksi dengan metabolit sekunder
tertentu, sehingga hasil positif dapat diamati dengan terbentuknya warna,
endapan atau yang lainnya.

2
4. Alat dan Bahan
Alat :
- Timbangan analitik - Tabung reaksi dan rak
- Spatel - Corong Pisah
- Botol timbang - Mortar dan stamper
- Kaca Arloji - Kompor listrik
- Beaker glass - Hot plate
- Erlenmeyer - Penjepit tabung reaksi
- Gelas ukur - Botol coklat (botol pereaksi)
- Pipet tetes

Bahan :

Bahan simplisia Uji Flavonoid

- Kortek kina - Serbuk Mg
- HCl Pekat
Uji Alkaloid - Amil alkohol
- Amonia - Akuades
- Kloroform
- HCl 10% (1) Uji Tanin
- Pereaksi Dragendorff (2) - FeCl 1% (5)
Bismuth subnitrate - Gelatin 1% (6)
Asam nitrat - Pereaksi Stiasny (7)
Kalium iodide Formaldehid 30% - asam klorida
Akuades pekat (2:1)
- Pereaksi Mayer (3) - Natrium asetat
Raksa(II) klorida
Kalium iodide Uji Saponin
- Pereaksi Wagner (4) - HCl 2 N (8)
Iodine
Kalium iodide Uji Steroid-Triterpenoid
- Pereaksi Liebermann-Buchard (9)
Uji Kuinon Asetat anhidrat-asam sulfat (2:1)
- NaOH 1% (4)

3
5. Prosedur Kerja
Prosedur Pembuatan Pereaksi
Untuk pembuatan pereaksi dan penyiapan bahan mahasiswa ditugaskan secara
mandiri untuk mencari prosedur pembuatan pereaksi yang akan digunakan
untuk kemudian disetujui oleh penanggung jawab praktikum atau asisten
praktikum.

Prosedur Uji Konfirmasi Pereaksi

Setelah pereaksi selesai dibuat, kemudian beberapa pereaksi perlu diuji
terhadap sampel yang akan memberikan hasil uji positif terhadap pereaksi
yang digunakan sebagai parameter bahwa pereaksi berhasil dibuat.

Pereaksi Dragendorff, Pereaksi Mayer, Pereaksi Wagner diuji terhadap

simplisa atau ekstrak kortek kina. Untuk prosedur pengujian mengacu ke
prosedur pada Modul Penapisan Fitokimia.

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)
Tuliskan prosedur pembuatan setiap Pereaksi yang dibuat (1-9) dalam bentuk
bentuk bagan alir

4
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

5
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

6
6. Hasil Praktikum
1. Tuliskan data penimbangan dan pengenceran yang dilakukan untuk pembuatan
setiap pereaksi yang dibuat (1-9)

7
2. Tuliskan hasil pengujian Pereaksi Dragendorff, Pereaksi Mayer, Pereaksi
Wagner terhadap simplisa atau ekstrak kortek kina.

Nama Nama Pemeriksaan Pereaksi Hasil Ket.

Bahan Simplisa Golongan Pengamatan (+/-)

Kortek kina Alkaloid Pereaksi

Dragendroff
(kertas saring)

Pereaksi
Dragendorff

Pereaksi
Mayer

Pereaksi
Wagner

Berikan penjelasan apakah pereaksi (Dragendorff, Mayer, Wagner)

berhasil dibuat

8
7. Diskusi dan Pembahasan

9
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Farnsworth, N.R. Biological and phytochemical screening of plants.

Pharmaceutical sciences (Np). J. Pharm. Sci, 1966; 55(3):874-875.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New
York Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Cantumkan pustaka lain yang digunakan

10
 MODUL 2
PENAPISAN FITOKIMIA

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi metabolit sekunder melalui
penapisan fitokimia
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mampu menjelaskan tujuan penapisan fitokimia
➢ Mampu menjelaskan tahap-tahap proses penapisan fitokimia untuk
suatu golongan senyawa
➢ Mampu menjelaskan reaksi yang terjadi pada proses penapisan
fitokimia suatu golongan senyawa

2. Prinsip
Pembentukan warna atau endapan sebagai hasil reaksi antara pereaksi
penapisan yang digunakan dengan senyawa metabolit sekunder.

3. Pendahuluan
Salah satu pendekatan untuk penelitian tumbuhan obat adalah penapisan
senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman. Penapisan fitokimia atau
skrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa yang
terdapat dalam suatu sampel (simplisia, ekstrak, fraksi, subfraksi dan isolat),
meliputi pemeriksaan golongan alkaloid, flavanoid, saponin, tanin, kuinon,
steroid/triterpenoid, kumarin dan senyawa lainnya.

Skrining fitokimia merupakan tahap awal dalam suatu penelitian yang

bertujuan untuk memberikan gambaran tentang golongan senyawa metabolit
sekunder yang terdapat dalam tanaman. Sebagai informasi awal dalam
mengetahui senyawa kimia apa yang mempunyai aktivitas biologis dari suatu
tanaman. Hasil penapisan fitokimia dapat dijadikan panduan untuk proses
isolasi selanjutnya

11
4. Alat dan Bahan
Alat :
- Timbangan analitik - Tabung reaksi dan rak
- Spatel - Corong Pisah
- Botol timbang - Mortar dan stamper
- Kaca Arloji - Kompor listrik
- Beaker glass - Hot plate
- Erlenmeyer - Penjepit tabung reaksi
- Gelas ukur - Corong saring
- Pipet tetes

Bahan :

Bahan simplisia Uji Kuinon

- Kortek kina NaOH 1%

- Daun singkong
- Akar kelembak Uji Saponin

- Daun salam - HCl 2N

- Buah rerak
Uji Tanin
- Simplia (sesuai tugas kelompok)
- FeCl 1%

Uji Alkaloid - Gelatin 1%

- Pereaksi Stiasny
- Amonia
- Kloroform - Natrium asetat

- HCl 10%
Uji Steroid-Triterpenoid
- Pereaksi Dragendorff
- Pereaksi Liebermann-Buchard
- Pereaksi Mayer
- Pereaksi Wagner
Bahan lain
- Kertas saring
Uji Flavonoid
- Akuades
- Serbuk Mg
- HCl Pekat
- Amil alkohol

12
5. Prosedur Kerja
Pemeriksaan Golongan Alkaloid
1) Sebanyak 2 gram sampel dilembabkan dengan Amonia 25% digerus dalam
mortar.
2) Tambahkan kloroform 10 mL digerus kuat-kuat dan disaring. Filtrat
berupa larutan organik (kloroform) digunakan untuk percobaan
selanjutnya.
3) Sebanyak 2 tetes larutan oragnik diteteskan pada kertas saring dan ditetesi
pereaksi Dragendorff. Terbentuknya warna merah atau jingga pada kertas
saring menunjukkan adanya alkaloid.
4) Larutan organik sebanyak 10 ml diekstraksi (ECC) dua kali dengan larutan
asam klorida 10% (1:1). Fraksi air (HCl) digunakan untuk pengujian
berikutnya.
5) Sebanyak 5 mL larutan dalam tabung reaksi ditambahkan beberapa tetes
pereaksi Dragendorff. Terbentuknya endapan merah bata menunjukan
hasil positif,
6) Sebanyak 5 mL larutan dalam tabung reaksi ditambahkan beberapa tetes
pereaksi Mayer. Terbentuknya endapan putih menunjukan hasil positif.
7) Sebanyak 5 mL larutan dalam tabung reaksi ditambahkan beberapa tetes
pereaksi Wagner. Terbentuknya endapan merah-coklat menunjukan hasil
positif.

Pemeriksaan Golongan Flavonoid

1) Sebanyak satu gram sampel dalam 100 mL air panas dididihkan selama 5
menit dan disaring sehingga diperoleh filtrat.
2) Sebanyak 5 mL filtrat dalam tabung reaksi tambahkan Sedikit serbuk
magnesium dan 2 mL asam klorida pekat (1:1), kemudian dikocok dengan
10 mL amil alkohol. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya
warna jingga, kuning, atau merah pada lapisan amil alkohol.

13
Pemeriksaan Golongan Kuinon
1) Sebanyak satu gram sampel dalam 100 mL air panas dididihkan selama 5
menit dan disaring sehingga diperoleh filtrat.
2) Ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan beberapa tetes larutan natrium
hidroksida, jika terbentuk warna merah menunjukkan adanya kuinon.

Pemeriksaan Golongan Saponin

1) Sebanyak satu gram sampel dalam 100 mL air panas dididihkan selama 5
menit dan disaring sehingga diperoleh filtrat.
2) Sebanyak 10 mL filtrat dalam tabung reaksi dikocok secara vertikal
selama 10 detik, terbentuknya busa yang mantap selama tidak kurang dari
10 menit, yang tidak hilang ketika ditambahkan 1 tetes asam klorida 2 N
menunjukan hasil positif.

Pemeriksaan Golongan Tanin

1) Sebanyak satu gram sampel dalam 100 mL air panas dididihkan selama 5
menit dan disaring sehingga diperoleh filtrat.
2) Filtrat sebanyak masing-masing 5 mL ke dalam tiga tabung reaksi, ke
dalam bagian pertama ditambahkan besi (III) klorida. Timbulnya warna
hijau violet atau hitam menunjukkan adanya tanin. Ke dalam bagian kedua
ditambahkan larut gelatin, terbentuknya endapan putih menunjukkan
adanya tanin. Ke dalam bagian ketiga ditambahkan pereaksi Steasny,
kemudian dipanaskan dalam penangas air. Terbentuknya endapan disaring,
Filtrat dijenuhkan dengan natrium asetat dan ditambah beberapa tetes
larutan besi (III) klorida. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan
adanya tanin galat.

Pemeriksaan Golongan Steroid/Triterpenoid

1) Sebanyak satu gram sampel dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam,
lalu disaring
2) Filtrat sebanyak 5 mL diuapkan dalam cawan penguap ke dalam residu
tambahkanPereaksi Liebermann – Burchard, terbentuknya warna merah
yang berubah menjadi warna hijau, kemudian menjadi ungu dan akhirnya
biru, menunjukkan adanya steroid/triterpenoid.

14
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

15
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

16
6. Hasil Praktikum
Hasil Pemeriksaan Simplisia Pembanding (per gelombang)
Nama Nama Pemeriksaan Pereaksi Hasil Ket.
Bahan Simplisa Golongan Pengamatan (+/-)

Kortek kina Alkaloid Pereaksi

Dragendroff
(kertas saring)

Pereaksi
Dragendorff

Pereaksi
Mayer

Pereaksi
Wagner
Daun Flavonoid Serbuk Mg
singkong HCl
Amil Alkohol
Akar Kuinon
kelembak NaOH 1N

Daun salam Tanin FeCl3 1%

Pereaksi
Stiasny

Filtrat +Na
Asetat
+FeCl31%
Buah rerak Saponin Busa pada 0
menit
Busa pada 10
menit
Busa
+ HCl 2N

17
Hasil Pemeriksaan Simplisia Tugas Per Kelompok
Data Simplisia
Nama Sampel
(nama umum Indonesia)

Nama Latin Tanaman

Nama Simplisia

Nama Senyawa
(target yang akan diisolasi)

Gambar Struktur Senyawa

Pustaka ….
Golongan Senyawa

18
Hasil Penapisan Fitokimia
Pemeriksaan Pereaksi Yang Hasil Ket.
Golongan Digunakan Pengamatan (+/-)
Alkaloid

Flavonoid

Kuinon

Tanin

Saponin

Steroid/Triterpenoid

Ket :
+ = memberikan hasil uji positif
- = memberikan hasil uji negatif

19
Foto Hasil Pemeriksaan Penapisan Fitokimia

20
7. Diskusi dan Pembahasan

21
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1989). Materia Medika

Indonesia. Jilid Lima. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Farnsworth, N.R. Biological and phytochemical screening of plants.

Pharmaceutical sciences (Np). J. Pharm. Sci, 1966; 55(3):874-875.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New
York Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

22
Tugas Pendahuluan
Pertanyaan (dijawab sebelum praktikum dilaksanakan)
1. Apa yang dimaksud dengan reaksi positif palsu?
2. Sebutkan senyawa-senyawa yang memberikan reaksi positif palsu dengan
pereaksi Mayer. Jelaskan
3. Jelaskan reaksi kimia yang terjadi pada penapisan fitokimia untuk golongan
senyawa:
a. Flavanoid
b. Steroid/Triterpenoid
c. Kuinon
d. Tanin

Jawaban

23
Jawaban

24
 MODUL 3
EKSTRAKSI & PEMEKATAN EKSTRAK

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan pembuata ekstrak bahan alam
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mampu menjelaskan proses yang terjadi pada masing-masing metode
ekstraksi
➢ Mampu menjelaskan alasan pemilihan metode ekstraksi
➢ Mampu menjelaskan alasan pemilihan pelarut pengekstraksi
➢ Mampu menyiapkan dan memasang alat ekstraksi
➢ Mahasiswa mampu melakukan proses ekstraksi dari simplisia

2. Prinsip
Penarikan senyawa dalam simplisia melalui proses difusi dan osmosis oleh
cairan penyari sehingga diperoleh keadaan seimbang.

3. Pendahuluan
Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat
yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan
yang mengandung zat yang ada dalam bahan. Simplisia ada yang lunak seperti
rimpang, daun, bunga, simplisia ada yang keras seperti biji, kulit kayu, kulit
akar. Simplisia yang lunak mudah ditembus oleh cairan penyari, karena itu,
pada penyarian tidak perlu ditumbuk sampai halus. Sebaliknya pada simplisia
yang keras, perlu dihaluskan terlebih dahulu sebelum dilakukan penyarian.
Penyarian disamping memperhatikan sifat fisik simplisia dan sifat zat
aktifnya, harus juga memperhatikan zat-zat yang sering terdapat dalam
simplisia seperti protein, karbohidrat, lemak dan gula. Proses penyarian dapat
dipisahkan menjadi; Pembuatan serbuk, Pembahasan, Penyarian dan
Pemekatan.

Ekstraksi dapat dilakukan dengan cara ekstraksi cara panas dan cara dingin.
Ekstraksi cara panas (cara refluks, Soxhlet dll) dilakukan jika komponen

25
 (senyawa) yang akan diekstraksi tahan panas (termostabil). Sedangkan
ekstraksi cara dingin (maserasi, perkolasi) digunakan untuk mengekstraksi
komponen (senyawa) yang tidak tahan panas (termolabil). Ekstraksi cara
dingin juga digunakan untuk simplisia yang belum diketahui komponennya,
sehingga belum diketahui kestabilan komponennya. Syarat pelarut
pengekstraksi melarutkan solut/ senyawa yang akan diekstraksi, selektif,
mudah diuapkan, tidak toksik, tidak korosif, relativ tidak mahal.

Berdasarkan kepolarannya, pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi

adalah pelarut non polar, semipolar dan polar. Contoh pelarut non polar :
benzene, sikloheksana dsb. Contoh pelarut semipolar: etil asetat, kloroform,
metilenklorida dsb. Contoh pelarut polar: etanol, methanol, butanol, dsb.
Pelarut etanol dan metanol adalah pelarut universal, yang dapat melarutkan
sebagian besar senyawa polar, sebagian kecil senyawa semipolar dan sebagian
kecil senyawa non polar. Pelarut organik kurang digunakan dalam penyarian,
kecuali dalam penyarian terentu. Salah satu contoh eter minyak bumi
digunakan untuk menarik lemak dari serbuk simplisia sebelum dilakukan
proses penyarian. Untuk penyarian ini, Farmakope Indonesia menetapkan
bahwa sebagai cairan penyari adalah air, etanol, etanol-air atau eter. Penyarian
pada perusahaan obat tradisional masih terbatas pada penggunaan cairan
penyari air, etanol, atau etanol-air

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Timbangan digital - Corong saring
- Rotary Vaporator - Spatel
- Seperangkat alat maserasi - Pemanas
- Seperangkat alat Sokhlet - Beaker glass
- Seperangkat alat refluks - Erlenmeyer
- Gelas ukur
Bahan :
- Simplia (sesuai tugas kelompok) Kertas saring
- Etanol 96%

26
5. Prosedur Kerja
Ekstraksi dengan Cara Maserasi
1) Siapkan alat maserasi
2) Pasang kapas bebas lemak pada dasar alat maserasi
3) Masukan simplisia (X gram) ke dalam alat maserasi
4) Masukan pelarut pengekstraksi sampai simplisia terendam oleh pelarut
5) Biarkan selama 24 jam
6) Tampung ekstrak di penampung
7) Ulangi ekstraksi sampai diperoleh ekstrak cair yang tidak berwarna atau
proses ekstraksi ulangi minimum 3 kali (tahap 4-6)
8) Ekstrak cair yang diperoleh disatukan dan dipekatkan, diperoleh ekstrak
kental ( Y gram)
9) Hitung rendemen ekstrak (Y/X)

Ekstraksi dengan Cara Refluks

1) Siapkan seperangkat alat refluks
2) Masukan simplisia ( X gram ) kedalam labu refluks
3) Masukkan pelarut ke dalam labu refluks sampai simplisia terendam oleh
pelarut
4) Pasang alat refluks dan penangas
5) Alirkan air melalaui kondensor
6) Lakukan proses ekstraksi selama 2-3 jam (dihitung mulai dari pelarut
mendidih)
7) Hentikan proses ekstraksi
8) Setelah alat dingin, ekstraksi didekantasi
9) Ulangi ekstraksi sampai diperoleh ekstrak yang tidak berwarna atau tahap
3 – 8 minimum 3 kali
10) Ekstrak cair yan diperoleh disatukan dan dipekatkan, diperoleh ekstrak
kental ( Y gram )

27
Ekstraksi Sinambung dengan Alat Soxhlet
1) Siapkan seperangkat alat Soxhlet
2) Lapisi tabung simplisia dengan kertas saring, sedemikian hingga dibuat
untuk menaruh simplisia
3) Masukkan simplisia (X gram) ke dalam tabung simplisia
4) Basahi simplisia dengan pelarut pengekstraksi
5) Masukkan pelarut ke dalam labu
6) Pasang alat Soxhlet dan pengangas
7) Alirkan air melalui kondensor
8) Pelarut akan mendidih, menguap mengembun pada waktu melalui
kondensor, menetes malalui simplisia dan menarik komponen dalam
simplisia. Tetesan pelarut yang berisi komponen yang terekstraksi jatuh ke
dalam labu
9) Lakukan ekstraksi sampai diperoleh ekstrak yang tidak berwarna
10) Ekstrak cair yang diperoleh disatukan dan dipekatkan, diperoleh ekstrak
kental (Y gram)

Perhitungan Rendemen Ekstrak

= Ekstrak pekat yang diperoleh (Y gram) / Simplisia yang diekstraksi (X
gram) x 100 %

28
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)
Bagan kerja dibuat untuk metode maserasi, refluks dan Sokhlet

29
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

30
6. Hasil Praktikum
Hasil Ekstraksi
Nama Sampel
(nama umum Indonesia)

Nama Latin Tanaman

Nama Simplisia

Nama Senyawa
(target yang akan diisolasi)

Bobot Simplisia
(yang akan diekstraksi)
g
Metode Ekstraksi

Pengulangan dan Durasi

Ekstrasi*

Pelarut yang Digunakan

Ekstraksi ke-1 mL
Ekstraksi ke-2 mL
Ekstraksi ke-3 mL

Total Jumlah Pelarut mL

*)misalkan 3 kali masing-masing 3 jam

31
Hasil Pemekatan Ekstrak
Nama Ekstrak

Pelarut Ekstrak

Jumlah Ekstrak
(total volume ekstrak akan
mL
yang dipekatkan)

Metode Pemekatan Ekstrak

Nama Alat

Pengaturan Alat
-

Jumlah Ekstrak Pekat

(total ekstrak pekat yang
g
didapatkan)

Hitung Rendemen Ekstrak

Rendemen Ekstrak (%)

32
Foto Proses Ekstraksi
(Wajib cantumkan foto seperangkat alat maserasi, Soxhlet dan refluks disertai
dengan keterangan gambar dan proses ekstraksi yang terjadi)

33
Foto Proses Pemekatan Ekstrak
(Wajib cantumkan foto alat yang diguankan untuk pemekata ekstrak disertai
dengan keterangan gambar dan penjelaskan mekanisme kerja alat tersebut)

34
7. Diskusi dan Pembahasan

35
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2000). Parameter Standar Umum
Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan
Obat dan Makanan; Jakarta

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal

Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New
York Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

36
Tugas Pendahuluan
Pertanyaan (dijawab sebelum praktikum dilaksanakan)
1. Jelaskan proses yang terjadi pada metode ekstraksi berikut :
a. Maserasi
b. Ekstraksi sinambung dengan alat Soxhlet
2. Jelaskan syarat-syarat pelarut pengekstraksi
3. Jelaskan penggolongan metode ekstraksi
4. Jelaskan alasan pememilihan metode ekstraksi
5. Jelaskan alasan pemilihan pelarut pengekstraksi
6. Jelaskan kelebihan dan kekurangan metode refluks dan Soxhlet
7. Jelaskan Kelebihan dan kekurangan metode maserasi dan perkolasi
8. Terkait dengan simplisia yang akan saudara kerjakan, jelaskan metode
ekstraksi yang saudara pilih dan jelaskan alasan pemilihan tersebut
9. Jelaskan macam-macam ekstrak yang ada dalam Farmakope Indonesia
10. Jelaskan prinsip kerja alat Rotary Vaporator (alat penguap berputar hampa
udara)

Jawaban

37
Jawaban

38
 MODUL 4
PEMANTAUAN EKSTRAK

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan analisis kandungan senyawa melalui
kromatografi planar
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan pemantauan ekstrak
➢ Mahsiswa mampu mengidentifikasi senyawa target pada ekstrak
➢ Mahasiswa mampu melakukan dan menjelaskan mekanisme/proses
yang terjadi pada KLT dan kromatografi kertas
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan penggunaan Penampak bercak
spesifik dan umum dalam pemantauan ekstrak

2. Prinsip
Secara umum prinsip pemishan pada kormatografi didasarkan pada pemisahan
senyawa diantara fase diam dan fase gerak. Adsorpsi, desorpsi dan elusi solut
diantara fase diam dan fase gerak (KLT). Partisi solut diantara fase diam dan
fase gerak (Kkt)

3. Pendahuluan
Pemantauan ekstrak dilakukan untuk mengetahui komponen yang ada dalam
ekstrak. Pemantauan komponen ekstrak dilakukan dengan metode diantaranya
kromagtografi lapis tipis (KLT) dan atau kromatografi kertas.

Proses/mekanisme yang terjadi pada KLT adalah adsorpsi, sedangkan pada

kromagtografi kertas adalah partisi. Penyangga yang dapat digunakan pada
KLT adala kaca, plastik dan aluminium. Fase diam/penjerapa yang digunakan
pada KLT silika gel, alumina, kiselgur dan selulosa. Penjerap yang paling
banyak digunakan pada KLT adalah silika gel.

Penyangga yang digunakan pada kromagtografi kertas untuk analitik adalah

kertas Whatman No. 1. Yang berperan sebagai fase diam pada kromatografi

39
 kertas adalah lapisan tipis cairan yang ada pada penyangga. Fase gerak yang
digunakan pada kromatografi kertas antara lain BAW, Forestal dan asam
asetat dengan berbagai konsentrasi.

Fase gerak atau pengembang yang digunakan bergantung kepada kepolaran

komponen yang akan dipisahkan, pengembang dapat berupa pelarut tunggal
atau campuran dua pelarut atau lebih.

Kromatografi lapis tipis umumnya digunakan untuk senyawa yang kurang

polar, sedangkan kromatografi kertas digunakan untuk komponen yang polar.

Sebagai panduan untuk melihat bercak yang akan diamati/diisolasi digunakan

penampak bercak sinar lampu UV λ 254 nm dan λ 365 nm atau dapat
digunakan penampak bercak semprot umum/universal (H 2SO4 10% dalam
metanol atau Uap I2) atau dapat pula digunakan penampak bercak spesifik
untuk golongan senyawa tertentu FeCl3 10 % untuk senyawa fenol, AlCl3 5 %
dalam metanol dan sitroborat untuk Flavonoid dan penampak bercak yang
lainnya.

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Sinar lampu UV - Kertas Whatman (untuk Kkt)
( λ 254 nm dan λ 365 nm) - Pipa kapiler
- Bejana KLT - Botol penampak bercak
- Plat KLT - Penggaris besi
- Gelas ukur

Bahan :
- Ekstrak/Fraksi - Pelarut
- Pembanding/standar - Penampak bercak spesifik
- Penampak bercak umum

40
5. Prosedur Kerja
Pematauan dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
1) Siapkan bejana KLT (chamber)
2) Lapisi bejana dengan kertas saring
3) Siapkan eluen/fase gerak/pengembang (pelarut tunggal atau campuaran)
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen
5) Sejumlah ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai
diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan ekstrak pada pelat dengan menggunakan pipa kapiler
7) Biarkan totolan ekstrak mongering (pelarut menguap)
8) Masukkan pelat yang sudah ditotolkan kedalam bejana. (Perhatian: tinggi
permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak, jangan sampai bercak sampel terendam oleh pengembang)
9) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir pelat
10) Angkat pelat, biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak universal asam sulfat 10% dalam
methanol atau menggunakan penampak bercak spesifik.

Pemantauan dengan kromatografi kertas (Kkt)

1) Siapkan eluen
2) Siapakan bejana (chamber)
3) Lapisi bejana dengan kertas saring
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen sekitar 24 jam
5) Sejumlah ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai
diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan ekstrak pada kertas Whatman No 1 dengan menggunakan pipa
kapiler
12) Biarkan totolan ekstrak mengering (pelarut menguap). Masukkan kertas
Whatman yang sudah ditotolkan ke dalam bejana. (Perhatian: tinggi

41
 permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak, jangan sampai bercak sampel terendam oleh pengembang)
7) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir kertas
8) Angkat kertas, biarkan kertas mongering (pelarut sudah menguap)
9) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak khusus/spesifik

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

42
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

43
6. Hasil Praktikum
Sebelum melakukan percobaan pemantauan ekstrak/fraksi mahasiwa harus
melaporkan data-data terkait pemantauan yang akan dilakukan kepada asisten,
data meliputi:
Nama Senyawa

Struktur senyawa

Pustaka:
Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak

Pustaka Rujukan
(FHI, Jurnal, dll)

Sistem Kromatografi yang dilakukan pada praktikum

Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak Spesifik

Penampak Bercak Umum

44
Hasil Pematauan
1. Wajib cantumkan foto/ gambar plat KLT/Kkt hasil pemantauan)
2. Perhitungan Nilai Rf dari senyawa yang akan diisolasi

45
7. Diskusi dan Pembahasan

46
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Gritter, J.Y., Bobbitt, M.J., Schwarting, E.A. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan
ke-2. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Sewell, A.P., Clarke, B., Chromatography Separation. John Wiley & Sons,
London: Published on behalf of ACOL, Thame Polythenic

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

47
Tugas Pendahuluan
Pertanyaan (dijawab sebelum praktikum dilaksanakan)
1. Jelaskan mekanisme/proses yang terjadi pada metode:
a. KLT
b. Kromatografi kertas
2. Apa yang dimaksud dengan :
a. Rf b. RRf c. hRf d. Rx
3. Suatu sistem KLT menggunakan fase diam silika gel G. Apa yang dimaksud
dengan silika gel G? apa bedanya dengan silika gel GF 245 dan silika gel H?
Jelaskan
4. Jelaskan cara menghitung kepolaran campuran fase gerak kloroform –
metanol (9:1)
5. Jika pada suatu sistem KLT, fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat –
metanol (9:1), diperoleh harga Rf 0,8. Ganti komposisi fase gerak tersebut
agar diperoleh Rf 0,5
6. Jawab pertanyaan berikut
a. Penampak bercak yang manakan yang akan saudara gunakan pada
pemantauan ekstrak? Penampak barcak spesifik atau penampak bercak
universal?
b. Mengapa pada kromatografi kertas tidak boleh menggunakan penampak
bercak asam sulfat 10% dalam metanol?
7. Jelaskan peran dan fungsi pemantauan ekstrak (disimpulkan dari tugas isolasi
senyawa kelompok masing-masing)

Jawaban

48
Jawaban

49
 MODUL 5
FRAKSINASI METODE EKSTRAKSI CAR-CAIR

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu memahami dan melakukan metode fraksinasi pada
pemisahan senyawa metabolit sekunder
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan fraksinasi
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan mekanisme/proses yang terjadi pada
ECC
➢ Mahasiswa mampu meyiapkan dan memasang alat untuk ECC
➢ Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi dengan metode ECC

2 Prinsip
Senyawa pada ekstrak dipisahkan berdasarkan kepolaran

3 Pendahuluan
Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan komponen dalam ekstrak
berdasarkan kepolaran, sehingga setelah diperoleh fraksi proses isolasi suatu
senyawa dapat dilakukan dengan lebih mudah. Fraksinasi dapat dilakukan
dengan metode ekstraksi cair-cair dan kromatografi.

Proses fraksinasi ekstrak secara ekstraksi cair-cair dilakukan berdasrkan

koefisien partisi senyawa diantara 2 pelarut yang digunakan dengan syarat
pelarut pertama dan kedua tidak boleh saling campur. Pada suatu pustaka
koefisien partisi dinyatakan berdasarkan perbandingan konsentrasi senyawa
dalam rafinat dan ekstraktan, sedangkan pada pustaka lain koefisien partisi
dinyatakan berdasarkan konsentrasi senyawa pada fase atas dan fase bawah.

Metode kromagtografi yang biasanya digunakan untuk fraksinasi ekstrak

adalah kromatografi kolom klasik (KK), kromatografi cair vakum (KCV),

50
 kromatografi cair tekanan menengah (MPLC) dan kromatografi cair kinerja
tingg (KCKT). Hasil yang diperoleh dari fraksinasi ekstrak adalah fraksi.

Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dilakukan pemantauan untuk

mengetahui keberadaan senyawa yang akan diisolasi berada pada fraksi,
sehingga fraksi yang menunjukan senyawa target diketahui.

4 Alat dan Bahan

Alat :
- Corong pisah - Statif
- Beaker glass - Botol penampung fraksi
- Gelas ukur - Batang pengaduk
- Corong saring

Bahan :
- Ekstrak - n-heksana
- Etanol - Etil asetat
- Akuades -

5 Prosedur Kerja
Fraksinasi Metode Ekstraksi Cair-Cair (ECC)
1) Siapkan seperangkat alat ekstraksi cair-cair
2) Sejumlah ekstrak kental (x gram) dimasukkan ke dalam gelas kimia,
tambahkan pelarut Y (…mL) (sampel ini disebut rafinat), aduk
3) Masukkan larutan ekstrak tersebut ke dalam corong pisah
4) Tambahkan pelarut (z mL) (Pelarut yang digunakan sebagai
pengekstraksi disebut ekstraktan)
5) Lakukan pengocokkan secara perlahan dan teratur. (sekali-sekali kran
corong pisah dibuka untuk mengeluarkan gas pelarut, gas dibuang di
lemari asap)
6) Taruh corong pisah di atas ring, diamkan sampai kedua pelarut terpisah
sempurna
7) Tampung bagian ekstraktan

51
8) Ulangi tahap 3- 6 sampai bagian ekstraktan tidak berwarna atau
minimum dilakukan 3 kali
9) Fraksi yang diperoleh dipekatkan dan ditimbang
10) Lakukan pemantauan fraksi dengan KLT atau kromatografi kertas

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

52
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

53
6 Hasil Praktikum
Hasil Ekstraksi Cair-Cair (ECC)

Nama Ekstrak

Jumlah Ekstrak g
(yang akan di ECC)

Rafinat
(pelarut untuk melarutkan
ekstrak)
mL
Jumlah Rafinat

Ekstraktan Pertama
Pengulangan ke-1 mL
Pengulangan ke-2 mL
Pengulangan ke-3 mL
Ekstraktan kedua
Pengulangan ke-1 mL
Pengulangan ke-2 mL
Pengulangan ke-3 mL
Ekstraktan ketiga
Pengulangan ke-1 mL
Pengulangan ke-2 mL
Pengulangan ke-3 mL

Jumlah Fraksi yang diperoleh

1. Fraksi n-heksana mL

2. Fraksi …… mL

3. Fraksi …… mL

4. Fraksi …… mL

54
Hasil Pemekatan Fraksi
1.
2.
Nama Fraksi
3.
4.
Metode Pemekatan Fraksi

Nama Alat

Pengaturan Alat
-

Jumlah Fraksi Pekat

1. g
2. g
3. g
4. g
Hitung Rendemen Fraksi (%)
1.

2.

3.

4.

55
Foto Proses Ekstraksi Cair-Cair
(Wajib cantumkan foto seperangkat alat ECC, disertai dengan keterangan gambar
dan proses ECC yang terjadi)

56
7 Diskusi dan Pembahasan

57
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Miller, M.J., Separation Methods In Chemical Analysis. A Willey-Interscience

Publication John Willey & Sons, US.

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

58
 MODUL 6
PEMANTAUAN FRAKSI

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan analisis kandungan senyawa melalui
kromatografi planar
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan pemantauan fraksi
➢ Mahasiswa mampu mengidentifikasi senyawa target pada fraksi
➢ Mahasiswa mampu melakukan dan menjelaskan mekanisme/proses
yang terjadi pada KLT dan kromatografi kertas
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan penggunaan Penampak bercak
spesifik dan umum dalam pemantauan fraksi

2. Prinsip
Secara umum prinsip pemishan pada kormatografi didasarkan pada pemisahan
senyawa diantara fase diam dan fase gerak. Adsorpsi, desorpsi dan elusi solut
diantara fase diam dan fase gerak (KLT). Partisi solut diantara fase diam dan
fase gerak (Kkt)

3. Pendahuluan
Pemantauan ekstrak dilakukan untuk mengetahui komponen yang ada dalam
ekstrak. Pemantauan komponen ekstrak dilakukan dengan metode diantaranya
kromagtografi lapis tipis (KLT) dan atau kromatografi kertas.

Proses/mekanisme yang terjadi pada KLT adalah adsorpsi, sedangkan pada

kromagtografi kertas adalah partisi. Penyangga yang dapat digunakan pada
KLT adala kaca, plastik dan aluminium. Fase diam/penjerapa yang digunakan
pada KLT silika gel, alumina, kiselgur dan selulosa. Penjerap yang paling
banyak digunakan pada KLT adalah silika gel.

59
 Penyangga yang digunakan pada kromagtografi kertas untuk analitik adalah
kertas Whatman No. 1. Yang berperan sebagai fase diam pada kromatografi
kertas adalah lapisan tipis cairan yang ada pada penyangga. Fase gerak yang
digunakan pada kromatografi kertas antara lain BAW, Forestal dan asam
asetat dengan berbagai konsentrasi.

Fase gerak atau pengembang yang digunakan bergantung kepada kepolaran

komponen yang akan dipisahkan, pengembang dapat berupa pelarut tunggal
atau campuran dua pelarut atau lebih.

Kromatografi lapis tipis umumnya digunakan untuk senyawa yang kurang

polar, sedangkan kromatografi kertas digunakan untuk komponen yang polar.

Sebagai panduan untuk melihat bercak yang akan diamati/diisolasi digunakan

penampak bercak sinar lampu UV λ 254 nm dan λ 365 nm atau dapat
digunakan penampak bercak semprot umum/universal (H 2SO4 10% dalam
metanol atau Uap I2) atau dapat pula digunakan penampak bercak spesifik
untuk golongan senyawa tertentu FeCl3 10 % untuk senyawa fenol, AlCl3 5 %
dalam metanol dan sitroborat untuk Flavonoid dan penampak bercak yang
lainnya.

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Sinar lampu UV - Kertas Whatman (untuk Kkt)
( λ 254 nm dan λ 365 nm) - Pipa kapiler
- Bejana KLT - Botol penampak bercak
- Plat KLT - Penggaris besi
- Gelas ukur

Bahan :
- Ekstrak/Fraksi - Pelarut
- Pembanding/standar - Penampak bercak spesifik
- Penampak bercak umum

60
5. Prosedur Kerja
Pematauan dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
1) Siapkan bejana KLT (chamber)
2) Lapisi bejana dengan kertas saring
3) Siapkan eluen/fase gerak/pengembang (pelarut tunggal atau campuaran)
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen
5) Sejumlah ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai
diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan ekstrak pada pelat dengan menggunakan pipa kapiler
7) Biarkan totolan ekstrak mongering (pelarut menguap)
8) Masukkan pelat yang sudah ditotolkan kedalam bejana. (Perhatian: tinggi
permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak, jangan sampai bercak sampel terendam oleh pengembang)
9) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir pelat
10) Angkat pelat, biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak universal asam sulfat 10% dalam
methanol atau menggunakan penampak bercak spesifik.

Pemantauan dengan kromatografi kertas (Kkt)

1) Siapkan eluen
2) Siapakan bejana (chamber)
3) Lapisi bejana dengan kertas saring
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen sekitar 24 jam
5) Sejumlah ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai
diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan ekstrak pada kertas Whatman No 1 dengan menggunakan pipa
kapiler
7) Biarkan totolan ekstrak mengering (pelarut menguap). Masukkan kertas
Whatman yang sudah ditotolkan ke dalam bejana. (Perhatian: tinggi

61
 permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak, jangan sampai bercak sampel terendam oleh pengembang)
8) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir kertas
9) Angkat kertas, biarkan kertas mongering (pelarut sudah menguap)
10) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak khusus/spesifik

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir) Tergantung metode yang digunakan KLT atau Kkt

62
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

63
6. Hasil Praktikum
Sebelum melakukan percobaan pemantauan fraksi mahasiwa harus melaporkan
data-data terkait pemantauan yang akan dilakukan kepada asisten. kalau hasil
pemantauan ekstrak fase gerak sudah memberikan pemisahan yang baik maka
fase gerak tesebut dapat digunakan untuk pemantauan fraksi:
Nama Senyawa

Struktur senyawa

Pustaka:
Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak

Pustaka Rujukan
(FHI, Jurnal, dll)

Sistem Kromatografi yang dilakukan pada praktikum

Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak Spesifik

Penampak Bercak Umum

64
Hasil Pemantauan
1. Sampel yang harus dipantau ekstrak awal, fraksi hasil ECC dan senyawa
pembanding
2. Wajib cantumkan foto/ gambar plat KLT/Kkt hasil pemantauan)
3. Perhitungan Nilai Rf dari senyawa yang akan diisolasi
4. Dari hasil pemantauan harus sudah dapat disimpulkan senyawa target yang akan
disolasi terdapat pada fraksi yang mana

65
5. Diskusi dan Pembahasan

66
6. Kesimpulan

7. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Gritter, J.Y., Bobbitt, M.J., Schwarting, E.A. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan
ke-2. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Sewell, A.P., Clarke, B., Chromatography Separation. John Wiley & Sons,
London: Published on behalf of ACOL, Thame Polythenic

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

67
 MODUL 7
SUBFRAKSINASI METODE KCV & KK

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu memahami dan melakukan metode fraksinasi pada
pemisahan senyawa metabolit sekunder
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan subfraksinasi
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan mekanisme/proses yang terjadi pada
KCV, kromatografi kolom klasik (KK) dan MPLC
➢ Mahasiswa mampu meyiapkan dan memasang alat untuk fraksinasi
➢ Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi dengan metode KCV,
kromatografi kolom klasik (KK) dan MPLC

2. Prinsip
Secara umum prinsip dari fraksinasi adalah pemisahan senyawa berdasarkan
kepolaran

3. Pendahuluan
Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan komponen dalam ekstrak
berdasarkan kepolaran, sehingga setelah diperoleh fraksi proses isolasi suatu
senyawa dapat dilakukan dengan lebih mudah. Fraksinasi dapat dilakukan
dengan metode ekstraksi cair-cair dan kromatografi.

Proses fraksinasi ekstrak secara ekstraksi cair-cair dilakukan berdasrkan

koefisien partisi senyawa diantara 2 pelarut yang digunakan dengan syarat
pelarut pertama dan kedua tidak boleh saling campur. Pada suatu pustaka
koefisien partisi dinyatakan berdasarkan perbandingan konsentrasi senyawa
dalam rafinat dan ekstraktan, sedangkan pada pustaka lain koefisien partisi
dinyatakan berdasarkan konsentrasi senyawa pada fase atas dan fase bawah.

68
 Metode kromagtografi yang biasanya digunakan untuk fraksinasi ekstrak
adalah kromatografi kolom klasik (KK), kromatografi cair vakum (KCV),
kromatografi cair tekanan menengah (MPLC) dan kromatografi cair kinerja
tingg (KCKT)i. Hasil yang diperoleh dari subfraksinasi fraksi adalah
subfraksi.

Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dilakukan pemantauan untuk

mengetahui keberadaan senyawa yang akan diisolasi berada pada fraksi,
sehingga fraksi yang menunjukan senyawa target diketahui.

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Seperangkat alat kromatografi - Gelas ukur
kolom klasik (KK) - Corong saring
- Seperangkat alat kromatografi cair - Statif
vakum (KCV) - Botol penampung fraksi
- Mortar stamper - Batang pengaduk
- Beaker glass

Bahan :
- Fraksi - n-heksana
- Etanol - etil asetat
- akuades - kapas bebas lemak

5. Prosedur Kerja
Kromatografi cair vakum (KCV)
1) Siapkan seperangkat alat KCV
2) Sejumlah fraksi/ekstrak kental ( y gram) dimasukkan ke dalam mortar,
tambahkan sedikit pelarut. Tambahkan sedikit serbuk adsorben (misal :
silika gel H) sambil diaduk (maksimum panambahan serbuk silika gel
untuk pembuatan serbuk ekstrak adalah 1:1), diperoleh serbuk ekstrak.
3) Siapkan macam-macam komposisi eluen yang akan digunakan (masing-
masing dalam botol bermulut lebar)

69
4) Masukkan dan ratakan serbuk adsorben (z gram) ke dalam kolom KCV
5) Jalankan alat vakum, atur ketinggian serbuk adsorben sampai diperoleh
sedemikian rupa tinggi adsorben dalam kolom lebih kurang 5 – 6 cm
6) Matikan alat vakum
7) Masukkan dan ratakan serbuk ekstrak di atas adsorben
8) Letakkan kertas saring di atas serbuk ekstrak
9) Jalankan alat vakum
10) Masukkan komposisi eluen yang pertama (jumlah volume eluen pertama
dilebihkan, karena digunkan untuk pembasahan fase diam).
Botol kosong bekas tempat eluen ditaruh dibawah kran, gunakan untuk
menampung eluen dan komponen yang terekstraksi
11) Biarkan eluen terkumpul pada kolom penampung, sampai tidak ada lagi
eluen yang menetes
12) Matikan alat vakum, buka kran pada kolom penampung. Tampung eluen
dan komponen terekstraksi
13) Lakukan hal yang sama untuk komposisi eluen selanjutnya
14) Fraksi-fraksi yang diperoleh dipekatkan dan ditimbang
15) Lakukan pemantauan fraksi dengan KLT atau kromatografi kertas

Kromatografi Kolom Klasik (KK)

1) Siapkan sejumlah volume (….mL) eluen yang komposisinya diperoleh
dari data pustaka atau dari data KLT
2) Siapkan sejumlah botol vial ukuran 10 mL
3) Timbang sejumlah fraksi/ekstrak kental (v gram) larutkan dalam sedikit
eluen (point 1) atau pelarut lain
4) Timbang sejumlah adsorben (w gram), masukkan ke dalam sebagian
eluen, aduk, diperoleh lumpuran adsorben
5) Sumbat ujung kolom dengan kapas bebas lemak
6) Masukkan eluen ke dalam kolom, sambil biarkan kran dibuka sedikit
sehingga eluen turun
7) Masukkan lumpuran adsorben sedikit demi sedikit ke dalam kolom,
sampai diperoleh adsorben yang padat dan tidak ada udara yang terjebak
8) Turunkan eluen sampai lapisan tipis permukaan eluen di atas permukaan
adsorben, tutup kran

70
9) Masukkan sedikit demi sedikit larutan ekstrak di atas permukaan
adsorben
10) Masukkan sedikit demi sedikit eluen, sampai permukaan eluen minimum
sekitar 2 cm di atas permukaan larutan ekstrak.
11) Buka kran. Eluen akan turun. (Eluen di atas permukaan adsorben tidak
boleh sampai kering. Jangan lupa: selalu menambahkan eluen pada
bagian atas kolom
12) Tampung fraksi-fraksi pada botol vial
13) Fraksi yang diperoleh dipekatkan dan ditimbang
14) Lakukan pemantauan fraksi dengan KLT atau kromatografi kertas

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

71
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

72
6. Hasil Praktikum
Hasil Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Nama Fraksi
(yang akan di KCV)

Jumlah Fraksi g
(yang akan di KCV)

Jenis Silika gel

(yang digunakan untuk KCV)

Jumlah silika gel untuk

menyerbukan fraksi
g
Jumlah silika gel sebagai fase
diam pada KCV
g

Perhitungan Kebutuhan silika

gel

Sistem Fase Gerak Pada KCV

No Pelarut 1 (mL) Pelarut 2 (mL) Pelarut 3 (mL) Volume
… … … Total (mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
10
11
12

73
Hasil Kromatografi Kolom Klasik (KK)
Nama Fraksi
(yang akan di KK)

Jumlah Fraksi g
(yang akan di KK)

Jenis Silika gel

(yang digunakan untuk KK)

Jumlah silika gel untuk

menyerbukan fraksi
g
Jumlah silika gel sebagai fase
diam pada KK
g
Perhitungan Kebutuhan silika
gel

Sistem Fase Gerak Pada KK

Fase gerak yang digunakan untuk KK, hasil orientasi dengan KLT yang
memberikan pola pemisahan yang baik dan senyawa target ada pada nilai Rf 0,2-
0,3.
Fase gerak
(yang digunakan untuk KK)

Volume total
(yang digunakan untuk elusi KK)

74
Jumlah SubFraksi yang diperoleh
Jumlah Fraksi

Hasil Pemekatan SubFraksi

Pemekatan SubFraksi difokuskan terhadap subfraksi yang mengandung senyawa
target yang akan disolasi (berdasarkan hasil pemantauan SubFraksi)
1.
2.
Nama SubFraksi
3.
4.
Metode Pemekatan SubFraksi

Nama Alat

Pengaturan Alat
-
Jumlah SubFraksi Pekat
1. g
2. g
3. g
Hitung Rendemen Fraksi (%)
1.

2.

3.

75
Foto Proses KCV dan KK
(Wajib cantumkan foto seperangkat alat KCV dan KK, disertai dengan keterangan
gambar dan proses pemisahan yang terjadi)

76
7. Diskusi dan Pembahasan

77
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Gritter, J.Y., Bobbitt, M.J., Schwarting, E.A. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan
ke-2. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung.

Johnson, L.E., Stevenson, R. Dasar Kromatografi Cair. 1991. Dasar Kroatografi

Cair. Penerbit ITB, Bandung.

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

78
Tugas Pendahuluan
Pertanyaan (dijawab sebelum praktikum dilaksanakan)
1. Mengapa proses ekstraksi cair-cair harus diulangi minimum 3 kali? Jelaskan
dengan contoh
2. Jelaskan proses/mekanisme yang terjadi pada:
a. KCV
b. Kromatografi kolom
c. HPLC/KCKT
3. Jelaskan macam-macam cara penyiapan kolom pada kromatografi kolom
klasik. Jelaskan perbedaannya
4. Untuk melakukan fraksinasi suatu ekstrak, tersedia suatu kolom klasik
dengan data sebagian berikut: diameter luar 2,4 cm, diameter dalam 2 cm dan
panjang kolom 50 cm. berapa gram maksimum bobot ekstrak dan adsorben
yang dapat digunakan pada kolom tersebut jelaskan
5. Hasil pemantauan suatu ekstrak secara KLT menunjukkan bahwa senyawa P,
Q, R dan S, masing-masing dengan RF 0,8, 0,75, 0,5 dan 0,3. Senyawa yang
akan diisolasi adalah senyawa R. Jelaskan tahap-tahap yang harus dilakukan
bila data KLT tersebut akan digunakan untuk proses fraksinasi ekstrak secara
kromatografi kolom klasik.

Jawaban

79
Jawaban

80
 MODUL 8
PEMANTAUAN SUB-FRAKSI

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan analisis kandungan senyawa melalui
kromatografi planar
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan pemantauan subfraksi
➢ Mahasiswa mampu mengidentifikasi senyawa target pada subfraksi
➢ Mahasiswa mampu melakukan dan menjelaskan mekanisme/proses
yang terjadi pada KLT dan kromatografi kertas
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan penggunaan Penampak bercak
spesifik dan umum dalam pemantauan subfraksi

2. Prinsip
Secara umum prinsip pemishan pada kormatografi didasarkan pada pemisahan
senyawa diantara fase diam dan fase gerak. Adsorpsi, desorpsi dan elusi solut
diantara fase diam dan fase gerak (KLT). Partisi solut diantara fase diam dan
fase gerak (Kkt)

3. Pendahuluan
Pemantauan ekstrak dilakukan untuk mengetahui komponen yang ada dalam
ekstrak. Pemantauan komponen ekstrak dilakukan dengan metode diantaranya
kromagtografi lapis tipis (KLT) dan atau kromatografi kertas.

Proses/mekanisme yang terjadi pada KLT adalah adsorpsi, sedangkan pada

kromagtografi kertas adalah partisi. Penyangga yang dapat digunakan pada
KLT adala kaca, plastik dan aluminium. Fase diam/penjerapa yang digunakan
pada KLT silika gel, alumina, kiselgur dan selulosa. Penjerap yang paling
banyak digunakan pada KLT adalah silika gel.

81
 Penyangga yang digunakan pada kromagtografi kertas untuk analitik adalah
kertas Whatman No. 1. Yang berperan sebagai fase diam pada kromatografi
kertas adalah lapisan tipis cairan yang ada pada penyangga. Fase gerak yang
digunakan pada kromatografi kertas antara lain BAW, Forestal dan asam
asetat dengan berbagai konsentrasi.

Fase gerak atau pengembang yang digunakan bergantung kepada kepolaran

komponen yang akan dipisahkan, pengembang dapat berupa pelarut tunggal
atau campuran dua pelarut atau lebih.

Kromatografi lapis tipis umumnya digunakan untuk senyawa yang kurang

polar, sedangkan kromatografi kertas digunakan untuk komponen yang polar.

Sebagai panduan untuk melihat bercak yang akan diamati/diisolasi digunakan

penampak bercak sinar lampu UV λ 254 nm dan λ 365 nm atau dapat
digunakan penampak bercak semprot umum/universal (H2SO4 10% dalam
metanol atau Uap I2) atau dapat pula digunakan penampak bercak spesifik
untuk golongan senyawa tertentu FeCl3 10 % untuk senyawa fenol, AlCl3 5 %
dalam metanol dan sitroborat untuk Flavonoid dan penampak bercak yang
lainnya.

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Sinar lampu UV - Kertas Whatman (untuk Kkt)
( λ 254 nm dan λ 365 nm) - Pipa kapiler
- Bejana KLT - Botol penampak bercak
- Plat KLT - Penggaris besi
- Gelas ukur

Bahan :
- Ekstrak/Fraksi - Pelarut
- Pembanding/standar - Penampak bercak spesifik
- Penampak bercak umum

82
5. Prosedur Kerja
Pematauan dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
1) Siapkan bejana KLT (chamber)
2) Lapisi bejana dengan kertas saring
3) Siapkan eluen/fase gerak/pengembang (pelarut tunggal atau campuaran)
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen
5) Sejumlah ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai
diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan ekstrak pada pelat dengan menggunakan pipa kapiler
7) Biarkan totolan ekstrak mongering (pelarut menguap)
8) Masukkan pelat yang sudah ditotolkan kedalam bejana. (Perhatian: tinggi
permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak, jangan sampai bercak sampel terendam oleh pengembang)
9) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir pelat
10) Angkat pelat, biarkan pelat mengering (pelarut menguap)
11) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak universal asam sulfat 10% dalam
methanol atau menggunakan penampak bercak spesifik.

Pemantauan dengan kromatografi kertas (Kkt)

1) Siapkan eluen
2) Siapakan bejana (chamber)
3) Lapisi bejana dengan kertas saring
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen sekitar 24 jam
5) Sejumlah ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai
diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan ekstrak pada kertas Whatman No 1 dengan menggunakan pipa
kapiler
7) Biarkan totolan ekstrak mengering (pelarut menguap). Masukkan kertas
Whatman yang sudah ditotolkan ke dalam bejana. (Perhatian: tinggi

83
 permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak, jangan sampai bercak sampel terendam oleh pengembang)
8) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir kertas
9) Angkat kertas, biarkan kertas mongering (pelarut sudah menguap)
10) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak khusus/spesifik

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir) Tergantung metode yang digunakan KLT atau Kkt

84
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

85
6. Hasil Praktikum
Sebelum melakukan percobaan pemantauan Subfraksi mahasiwa harus
melaporkan data-data terkait pemantauan yang akan dilakukan kepada asisten.
kalau hasil pemantauan ekstrak/fraksi fase gerak sudah memberikan pemisahan
yang baik maka fase gerak tesebut dapat digunakan untuk pemantauan subfraksi:
Nama Senyawa

Struktur senyawa

Pustaka:
Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak

Pustaka Rujukan
(FHI, Jurnal, dll)

Sistem Kromatografi yang dilakukan pada praktikum

Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak Spesifik

Penampak Bercak Umum

86
Hasil Pemantauan
1. Sampel yang harus dipantau, fraksi awal dan subfraksi hasil KVC atau KK
serta senyawa pembanding
2. Wajib cantumkan foto/ gambar plat KLT/Kkt hasil pemantauan)
3. Perhitungan Nilai Rf dari senyawa yang akan diisolasi
4. Dari hasil pemantauan harus sudah dapat disimpulkan senyawa target yang
akan disolasi terdapat pada subfraksi nomor berapa

87
5. Diskusi dan Pembahasan

88
6. Kesimpulan

7. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Gritter, J.Y., Bobbitt, M.J., Schwarting, E.A. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan
ke-2. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Sewell, A.P., Clarke, B., Chromatography Separation. John Wiley & Sons,
London: Published on behalf of ACOL, Thame Polythenic

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

89
 MODUL 9
PEMURNIAN

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan pemurnian senyawa metabolit sekunder
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan pemurnian
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan macam-macam metode pemurnian
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan mekanisme/proses yang terjadi pada
masing-masing metode pemurnian

2. Prinsip
Metode pemurnian yang dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis
preparatif atau kromatografi kertas preparatif. Prinsip pemisahan berdasarkan
pemisahan yang terjadi pada KLT atau Kkt.

3. Pendahuluan
Subfraksi yang diperoleh dari fraksinasi dan masih mengandung dua atau
lebih komponen dapat dimurnikan dengan berbagai macam metode
pemurnian. Setelah diperoleh satu komponen, maka dilakukan uji kemurnian
isolat yang dilakukan melalui beberapa tahap uji.

Pemurnian/isolasi dapat dilakukan diantaranya dengan metode rekristalisasi,

pengendapan, sublimasi, kromatografi lapis tipis preparatif, kromatografi
kertas preparatif dan metode lainya.

Isolat hasil proses pemurnian kemudian dilakukan uji kemurnian, untuk

mengtahui tingkat kemurnian dari isolat, jika isolat belum dalam kondisi
murni maka perlu dilakukan pemurnian kembali.

Uji kemurnian dapat dilakukan dengan metode pengembangan tunggal dengan

minimal tiga pengembang yang berbeda, kromatografi lapis tipis dua dimensi,

90
 kromatografi kertas dua dimensi, uji titik lebur, pemeriksaan dengan KCKT
dan metode lainnya.

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Plat KLT Preparatif - Corong saring
- Kkt preparatif - Spatel
- Bejana kromatografi - Beaker glass
- Penampak bercak - Erlenmeyer
- Pipa kapiler - Gelas ukur

Bahan :
- Subfraksi (yang akan dimurnikan) - Kertas saring
- Pelarut

5. Prosedur Kerja
Kromatografi lapis tipis preparatif
1) Siapkan bejana kromatografi (chamber)
2) Lapisi bejana dengan kertas saring
3) Siapkan eluen/fase gerak (pelarut tunggal atau campuran)
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen
5) Sejumlah fraksi/subfraksi kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut,
sampai dipeloreh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan fraksi/subfraksi secara tidak terputus pada pelat KLT preparatif
dengan menggunakan pipa kapiler, sehingga berbentuk pita (tebal pita
maksimum 5 mm)
7) Biarkan totolan fraksi/subfraksi mongering (pelarut menguap)
8) Masukkan pelat yang sudah ditotolkan ke dalam bejana. (Perhatian: tinggi
permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
beracak, jangan sampai pita sampel terendam)
9) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir pelat
10) Angkat pelat, biarkan pelat mongering (pelarut menguap)

91
11) Lihat warna-warna pita secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
pita tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot bagian pinggir kiri dan kanan pelat dengan penampak bercak
universal asam sulfat 10 % dalam metanol (pada waktu menyemprot
bagian pinggir kiri dan kanan pelat, tutup bagian tengah pelat)
12) Kerok pita senyawa yang diisolasi, kumpulkan pada suatu wadah
13) Masukkan pelarut tertentu ke dalam wadah yang berisi kerokan pita aduk,
sehingga senyawa yang akan diisolasi larut sedangkan serbuk silika gel
tidak larut
14) Saring dengan kertas saring, sehingga sebagian besar silika gel akan
tertahan di kertas saring
15) Ulangi penyaringan berkali-kali dengan kapas, sehingga tidak terdapat
partikel serbuk silika gel dalam larutan senyawa

Kromatografi kertas preparatif

1) Siapkan eluen
2) Siapkan bejana kromatografi (chamber)
3) Lapisi bejana dengan kertas saring
4) Masukkan eluen ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh
dengan uap eluen sekitar 2 jam
5) Sejumlah fraksi/subfraksi kental dilarutkan dalam beberapa mL pelarut,
sampai diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan fraksi/subfraksi secara tidak terputus pada kertas Whatman No 3
dengan menggunakan pipa kapiler sehingga berbentuk pita (tebal pita
maksimum 5 mm)
7) Biarkan totolan fraksi/subfraksi mongering (pelarut menguap). Masukkan
kertas Whatman yang sudah ditotolkan ke dalam bejana. (Perhatian: tinggi
permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak)
8) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir kertas
9) Angkat kertas, biarkan kertas mongering (pelarut sudah menguap)
10) Lihat warna-warna pita secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
pita tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot bagian pinggir kiri dan kanan kertas dengan penampak bercak

92
 khusus (pada waktu menyemprot bagian pinggir kiri dan kanan kertas,
tutup bagian tengah kertas)
11) Gunting pita senyawa yang akan diisolasi menjadi bagian-bagian kecil,
kumpulkan pada suatu wadah
12) Masukkan pelarut tertentu ke dalam wadah yang berisi guntingan pita,
aduk, sehingga senyawa yang akan diisolasi larut sedangkan kertas tidak
larut
13) Saring dengan kertas saring, sehingga guntingan kertas akan tertahan di
kertas saring
14) Ulangi penyaringan berkali-kali, sehingga tidak terdapat partikel selulosa
dalam larutan senyawa

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)
Disesuaikan dengan metode pemurnian yang akan dikerjakan

93
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

94
6. Hasil Praktikum
Sistem kromatografi yang akan dilakukan dan senyawa yang akan diisolasi
Nama Senyawa

Struktur senyawa

Pustaka:
Fase diam

Fase gerak

Nilai Rf

Penampak Bercak

Pustaka Rujukan
(FHI, Jurnal, dll)

95
Hasil KLT/Kkt Preparatif
Wajib cantumkan foto/ gambar plat KLT/Kkt preparatif dan proses pemurnian
yang dilakukan

96
7. Diskusi dan Pembahasan

97
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Gritter, J.Y., Bobbitt, M.J., Schwarting, E.A. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan
ke-2. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Hostettmann, K., Hostettmann, M., Marston, A. 1995. Cara Kromatografi

Preparatif. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

98
Tugas Pendahuluan
Pertanyaan (dijawab sebelum praktikum dilaksanakan)
1. Sebutkan macam-macam metode lain (di luar dari yang telah disebutkan di
atas) yang dapat digunakan untuk pemurnian dan jelaskan prosedur dan
proses/mekanisme yang terjadi pada masing-masing metode. Jelaskan
kelebihan dan kekurangannya
2. Sebutkan tahap-tahap lain (di luar dari yang telah disebutkan di atas) yang
dilakukan untuk uji kemurnian isolat dan jelaskan prosedur dan
proses/mekanisme yang terjadi pada masing-masing metode. Jelaskan
kelebihan dan kekurangannya
3. Apakah spektrofotometri ultraviolet dapat digunakan untuk menguji
kemurnian suatu isolat? Jelaskan
4. Spektrum ultraviolet suatu isolat A dalam metanol menunjukkan adanya 1
puncak pada panjang gelombang 270 nm, sedangkan isolate B dalam metanol
menunjukka adanya 2 puncak pada panjang gelombang 265 dan 358 nm.
Senyawa manakah yang murni? Jelaskan
5. Pada suatu pustaka dinyatakan bahwa jarak lebur senyawa X adalah 235 –
237° C. dari hasil suatu penelitian diperoleh senyawa X dengan jaral lebur 231
-234°C. Apakah isolat X yang diperoleh dari penelitian tersebut dapat
dinyatakan murni? Jelaskan

Jawaban

99
Jawaban

100
 MODUL 10
UJI KEMURNIAN

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan uji kemurnian terhadap senyawa metabolit
sekunder
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan uji kemurnian
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan macam-macam metode uang
digunakan untuk uji kemurnian
➢ Mahasiswa mampu melakukan uji kemurnian dan menyimpulkan hasil
uji kemurnian untuk setiap metode

2. Prinsip
Uji kemurnian yang dilakukan dengan metode KLT/Kkt pengembangan
tunggal dengan tiga macam fase gerak berbeda dan KLT/Kkt dua dimensi.
Prinsip pemisahan berdasarkan pemisahan yang terjadi pada KLT/Kkt. Isolat
dikatakan murni kalau diperoleh kromatogram yang menghasilkan satu bercak
dengan penampak bercak universal.

3. Pendahuluan
Subfraksi yang diperoleh dari fraksinasi dan masih mengandung dua atau
lebih komponen dapat dimurnikan dengan berbagai macam metode
pemurnian. Setelah diperoleh satu komponen, maka dilakukan uji kemurnian
isolat yang dilakukan melalui beberapa tahap uji.

Pemurnian/isolasi dapat dilakukan diantaranya dengan metode rekristalisasi,

pengendapan, sublimasi, kromatografi lapis tipis preparatif, kromatografi
kertas preparatif dan metode lainya.

101
 Isolat hasil proses pemurnian kemudian dilakukan uji kemurnian, untuk
mengtahui tingkat kemurnian dari isolat, jika isolat belum dalam kondisi
murni maka perlu dilakukan pemurnian kembali.

Uji kemurnian dapat dilakukan dengan metode pengembangan tunggal dengan

minimal tiga pengembang yang berbeda, kromatografi lapis tipis dua dimensi,
kromatografi kertas dua dimensi, uji titik lebur, pemeriksaan dengan KCKT
dan metode lainnya.

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Plat KLT - Spatel
- Bejana kromatografi - Beaker glass
- Penampak bercak - Erlenmeyer
- Pipa kapiler - Gelas ukur

Bahan :
- Isolat - Kertas saring
- Pelarut (fase gerak)

5. Prosedur Kerja
Tahap-tahap uji kemurnian :
KLT/Kkt pengembangan tunggal
(minimum dengan 3 macam pengembang)
1) Siapkan bejana kromatografi (chamber)
2) Lapisi bejana dengan kertas saring
3) Siapkan eluen/fase gerak ke 1 (pelarut tunggal atau campuran)
4) Masukkan eluen ke 1 ke dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana
jenuh dengan uap eluen
5) Sejumlah isolat dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai diperoleh
larutan yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
6) Totolkan larutan pada pelat/kertas dengan menggunakan pipa kapiler
7) Biarkan totolan mongering (pelarut menguap)

102
8) Masukkan pelat/kertas yang sudah ditotolkan ke dalam bejana.
(Perhatian: tinggi permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari
pada totolan bercak)
9) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir
pelat/kertas
10) Angkat pelat/kertas, biarkan pelat/kertas mengering (Pelarut menguap)
11) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet. Jika
bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu ultraviolet,
semprot dengan penampak bercak universal asam sulfat 10% dalam
metanol
12) Lakukan hal yang sama 3 – 11 dengan menggunakan pelat yang berada
dengan eluen ke 2 dan ke 3 (eluen ke 2 lebih polar dari pada eluen ke 1
dan eluen ke 3 lebih polar dari pada eluen ke 2) bisa diganti komposisi
atau diganti dengan pelarut lain
13) Isolat kemungkinan murni jika kromatogram pada ketiga macam
eluen/fase gerak di atas hanya menunjukkan 1 bercak

KLT/Kkt dua dimensi

1) Sejumlah isolat dilarutkan dalam beberapa mL pelarut, sampai diperoleh
larutan yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer
2) Totolkan larutan pada pelat/kertas dengan menggunakan pipa kapiler
3) Biarkan totolan mongering (pelarut menguap)
4) Masukkan pelat/kertas yang sudah ditotolkan ke dalam bejana (Perhatian:
tinggi permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah dari pada totolan
bercak)
5) Biarkan eluen/fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir
pelat/kertas
6) Angkat pelat/kertas, biarkan pelat/kertas mengering (Pelarut menguap)
7) Lihat warna bercak secara visual atau di bawah lampu ultraviolet (pada
tahap ini tidak boleh disemprotdengan penampak bercak). Pelat diputar 90°
(tegak lurus)
8) Lakukan hal yang sama 4 –7 dengan menggunakan pelat yang berbeda
dengan eluen ke 2 (eluen ke 2 lebih polar dari pada eluen ke 1). Bisa
diganti komposisi atau diganti dengan pelarut lain .

103
9) Jika bercak tidak berwarna atau berfluorosensi di bawah lampu
ultraviolet, semprot dengan penampak bercak universal asam sulfat 10%
dalam metanol
10) Isolat kemungkinan murni jika kromatogram pada kedua macam
eluen/fase gerak di atas hanya menunjukkan 1 bercak

Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)
Disesuaikan dengan metode uji kemurnian yang akan dikerjakan

104
Bagan Kerja :
(Dibuat bagan alir)

105
6. Hasil Praktikum
Uji kemurnian
Metode Uji Kemurnian
(KLT atau Kkt)
Fase Diam

Wajib cantumkan foto/gambar plat KLT/Kkt hasil uji kemurnian yang dilakukan
dilakukan

106
Pengembangan Tunggal (Tiga Macam Fase Gerak Yang Berbeda)
Gambar Plat

Fase Gerak 1

Penampak Bercak

Nilai Rf Isolat

Jumlah Bercak

Kesimpulan
(murni atau tidak

Fase Gerak 2

Penampak Bercak

Nilai Rf Isolat

Jumlah bercak

Kesimpulan
(murni atau tidak

Fase Gerak 3

Penampak Bercak

Nilai Rf Isolat

Jumlah bercak

Kesimpulan
(murni atau tidak

107
Uji Kemurnian Dua Dimensi
Dimensi 1

Fase gerak 1

Hasil Pengamatan Plat

(tuliskan jumlah bercak yang teramati)
Pada UV λ 254 nm

Pada UV λ 366 nm

Pada Sinar tampak

Dimensi 2 (setelah plat diputar 90°)

Fase gerak 2

Hasil Pengamatan Plat

(tuliskan jumlah bercak yang teramati)

Pada UV λ 254 nm

Pada UV λ 366 nm

Pada Sinar tampak

Penampak Bercak Umum

(yang digunakan untuk uji kemurnian)
Jumlah bercak
setelah plat disemprot penampak bercak umum
Kesimpulan
(murni atau tidak)

108
7. Diskusi dan Pembahasan

109
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2009). Farmakope Herbal
Indonesia. Edisi Pertama. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan;
Jakarta.

Gritter, J.Y., Bobbitt, M.J., Schwarting, E.A. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan
ke-2. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung.

Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Hostettmann, K., Hostettmann, M., Marston, A. 1995. Cara Kromatografi

Preparatif. Terjemahan: Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB, Bandung

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

110
 MODUL 11
KARAKTERISASI & IDENTIFIKASI

1. Tujuan
1.1 Kompetensi yang Dicapai
Mahasiswa mampu melakukan karakterisasi dan identifikasi senyawa
metabolit sekunder
1.2 Tujuan Praktikum
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan tujuan karakteristik dan identifikasi
isolat
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan macam-macam metode yang dapat
digunakan untuk karakterisasi dan identifikasi isolat
➢ Mahasiswa mampu menjelaskan mekanisme/proses yang terjadi pada
masing-masing metode untuk karakterisasi dan identifikasi
➢ Mahasiswa mampu melakukan karakterisasi dan identifikasi isolat

2. Prinsip
Karakterisasi secara spektrofoskopi menggunakan Spektrofotometri UV-Vis
dan IR, sebagai awal untuk penentuan struktur isolat.
Spektrum hasil pengukuran dianalisis dan dibandingkan dengan data pustaka

3. Pendahuluan
Isolat yang diperoleh dari pemurnian dapat ditentukan cirri-cirinya melaui
proses karakterisasi dengan berbagai macam metode. Setelah proses
karakterisasi maka isolat dpat ditentukan strukturnya. Karakterisasi meliputi
penentuan ciri/sifat kimia, fisika, kromatografi, ciri fisika kimia

4. Alat dan Bahan

Alat :
- Spektrofotometri UV-Vis - Beaker glass
- Spektrofotometri IR - Erlenmeyer
- Kuvet - Gelas ukur
- Spatel

111
 Bahan :
- Isolat - Pelarut
-

5. Prosedur Kerja
Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel
1) Masukkan sejumlah pelarut A ke dalam kuvet (blanko)
2) Ukur serapan blanko pada λ 200-400 nm. (sebaiknya hasil pengukuran
blanko berupa garis lurus)
3) Sejumlah isolat X dilarutkan dalam pelarut A. (sampel)
4) Ukur serapan larutan sampel dalm pelarut A pada λ 200-400 nm
(diperoleh spektrum ultraviolet-visibel isolat X dalam pelarut A)

Spektrofotometri Inframerah
Prosedur tergantung dari tipe alat yang digunakan
1) Disipakan sejumlah KBr yang sudah dikeringkan
2) Campurkan sejumlah isolat X dan KBr
3) Buat campuran isolat dan KBr menjadi pellet
4) Ukur serapan isolat X dalam pellet KBr pada bilangan gelombang 4000-
600 cm-1 (diperoleh spektrum inframerah isolat X dalam pellet KBr)

112
(Dibuat bagan alir)
Disesuaikan dengan metode uji kemurnian yang akan dikerjakan

113
6. Hasil Praktikum
Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel dan IR
(Data senyawa standar/Pustaka)
Nama Senyawa
(target yang akan diisolasi)

Gambar Struktur Senyawa

Pustaka ….
Golongan Senyawa

Spektrum
Ultraviolet-Visibel
(dari senyawa standar
yang dianalisis atau dari
Pustaka)
➢ Pelarut :

➢ Panjang gelombang
maksimum :

Spektrum
inframerah

(dari senyawa standar

yang dianalisis atau dari
pustaka)

114
Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel dan IR (ISOLAT)
Kode Isolat
Pelarut

Spektrum
Ultraviolet-
Visibel Isolat

Panjang
gelombang
maksimum Isolat

Spektrum
Inframerah
Isolat

Gugus fungsi
dari isolat

115
Data Hasil Pengamatan

116
7. Diskusi dan Pembahasan

117
8. Kesimpulan

9. Pustaka
Sarker, S.D., Nahar, L., 2013. Methods In Molecular Biology. Springer New York
Dordrecht Heidelberg London, US: Humana press

Cantumkan Pustaka lain yang digunakan

118
Tugas Pendahuluan
Pertanyaan (dijawab sebelum praktikum dilaksanakan)
1. Jelaskan macam-macam metode lain yang dapat digunakan untuk
karakterisasi suatu isolat (di luar dari yang telah disebutkan diatas)
2. Jelaskan proses/mekanisme yang terjadi pada masing-masing metode yang
dapat digunakan untuk karakterisasi isolat
3. Jelaskan data yang dapat diperoleh dari masing-masing metode (pada soal no
2)
4. Apakah spektrum ultraviolet-visibel suatu zat dapat dijadikan untuk
identifikasi zat tersebut? Jelaskan
5. Jelaskan mengapa pada spektrum ultraviolet-visibel hanya diperoleh satu, dua
atau tiga puncak, sedangkan pada spektrum inframerah diperoleh banyak
puncak?
6. Jelaskan cara lain (di luar dengan pellet KBr) yang dapat digunakan untuk
pengukuran spektrum infamerah?
7. Jelaskan mengapa pellet KBr paling banyak digunkan untuk pengukuran
spektrum inframerah?
8. Sprektrum ultraviolet senyawa kuersetin menunjukkan 2 puncak. Jelaskan
mengapa terjadi 2 puncak tersebut?
9. Apa persyaratan pelarut yang akan digunakan untuk pengukuran dengan
metode spektrometri resonasi magnet inti. Jelaskan?
10. Mengapa TMS digunakan sebagai pembanding dalam pengukuran dengan
metode spektrometri resonansi magnet inti?

Jawaban

119
Jawaban

120
 LAMPIRAN
BAGAN UMUM KERJA ISOLASI SENYAWA BAHAN ALAM

Praktikum
Penapisan Fitokimia Simplisia Karakterisasi simplisia Farmakognosi

Metode Ekstraksi

Ekstrak
Pemantauan Ekstrak

Ekstrak yang dipilih

Metode Fraksinasi ke 1
Fraksi
Pemantauan Fraksi

Fraksi yang dipilih

Metode Fraksinasi ke 2
Subfraksi
Pemantauan subfraksi

Subfraksi yang dipilih

Metode Pemurnian/Isolasi
Isolat

Karakterisasi & Identifikasi

Struktur Kimia

121