Kepada Yth : Tutorial Hematologi

Rencana baca : Senin 3 Mei 2021

Waktu/tempat : Via Zoom Lantai 4

PEWARNAAN SUPRAVITAL BRILLIANT CRESYL BLUE (BCB)

CARA BASAH
Reskiana Syahrir, Agus Alim Abdullah, Mansyur Arif
Program Pendidikan Dokter Spesialis -1 Ilmu Patologi Klinik FK Universitas Hasanuddin
RSUP Dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar

I. PENDAHULUAN
Pembentukan eritrosit terjadi melalui proses yang kompleks yang disebut eritropoiesis.
Proses ini dimulai di sumsum tulang dari sel induk hematopoietik pluripoten (hematopoietic
stem cell / HSC). Eritropoiesis terdiri dari tiga fase; fase pertama yang disebut fase
engagement melibatkan diferensiasi HSC menjadi sel progenitor eritroid. Pada fase ini,
terjadi pembentukan burst-forming unit-erythroid / BFU-E yang kemudian berdiferensiasi
menjadi colony-forming unit-erythroid / CFU-E. Fase eritropoiesis berikutnya melibatkan
diferensiasi prekursor lebih lanjut dari bentuk proeritroblas menjadi normoblas basofilik,
polikromatofilik, dan ortokromatofilik. Fase ini ditandai dengan akumulasi hemoglobin
secara bertahap, penurunan ukuran sel yang progresif dan kondensasi inti sel yang pada
akhirnya menyebabkan enukleasi atau pengeluaran inti sel dari eritroblas sehingga
membentuk retikulosit yang merupakan eritrosit imatur tanpa nukleus dengan sisa-sisa RNA.
Fase ketiga dan terakhir dari eritropoiesis melibatkan transformasi retikulosit menjadi
eritrosit.1,2
Perbedaan karakteristik utama antara retikulosit dan eritrosit matur adalah retikulosit
belum memiliki bentuk bikonkaf seperti eritrosit matur. Pematangan retikulosit terjadi di
sumsum tulang sebelum akhirnya dilepaskan ke dalam sirkulasi perifer di mana retikulosit
mengalami pematangan lebih lanjut menjadi eritrosit yang matur (Gambar-1).2
Pemeriksaan jumlah retikulosit adalah cara paling efektif untuk menilai pembentukan
eritrosit atau respons terhadap anemia. Sumsum tulang dapat meningkatkan produksinya
hingga tujuh kali lipat saat terjadi anemia, produksi eritropoetin meningkat sebagai
mekanisme kompensasi terhadap hipoksia jaringan akibat anemia sehingga terjadi
peningkatan produksi eritrosit prematur. Kegagalan untuk menghasilkan retikulosit dapat
terjadi pada eritropoiesis yang tidak efektif, suatu kondisi di mana prekursor eritrosit

TUTORIAL HEMATOLOGI 1
dihancurkan sebelum dikirim ke dalam sirkulasi perifer atau bila terdapat tumor atau sel
abnormal dalam sumsum tulang.3

Gambar 1. Gambaran Umum Eritropoiesis 2

Retikulosit merupakan indikator penting dari fungsi sumsum tulang. Penghitungan

jumlah retikulosit dapat membantu dalam mendiagnosis dan menganalisis penyebab anemia.
Kadar persentase jumlah retikulosit menandakan berbagai penyakit, misalnya jumlah
retikulosit yang tinggi menandakan kemungkinan adanya anemia hemolitik, sedangkan
jumlah retikulosit yang rendah menandakan kemungkinan adanya anemia aplastik atau
anemia defisiensi besi atau pansitopenia. Evaluasi dan penghitungan jumlah retikulosit
memerlukan pewarnaan supravital.1,3
Pemeriksaan retikulosit dapat dilakukan baik dengan metode manual maupun metode
otomatis. Metode manual masih merupakan merupakan metode standar untuk pemeriksaan
retikulosit yaitu dengan pewarnaan supravital. Pewarnaan supravital adalah metode
pewarnaan yang digunakan dalam pemeriksaan mikroskopik untuk memeriksa sel yang telah
dikeluarkan dari suatu organisme. Pewarnaan supravital berbeda dengan pewarnaan
intravital, yang dilakukan dengan menyuntikkan atau memasukkan pewarna ke dalam tubuh.
Pada umumnya, pewarnaan supravital dalam pemeriksaan retikulosit menggunakan pewarna
brilliant cresyl blue. Pewarnaan supravital dengan brilliant cresyl blue dapat memiliki dua
metode yakni cara basah dan cara kering. Perbedaan dari kedua cara tersebut terletak pafa
cara pengerjaannya. Pewarna ini memungkinkan pemeriksa untuk melihat pola
retikulofilamen ribosom yang secara khas mengendap dalam eritrosit imatur. Penghitungan
jumlah sel tersebut dapat memberikan gambaran mengenai aktivitas sumsum tulang dan
kemungkinan adanya anemia.4

II. TUJUAN

TUTORIAL HEMATOLOGI 2
 Tujuan dari tutorial ini adalah untuk mengetahui prosedur pewarnaan supravital dengan
pewarna Brilliant Cresyl Blue untuk menghitung jumlah retikulosit.

III. METODE
A. Pra Analitik
1. Persiapan Pasien: Tidak membutuhkan persiapan khusus.

2. Persiapan Sampel:1,3,5
- Sampel yang digunakan adalah darah vena.
- Darah disimpan di dalam tabung Ethylene Diamine Tetra Acetic-acid (EDTA).

Gambar 2. Tabung EDTA.

(Sumber: Dokumentasi Pribadi)

- Untuk mencegah mikro-koagulasi, kocok tabung EDTA sebanyak 8-10 kali segera
setelah sampel darah diambil.

Gambar 3. Cara Mengocok Tabung EDTA.3

TUTORIAL HEMATOLOGI 3
 - Sampel darah dalam tabung EDTA dapat disimpan pada suhu ruang selama 8 jam
atau pada lemari es dengan suhu 2°C hingga 8°C selama 24 jam.

3. Persiapan Alat dan Bahan:4,6

Alat:
a. Alat Flebotomi:
- Vacutainer blood collection system

Gambar 4. Vacutainer Blood Collection System.5

Gambar 5. Proses Pengambilan Sampel Darah.3

- Torniket
- 70% alcohol swab

TUTORIAL HEMATOLOGI 4
 - Kassa atau kapas
- Label sampel
- Tempat pembuangan jarum / sharps container

Gambar 6. Prosedur Flebotomi.7

b. Adapun alat lain yang dibutuhkan adalah:

- Pipet hemoglobin

Gambar 7. Pipet Hemoglobin 7

TUTORIAL HEMATOLOGI 5
 - Kaca penutup / cover glass

Gambar 8. Kaca penutup

(Sumber; Dokumentasi pribadi)
- Mikroskop
- Microscope slide
- Minyak imersi

Gambar 9. Mikroskop dan alat lain.

(Sumber: Dokumentasi Pribadi)

Bahan:
a. Sampel:
Darah vena dalam tabung EDTA:
- Pengambilan sampel harus dilakukan oleh tenaga medis.
- Sampel harus diberi label keterangan yang jelas.
- Instrumen yang sesuai harus digunakan selama pengambilan sampel.

TUTORIAL HEMATOLOGI 6
 b. Reagen:
Larutan pewarna brilliant cresyl blue:
- Komposisi pewarna brilliant cresyl blue meliputi air suling 100 ml, natrium
klorida 0,85 g, dan brilliant cresyl blue 1 g.
- Larutan stabil pada suhu 15°C hingga 25°C.
- Larutan dapat dipakai sampai tanggal kedaluwarsa yang telah ditentukan.
- Botol larutan harus selalu tertutup rapat.

Gambar 10. Larutan Pewarna Brilliant Cresyl Blue.6

B. Analitik
1. Prinsip Tes
Pewarna brilliant cresyl blue mewarnai asam nukleat pada retikulosit (substansia

granulofilamentosa), brilliant cresyl blue dapat mengendap menjadi sebuah jalinan

jaringan atau meshwork yang disebut sebagai retikulum di dalam sel. Retikulum akan
tampak berwarna biru tua dengan latar belakang yang relatif bersih (tidak berwarna).
Retikulum merupakan sisa-sisa ribonukleoprotein basofilik yang biasanya ditemukan di
sitoplasma. Semakin matang sel, semakin sedikit retikulum yang dapat ditemukan.
Jumlah retikulosit kemudian dapat dihitung per 1000 eritrosit dan dinyatakan dalam
persentase.6

2. Prosedur Kerja1,4,6

TUTORIAL HEMATOLOGI 7
 - Masukkan satu tetes Brilliant Cresyl Blue (BCB) dalam alcohol atau NaCl di
tengah-tengah kaca objek.
- Masukkan satu tetes darah di atas zat warna dan dicampur dengan menggunakan
sudut kaca objek lain.
- Selanjutnya ditutup dengan kaca penutup, lapisan darah dalam sediaan basah ini
harus tipis. Biarkan beberapa menit.
- Periksalah memakai minyak emersi dan tentukan berapa banyak retikulosit yang
didapat antara 1000 eritrosit.
C. Pasca Analitik
1. Nilai Rujukan:3
Kadar retikulosit normal:
- Dewasa: 0.5%- 2%
- Anak-anak: 0.5% - 2%
- Bayi: 0.5% - 3.5%
- Infant: 2.5% - 6.5%

2. Interpretasi Hasil:
Eritrosit akan tampak berwarna hijau muda samar, sedangkan retikulosit akan
tampak sebagai jaringan atau bercak (retikulum) berwarna hitam-biru, Semakin matang
sel, semakin sedikit retikulum yang dapat ditemukan, dan sebaliknya. (Gambar 11).6,7

Gambar 11. Gambaran Mikroskopik Retikulosit.7

TUTORIAL HEMATOLOGI 8
 Gambar 12. Gambaran Mikroskopik Retikulosit berdasarkan Tingkat Maturitas. 8

Retikulosit yang lebih muda memiliki retikulum yang lebih banyak dan lebih padat,
sedangkan retikulosit yang sudah mendekati maturitas hanya memiliki inklusi seperti
titik-titik kecil (Gambar 12).8
Jumlah retikulosit diekspresikan dalam kaitannya dengan 1000 eritrosit yang
dihitung. Jika jumlah eritrosit rendah, maka jumlah retikulosit absolut / μl dapat
digunakan. Rumus berikut dapat digunakan untuk menghitung persentase retikulosit:3,6
jumlah retikulosit per 1000 eritrosit × 100
Retikulosit (%)=
1000
Sebagai contoh, ditemukan 35 retikulosit per 1000 eritrosit, maka persentase retikulosit
adalah sebagai berikut:3
35× 100
Retikulosit ( % )= =3,5 %
1000
Hitung retikulosit menurun pada keadaan:3
1. Anemia aplastik
2. Paparan radiasi atau terapi radiasi
3. Infeksi kronis

TUTORIAL HEMATOLOGI 9
 4. Obat-obatan seperti azathioprine, chloramphenicol, dactinomycin, methotrexate, dan
kemoterapi lainnya
5. Anemia pernisiosa atau anemia megaloblastik yang tidak diobati

Hitung retikulosit meningkat pada keadaan3

1. Kehilangan darah yang cepat
2. Anemia hemolitik
3. Obat-obatan seperti levodopa, anti-malaria, kortikotropin, dan obat penurun demam
4. Kehamilan

Selain retikulosit, pewarnaan supravital brilliant cresyl blue juga dapat menunjukkan
adanya hemoglobinopati seperti inklusi hemoglobin H berupa granul multipel difus
berwarna biru-ungu yang tersebar dalam eritrosit pada penyakit α-thalassemia. Untuk
dapat menemukan gambaran hemoglobin H, masa inkubasi larutan sampel memerlukan
waktu yang lebih lama yaitu sekitar 1 hingga 2 jam.7

Gambar 13. Hemoglobin H.7

Hemoglobinopati lainnya yang dapat ditemukan dengan pewarnaan supravital
brilliant cresyl blue yaitu Heinz bodies yang dihasilkan dari hemoglobin yang
terdenaturasi dan memiliki gambaran berupa struktur besar dengan diameter sekitar 1
hingga 3 μm pada tepi eritrosit. Heinz bodies biasanya terlihat pada penyakit defisiensi
G6PD atau pada hemoglobinopati yang tidak stabil, seperti hemoglobin Zurich.3

TUTORIAL HEMATOLOGI 10
 Gambar 14. Heinz bodies.3

D. Kelebihan dan Kekurangan 7

Kelebihan Kekurangan
Cara basah Muudah, ringkas dan efisien waktu - Tidak dapat disimpan dalam
waktu yang lama
- Sel retikulosit mudah
bergerak di bawah mikroskop
sehingga sel dapat terhitung
ulang
Cara kering Dapat disimpan dalam waktu yang Proses pembuatan sediaan yang
cukup lama. agak lama.

TUTORIAL HEMATOLOGI 11
DAFTAR PUSTAKA
1. Sogasu D, Brundha MP. Comparison of reticulocyte count by two manual methods.
2020;13(6):838–42.
2. Zivot A, Lipton JM, Narla A, Blanc L. Erythropoiesis: insights into pathophysiology
and treatments in 2017. Mol Med. 23 Desember 2018;24(1):11.
3. Betty Ciesla. Hematology in Practice. 3 ed. Philadelphia: F.A. Davis Company; 2019.
4. Biognost. Brilliant Cresyl Blue, C.I. 51010. Croatia; 2015.
5. BD Life Sciences. Preanalytical Systems Product Catalogue. Plymouth, United
Kingdom; 2018.
6. Sigma-Aldrich. Brilliant cresyl blue solution for the staining of reticulocytes for
microscopy. Canada; 2020.
7. Scott E, Babette B W, G.P S. Wintrobe’s Atlas of Clinical Hematology. 2 ed.
Lippincott, Williams & Wilkins; 2018.
8. Reticulocyte count [Internet]. Histopathology guru. [dikutip 8 Maret 2021]. Tersedia
pada:http://www.histopathology.guru/academics/post-graduate-academics/
reticulocyte-count/

TUTORIAL HEMATOLOGI 12