Metode Sequencing DNA

Anggi Dyah Aristi

Etih Suprianti
Nabila Dwi Agustin

Pengertian
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA
adalah proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu
molekul DNA.
Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens
DNA, yang merupakan informasi paling
mendasar dan mengandung instruksi
yang dibutuhkan untuk pembentukan
tubuh makhluk hidup.

Tujuan Sekuensing DNA

Mengembangkan pengobatan penyakit
genetik.
Mendeteksi mutasi.
Dalam bioteknologi dapat
menghasilkan berbagai produk yg
berguna spt hormon, enzim, asam
amino, dsb.
Mengetahui hubungan kekerabatan
antarorganisme

Metode Sekuensing DNA

Metode Maxam-Gilbert
Metode Sanger

Metode Maxam-Gilbert
Molekul DNA ditandai dgn radioaktif
terlebih dahulu, lalu dipotong-potong
secara parsial menggunakan piperidin.
Selanjutnya basa dimodifikasi
menggunakan bahan-bahan kimia tertentu.
Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa
G, asam format menyerang A dan G,
hidrazin akan menghidrolisis C dan T
Stelah selesai dielektroforesis, lalu urutan
basa dpt diketahui dgn mengurutkan dari
pb yg paling pendek

Metode Maxam-Gilbert
Metode sekuensing Maxam-Gilbert
menjadi tidak populer karena
kerumitan teknisnya, digunakannya
bahan kimia berbahaya, dan
kesulitan dalam scale-up.

Metode Sanger
DNA sequencing menggunakan metode
PCR sebagai pijakannya. Namun
ditambahkan zat2 tertentu dan disebut
cycle sequencing.
Yang membedakan cycle sequencing
dengan PCR biasa adalah:
Primer yang digunakan hanya satu untuk satu
arah pembacaan, tidak dua (sepasang)
seperti PCR
Ditambahkannya ddNTPs (dideoxy-Nucleotide
Triphosphate)

Perbedaan dNTP dan

ddNTP

Molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida kehilangan

gugus OH pada atom C nomor 3 yang berfungsi
berikatan dengan dNTP selanjutnya sehingga tidak
dapat membentuk ikatan fosfodiester.

ddNTP

Cycle
sequencing

Komponen metode Sanger

Metode Sanger memerlukan:
DNA templete dalam bentuk untai
tunggal.
DNA polimerase
Primer yg sesuai
dNTP
ddNTP
Senyawa buffer

Langkah-langkah metode
Sanger
Melakukan reaksi
cycle sequencing
pada 4 tabung
terpisah. Masing2
tabung berisi semua
pereaksi yang
dibutuhkan, kecuali:
ddNTP, hanya 1 jenis
basa nitrogen untuk
setiap tabung.
Setiap tabung diberi
tanda, yaitu huruf A
jika yang
ditambahkan adalah
ddATP, huruf G jika
ddGTP, C jika ddCTP
dan T jika ddTTP.

Metode Sanger

Urutan basa
DNA dapat
ditentukan
dengan
mengurutkan
fragmen yang
muncul dimulai
dari yang
paling bawah
(paling
pendek).
Sehingga
urutan basa
DNA nya
adalah:
ATGCCTGCA

Metode Sanger: Dye

Primer
Tetap menggunakan 4 tabung spt
sebelumnya.
Tiap tabung berisi semua pereaksi PCR
kecuali:
Jenis ddNTP
Primer yg diberi pewarna/ fluorochrom yg
berbeda bagi tiap tabung

Semua primer ditandai= semua

fragmen ditandai juga

Metode Sanger: Dye

Primer

Metode Sanger: Dye

Primer

Metode Sanger: dgn Dye

Terminator
Melabel ddNTP dengan 4 label
fluorescent yang berbeda-beda untuk
ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP.
Keunggulan cara ini adalah bahwa
seluruh proses sekuensing dapat
dilakukan dalam satu reaksi,
dibandingkan dengan 4 reaksi
terpisah pada dye primer

Metode
Sanger: Dye
Terminator

Metode Sanger: Dye

Terminator

Ananlisa sekuens dengan

komputer
Beberapa saat sebelum mencapai elektroda
positif, fragmen DNA terlabel fluorescent
bergerak melalui lintasan sinar laser.
Sinar laser menyebabkan warna pada
fragmen berpendar.
Sebuah alat pendeteksi optis pada mesin
DNA analyzer mendeteksi fluorescent.
Software Data Collection mengkonversi
signal fluorescent menjadi data digital,
kemudian merekam datanya dalam sebuah
file *.ab1. Urutan atau sekuens DNA
ditentukan berdasarkan urutan warna yang
keluar dari gel.

Automatisasi
Mesin sekuensing DNA automatis
modern mampu mengurutkan 384
sampel berlabel fluoresens sekaligus
dalam sekali batch (elektroforesis) yang
dapat dilakukan sampai 24 kali sehari.
Hal tersebut mencakup proses
pemisahan dan proses pembacaan
kurva; reaksi sekuensing, pembersihan,
dan pelarutan ulang dalam larutan
penyangga yang sesuai harus dilakukan
secara terpisah.

STUDI KERAGAMAN GENETIK

Tarsius sp. ASAL KALIMANTAN,
SUMATERA DAN SULAWESI
BERDASARKAN SEKUEN GEN
NADH DEHIDROGENASE SUB-UNIT
4L (ND4L)

Hasil & Pembahasan

Hasil polymerase chain reaction
(PCR) gen ND4L menggunakan
primer ND4LF dan ND4LR diperoleh
478 bp, setelah dilakukan sekuensing
didapatkan sekuen gen ND4L
sebesar 297 nt.

Hasil & Pembahasan

Di antara sampel Tarsius ditemukan satu
situs nukleotida beragam, yaitu pada situs
ke 162. Namun perbedaan nukleotida pada
situs ke-169 tersebut merupakan silent
mutation, yaitu tidak terjadi perubahan
pada susunan asam aminonya.
Sekuen gen ND4L disejajarkan berganda
dengan primata lain dari Genbank
menggunakan Clustal W, dan kemudian
keragaman genetik antar spesies dianalisis.

Hasil & Pembahasan

Jarak genetik berdasarkan basa
nukleotida ND4L dihitung
menggunakan model dua parameterKimura menunjukkan paling kecil
sebesar 0%, paling besar 0,3%, dan
rata-rata 0,1 %.

Hasil & Pembahasan

Hasil & Pembahasan

Pohon filogenetik menggunakan
metode Neighbor joining tidak dapat
membedakan antara Tarsius dari
Sumatera, Kalimantan, dan Sulawesi,
dan mengelompokkan Tarsius dalam
subordo Strepshirrini.

Kesimpulan
Sekuens nukleotida gen ND4L pada
Tarsius bancanus asal Kalimantan, T.
bancanus asal Sumatra, T. spectrum asal
Sulawesi Utara, dan T. dianae asal
Sulawesi Utara hanya berbeda pada satu
situs saja, yaitu pada situs ke-169 dan
semua asam aminonya homolog. Sekuens
nukleotida dan asam amino ND4L tidak
dapat digunakan untuk membedakan
masing-masing Tarsius yang diteliti, dan
sekuens nukleotida ND4L menempatkan
Tarsius sp. pada subordo Strepsirrhini.

TERIMA KASIH