MIKROBIOLOGI

FARMASI II

RUSTINI

FAKULTAS FARMASI
UNAND

11/11/2019 1
 1. Pewarnaan Bakteri
2. Uji Biokimia
3. Antiseptik, desinfektan
dan koefisien fenol
4. Uji efektivitas pengawet
5. Penetapan Vitamin secara
mikrobiologi

11/11/2019 2
 IDENTIFIKASI BAKTERI

1. Pemeriksaan Mikroskopik,
Bentuk bakteri, pewarnaan
2. Pergerakan, Tts bergantung
3. Uji biokimia
4. PCR (Polymerase Chain
Reaction)

11/11/2019 3
 PEWARNAAN BAKTERI
 Dikembangkan Erlich dan Robert Koch
 Yang berperan dinding sel dan membran

sitoplasma

PEWARNAAN BAKTERI HIDUP (LIVING STATE)

 Untuk melihat pergerakan bakteri

 Menggunakan zat warna yang tidak toksis

 Jarang dilakukan karena bakteri hidup sukar

menyerap warna
11/11/2019 4
 PEWARNAAN BAKTERI
MATI (FIXED STATE)
 Intensifier, bahan kimia (fenol,
deterjen), fisika (panas)
 Mordant (memperkuat
ikatan zat warna dengan bakteri
 Zat peluntur warna (alkohol atau
aseton)
 Zat warna tanding (safranin)

11/11/2019 5
 TEORI PEWARNAAN BAKTERI

Teori Fisika (Fisher)

 Proses absorbsi zat warna oleh
bakteri, tergantung pada kekuatan
absorbsi dari permukaan bakteri

Teori Kimia (Paul Ehrlich)

 Reaksi kimia antara zat warna
dengan bakteri, menghasilkan
komponen baru yang berbeda dengan
komponen pembentuknya
11/11/2019 6
 JENIS PEWARNAAN
1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, mewarnai latar
belakang
- Untuk bakteri yang sulit diwarnai
(spirochaeta)
2. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna
- Untuk melihat bentuk sel
3. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam
zat warna (Gram dan Tahan Asam)
4. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur tertentu
bakteri (kapsul, spora, flagel dll)
11/11/2019 7
 Pewarnaan Negatif
Untuk bakteri yang sulit diwarnai, mewarnai latar
belakang sel dengan zat warna asam (hitam nigrosin)
contoh: spirochaeta.

Prinsip

Memerlukan pewarna asam seperti eosin atau

nigrosin yang bermuatan negatif kromogen,tidak
akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel
karena permukaan bakteri juga bermuatan negatif.
Oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat
dengan latar belakang berwarna.

11/11/2019 8
 PROSEDUR KERJA

11/11/2019 9
 Pewarnaan Sederhana
Menggunakan beberapa zat warna
Tujuan untuk melihat bentuk sel mati
dengan mempertinggi kontras antara sel
dan sekelilingnya.

Prinsip:
Zat warna dengan kromogen muatan
positif, asam nukleat bakteri serta
komponen dinding sel bermuatan negatif
menyerap dengan kuat dan mengikat
kation kromogen

11/11/2019 10
11/11/2019 11
 PEWARNAAN DIFERENSIAL
PEWARNAAN TAHAN ASAM
Bakteri tahan asam (acid fast) dan tidak
tahan asam (non acid fast)
 Bakteri tahan asam (karena zat warna

yang diberikan tidak luntur dengan

alkohol 96% dan asam kuat) dinding
selnya mengandung asam mikolat yang
menghambat penetrasi zat warna
11/11/2019 12
 - Contoh : Mycobacterium tuberculosis, M. leprae,
Nocardia

Metoda

1. Ziehl_Neelsen, bakteri berwarna merah, latar

belakang berwarna biru

2. Kinyoun, bakteri berwarna merah, latar

belakang berwarna hijau

3. Mikroskop fluoresent, pewarna fluoresent

(auramine-rhodamin)
11/11/2019 13
 A. Non Acid-fast bacteria
B. Acid-fast bacteria

11/11/2019 14
 PROSEDUR ZIEHL NEELSEN
a smear
↓heat fix
Carbolfuchsin, 8-10min Primary Stain
↓wash
Acid Alcohol, 0.5-1min Decolorization

↓wash
Methylene Blue, 1min Counterstain
↓wash
Dry with paper
↓
Observation

11/11/2019 15
 Acid-fast Non acid-fast

11/11/2019 16
11/11/2019 17
11/11/2019 18
 PEWARNAAN GRAM
- Hans Christian Gram (1884)
- Gram positif (ungu), negatif (merah)

- Hanya dapat dilakukan pada bakteri yang

memiliki dinding sel karena yang berperan

adalah dinding selnya

11/11/2019 19
 - Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal
langsung dari penderita, berupa sputum, pus
(nanah), discharge telinga, discharge hidung,
urin dan cairan serebrospinal.

 Spesimen yang akan diwarnai, dibuat sediaan

atau preparat (smear) terlebih dulu

11/11/2019 20
 Bahan langsung dari penderita
 Bahan disentrifuge, kemudian endapannya
dibuat preparat, diambil dengan ose steril atau
kapas lidi steril kemudian digoreskan pada
gelas objek setipis mungkin

 Panaskan gelas objek di atas nyala api sampai

preparat tersebut kering

 Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu

selama 5 menit dan keringkan

 Setelah kering, preparat siap diwarnai

11/11/2019 21
 Bahan dari biakan cair

 Ambil bakteri dari biakan cair (yang

sebelumnya telah diaduk secara steril) ratakan
pada gelas objek sehingga membentuk
diameter kira-kira 1-2 cm

 Preparat kemudian dikeringkan dan ditetesi

formalin dengan cara seperti pembuatan
preparat langsung.
11/11/2019 22
 Bahan dari media pertumbuhan
padat

 Pada gelas objek teteskan satu ose kaldu atau NaCl,

letakkan bakteri, ratakan hingga membentuk
diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi
sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya
dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan
bahan berasal dari penderita.

11/11/2019 23
 TEORI PEWARNAAN GRAM

Teori Salton

 Berdasarkan kadar lipid yang tinggi di dalam

dinding sel bakteri Gram negatif. Lipid akan
larut waktu pencucian dengan alkohol. Pori-
pori dinding sel membesar, sehingga zat
warna yang sudah diserap mudah dilepaskan
dan bakteri menjadi tidak berwarna.

11/11/2019 24
 Bakteri Gram positif mengalami denaturasi
protein pada dinding selnya akibat pencucian
dengan alkohol. Protein menjadi keras dan
beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks
kristal yodium yang berwarna ungu
dipertahankan dan bakteri akan tetap
berwarna ungu.

11/11/2019 25
 Teori permeabilitas dinding sel

Berdasarkan ketebalan lapisan peptidoglikan

dinding sel.

 Bakteri Gram positif mempunyai susunan

dinding sel yang kompak dengan lapisan
peptidoglikan 30 lapis. Permeabilitas
dinding sel kurang, kompleks kristal yodium
tidak dapat keluar
11/11/2019 26
  Bakteri Gram negatif lapisan peptidoglikan
tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan
dinding selnya tidak kompak.
Permeabilitas dinding sel lebih besar
sehingga masih memungkinkan
terlepasnya kompleks kristal yodium

11/11/2019 27
 Pewarnaan Gram memerlukan :

Warna utama (Kristal violet)

Mordant (larutan iodin)
Peluntur warna (etanol 95 %)
Warna tanding (safranin)

11/11/2019 28
11/11/2019 29
 PROSEDUR KERJA

Prepare a smear, air dry

↓flame 3 times to fix
Crystal violet, 1 min Primary stain
↓wash
Gram’s iodine, 1 min Mordant Stain
↓wash
Ethanol 95%, 0.5 min Decolorization
↓ wash
Safranin, 1 min Counterstain
↓
Dry slide with paper
↓
Observation
(10× lens →40× lens → oil-immersion lens )
11/11/2019 30
Gram Staining Procedure
 Gram Negative Cocci Gram Negative Rods

11/11/2019 32
 Gram Positive Cocci Gram Positive Rods

11/11/2019 33
 PEWARNAAN KHUSUS

 Untuk melihat struktur tertentu

bakteri misalnya kapsul, spora, dan
flagel

 Pewarnaan Schaeffer Fulton

11/11/2019 34
 PEWARNAAN SPORA
 Prinsip

Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar

spora sehingga zat warna utama dapat masuk ke
dalam spora sehingga berwarna hijau.melalui
pendinginan warna utama akan terperangkap di
dalam spora,dengan pencucian zat warna utama
yang ada pada sel vegetatif akan terlepas
sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin),
sel vegetatif akan berwarna merah.

11/11/2019 35
 Prosedur pewarnaan endospora dengan
metode Schaeffer-Fulton.

11/11/2019 36
 Beberapa tipe endospora dan contohnya

11/11/2019 37
 A. Vegetative Cell
B. Endospore

11/11/2019 38
 PEWARNAAN KAPSUL
Cara Anthony, Hiss dan Muir atau pewarnaan
negatif menggunakan tinta cina

Prosedur Hiss :
Dibuat sediaan dan difiksasi
Di (+) kristal violet dan panaskan 1 menit
Dicuci dengan larutan CuSO4 20%
Dikeringkan, dilihat dibawah mikroskop
11/11/2019 39
 PEWARNAAN FLAGEL
 Tujuan untuk menentukan ada atau
tidaknya flagel serta letaknya

Prosedur :
1. Tambahkan 1 ml larutan pewarna flagel
pada sampel, biarkan 10-15 menit. Larutan
jangan keluar dari sampel
2. Genangi sampel dengan air mengalir dari
kran
3. Keringkan sampel dan genangi dengan
karbol fukhsin selama 1 menit. Keringkan di
udara. Jangan keringkan dengan kertas
11/11/2019 hisap 40
11/11/2019 41
11/11/2019 42