ANALISA PANGAN

VITAMIN
Vitamin adalah senyawa organik kompleks yang essensial untuk pertumbuhan
dan fungsi biologis yang lain bagi makhluk hidup.
Berbagai fungsi biokimia dan yang umumnya tidak disintetis oleh tubuh
sehingga harus dipasok dari makanan.
Vitamin juga berperan dalam berbagai macam fungsi tubuh lainnya, termasuk
regenerasi kulit, penglihatan, sistem susunan syaraf dan sistem kekebalan
tubuh.

VITAMIN LARUT
DALAM LEMAK

VITAMIN

VITAMIN LARUT
DALAM AIR
Vitamin Larut di dalam Lemak
Vitamin-vitamin yang larut dalam lemak ini memerlukan absorbsi
lemak yang normal agar vitamin tersebut dapat diabsorbi secara
efisien. Yang merupakan vitamin larut di dalam lemak adalah A,D,E,
dan K.
 Vitamin

Larut Lemak Larut Air

Vitamin A Vitamin D Vitamin E Vitamin K Vitamin C Vitamin B

Pemasan dengan Kromatografi Kromatografi
Spektofotometri H₂O₂ (KCKT) (KCKT) Iodimetri Thiamin (B1)
KCKT Metode
Kolorimetri Antimoni DCIP Riboflavin (B2)
Selimteri
Kromatografi Triklorida Piridoksin (B6)
Pereaksi Gliserol Kolorimetri Kolorimetri
(KCKT)
Diklorohidrin Biotin (B7)
Spektofotometri
Spektrofotometri Asam Folat
Spektofluometri (B9)
Kobolamin
(B12)
 Vitamin A
• Vitamin A merupakan istilah generik untuk semua
senyawa dari sumber hewani selain karotenoid yang
memperlihatkan aktivitas biologik vitamin A
• Senyawa-senyawa aktif vitamin A direpresentasikan
dengan retinoid (ditandai dengan vitamin A) dan zat
awal karetenoidnya (Karetenoid Provitamin A)
• Sumber yang mengandung vitamin A : susu, ikan, wortel,
pisang, dan lain-lain
• Absorbansi maximum vitamin A adalah pada
325-328 nm
• Vitamin A : larut dalam solven organik dan dalam
lemak, tidak larut dalam air
• Hasil reaksi vitamin A dengan antimoni-khlorida
(SbCl3) memiliki absorbansi maximum pada 620
nm
• Preparat vitamin A berupa kristal kuning pucat
dengan titik lebur 63-64oC
 Struktur Vitamin A

Struktur vitamin A alkohol (retinol) & -karoten

(cincin 6-C merupakan komponen kritis untuk aktivitas vitamin A)
 Analisis Vitamin A
pengujian vitamin A dalam
bahan pangan terdiri dari 3 Metode penetapan kadar
tahap yaitu: tahap sponifikasi, vitamin A ada 3 yaitu
tahap ekstraksi, tahap
pemekatan atau penguapan Kromatografi Kolorimetri
pelarut organik dan tahap
pengukuran menggunakan
instrumen, Spektofotometri
SPEKTOFOTMETRI
Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat
mempunyai absorbansi maksimal pada panjang gelombang antara 325
sampai 328 nm dalam berbagai pelarut.

Dalam bentuk
ester

Akseroftol (Vit A)

Dalam bentuk lain

Jika larutan vitamin A menyerap lurus pada daerah panjang
gelombang antara 325-328 nm, maka koreksi geometri dapat
digunakan. Koreksi ini digunakan untuk mengoreksi senyawa
pengganggu yang mempunyai absorbansi tetap, akan tetapi
kesalahan yang besar akan terjadi apabila formula koreksi ini
digunakan terhadap pengganggu yang tidak lurus
 KOLORIMETRI

Metode Carr-Price

Metode ini berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan antimon triklorida

anhidrat dalam kloroform yang menghasilkan warna biru. Reaksi ini terjadi
anatara antimony triklorid dengan rantai tak jenuh dari akseroftol.
Pembacaan biasanya dilakukan dalam waktu 10 sampai 15 detik setelah
sampel ditambah pereaksi
• Metode ini didasarkan pada pembentukan kompleks warna biru
antara antimoni triklorid atau asam trifluoroasetat dengan retinol
dalam kloroform, yang dapat diukur absorbansinya di panjang
gelombang 620 nm
• Minyak hati ikan cod memberikan waran biru-ungu dengan agensia
dehidrator semisal asam sulfat
• AOAC metode 974.29 memperbolehkan dingunakannya asam
trifluoroasetat sebagai ganti antimoni triklorida. Asam trifluoroasetat
mudah digunakan,kurang korosif, serta mampu memberikan warna
yang lebih stabil di badingkan antimoni triklorida
 Prosedur Analisa
Untuk sampel dengan kadar vitamin A rendah  dilakukan
saponifikasi sbb.:
- 10 + 0,1 g sampel ditambah 75ml alkohol 95% dan 25 ml KOH
50% dan dididihkan dengan memakai pendingin balik
- Campuran dipindah ke labu pemisah dan dilakukan ekstraksi
dengan ditambah dietil eter
- Ekstrak eter dicuci dengan H2O, kemudian ditambah Na-
sulfat anhidrat (untuk membebaskan air)
- Eter diuapkan dengan penangas air, kemudian gas N2 
diperoleh ekstrak kering
- Ekstrak kering dilarutkan dalam khloroform
• Untuk sampel yang kaya vitamin A : dilarut-kan sampel dalam
khloroform (konsentrasi akhir = 20% w/v)
• 4ml reagen Carr-Price ditambah 1ml khloroform (sebagai
blanko)
• 0,5ml larutan sampel dalam khloroform ditambah 2ml reagen
Carr-Price, dicampur merata
• Absorbansi campuran ditera pada 620 nm
• Dibuat kurva standar (kisaran konsentrasi vitamin A = 0 – 15
IU/ml)
 Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

• Untuk pengujian rutin aktivitas vitamin A dan untuk karakterisasi retinoid dan
karotenoid dalam sampel, maka kromatografi cair merupakan pilihan utama
untuk analisis
• Keuntungan nyata kromatografi cair dibandingkan dengan teknik yang lain
adalah kemampuannya untuk memisahkan isomer cis- dan trans dari all-trans
retional dan all-trans-karotenoid, mampu memisahkan karotenoid provitamin A
dari campuran karotenoid kompleks
• Metode-metode selain kromatografi cair seperti metode spektroskopi atau
kolometri akan menghasilkan aktivitas vitamin A yang berlebih.
Prinsip:
Vitamin A akan terekstrak ke dalam larutan organik. Semua transretinol dan 13 cisretinol
diukur dengan HPLC dengan kolom silika. HPLC adalah metode yang akurat digunakan dalam
pengukuran vitamin A
Metode Kromatografi (HPLC)
Preparasi Sampel
• Dimasukkan sebanyak 40 mL sampel kedalam tabung digesti 100 mL ,
• Ditambahkan 10 mL etanolik pirogallol, dan
• Disabunkan dengan etanolik KOH pada suhu ruang 18 jam
 Ekstraksi
• Pipet 3mL sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung sentrifus 15 mL dan
ditambahkan 2 mL air
• Ekstrak dengan 7 mL heksan-dietileter(85:15)
• Ulangi ekstraksi sebanyak 2 kali
• Masukkan sampel terekstrak ke dalam tabung volumetrk 25 mL dengan heksan.
• Tambahkan sebanyak 1 mL heksadekan +hexan dan diencerkan ke dalam tabung dan
sentrifus dan uapkan dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 mL heptan
Parameter kromatografi
• Kolom: 15 cm x 4.5 mm dipadati dengan 3 mm silika (Apex µm silika)
• Fasa mobil: isokratik, heptane dan isopropanol (1-5%)
• Deteksi: UV 340 nm
• Flow rate:1-2 ml/menit
Vitamin D
• Disebut juga dengan vitamin anti rakhitis
• Vit. D adalah senyawa yang stabil sehingga tidak rusak oleh
pemasakan makanan, penyimpanan atau penanganan pasca panen
• Sumber yang mengandung vitamin D : minyak ikan, keju, telur, dan
lain-lain
• Vitamin D dapat larut dalam minyak & lemak,
alkohol, dan propilen-glikol
• Vitamin D dapat dipengaruhi oleh cahaya serta
bersifat thermolabil
• Vitamin D memiliki spektrum serapan kharakteristik
maximum pada 265 nm
• Metoda utama analisis kadar vitamin D adalah
secara bioassay
Struktur Vitamin D
Analisis Vitamin D
1. Uji Vitamin D dengan Pemanasan menggunakan
Hidrogen Peroksida
Prinsip: Umumnya vitamin D stabil terhadap
pemanasan, asam dan oksigen. Vitamin D secara
lambat didestruksi bila lingkungannya alkalis,
terutama bila terdapat udara dan cahaya.
Pemanasan dengan hidrogen peroksida tidak
merusak vitamin D tetapi vitamin A akan rusak.
Prosedur Uji Identifikasi Vitamin D
Analisa vitamin D dengan antimoni
triklorida
• Vit D2 + D3 dengan antimoni-trikhlorida dlm
khloroform akan berwarna orange-kuning yang
segera mencapai intensitas serapan maximum
pada 500 nm
• Tachysterol memiliki sifat serupa, namun sterol
lain serta vit. A tidak memiliki sifat seperti itu .
Prosedur Analisa
• Dimasukkan 2 ml larutan yang diuji dalam tabung spektrometer
dan ditambah 4 ml larutan jenuh Antimoni-trikhlorida dalam
khloroform bebas air
• Ditunggu 10-15 menit dan serapannya dibaca pada 500 nm
• Kadar vitamin D dapat dihitung dengan persamaan kurva
standar .
Analisa vitamin D dengan
pereaksi gliserol dikhlorohidrin
• Vitamin D2 + D3 bereaksi dengan gliserol
dikhlorohidrin, dengan adanya asetil-khlorida atau
halida-asam lainnya
• Vitamin D2 dengan cepat membentuk warna
kuning, yang kemudian berubah hijau dlm 1
menit dan mencapai maximum dalam 15 menit,
serta akan stabil selama beberapa jam dengan
serapan maximum pada 625 nm
• Dengan ergosterol segera muncul warna pink pucat
yang berubah menjadi orange/ jingga dalam 15-20
menit dan kemudian menjadi hijau-fluoresen
• Dengan 7-dehidrokholesterol tidak nampak warna
pd beberapa menit pertama kmd muncul warna pink
pucat yang akan makin intensif dalam 24 jam
• Dengan kholesterol tidak muncul warna
• Reaksi tersebut dapat membedakan antara vitamin
D2 dari ergosterol dan 7-dehidro-kholesterol; dan
juga membedakan antara ergosterol dengan 7-
dehidrokholesterol
•
 KCKT
Jenis sampel: Vitamin D3 dalam jus jeruk
Penyiapan sampel: sampel diekstraksi dengan etil
eter petroleum eter. Sampel ditambah dengan
standart internal vitamin D2, ditambah vitamin C
sebagai antoksidan dan diekstraksi
Kolom: kolom fase normal Inertsil
Fase gerak: Asetonitril-metanol (40:60) selama 20
menit
Detektor: UV-DAD 262 nm
Spektrofotometri

• Vitamin D2 dan D3 menunjukkan spectra serapan uv yang identik,

dengan panjang gelombang maksimal 265 nm.
• Nilai ε dalam metanol atau heksan adalah 18000 M-1cm-1
• Kisaran batas deteksi yang dilaporkan dalam kolom adalah antara 1-
10 ng
Vitamin E
• Disebut juga vitamin antisterilitas
• Sumber yang mengandung vitamin E : ikan, ayam,
kecambah, ragi, dan sebagainya
• Kelompok vitamin E terdiri dari -, -, -, dan -
tokoferol dan beberapa esternya, semisal ester asetat dan
allofanat
Struktur Vitamin E
Analisis Vitamin E

Kromatografi
(KCKT) Selimetri Kolorimeteri
 Kromatografi KCKT
Prinsip :
• Untuk produk makanan umum : sampel disaponifikasi
dengan reflux,diestrak dengan heksan dan diinjeksi
kedalam fase normal kolom HPLC yang disambungkan
pada detektor fluoresesnsi
• Untuk margarin dan minyak nabati : sampel dilarutkan
dalam heksan, MgSO4 ditambahkan untuk mengganti air
kemudian difilter dan diuji dengan HPLC
• Untuk minyak : dilarutkan dalam heksan dan diinjeksi
secara langsung ke dalam kolom HPLC
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
(HPLC)
Untuk produk makanan umum
1.Tambahkan 10 mL pirogallol 6% kesampel, campurkan dan aliri
dengan N2
2.Panaskan pada suhu 70°C .
3.Sonikasi selama 5 menit, didinginkan pada suhu ruang dan
tambahkan NaCl dan air
4.Ekstrak dengna heksana sebanyak 3 kali
5.Tambahkan 0,5 g MgSO4 dan homogenkan
6.Saringlh dan encerkan sampai volume dengan heksan dan injeksi
20µl
 Margarin dan minyak nabati
1.Tambahkan 40 mL heksan kedalam 10 g sampel dan homogenkan
2.Tambahkan 3 g MgSO4 dan campur, biarkan 2 jam .
3.Saring dan encerkan sampai volume dengan heksan dan injeksi 20µl
Metode Serimetri
Metode ini berdasarkan atas sifat mereduksi tokoferol setelah
tokoferol asetat dihidrolisis dengan asam. Tokoferol tidak stabil dalam
larutan basa
Metode Kolorimetri
Dalam AOAC (1995), penetapan kadar vitamin E dalam makanan baik
dalam bentuk kering mauun basah dilakukan secara kolorimetri.
Alfa0tokoferol diekstraksi dari sampel dengan pelarut organik. Residu
lemak disabunkan, alfa-tokoferol diisolasi dengan kromatografi lapis
tipis, dan ditetapkan kadarnya secara kolometri
 Vitamin K
 Vitamin k digolongkan sebagai senyawa kimia : quinone
 Sumber yang mengandung vitamin K : susu, kuning telur,
sayuran segar

• Untuk analisis vitamin K dalam susu formula, prosedur

Rose-Gottlieb telah dimodifikasi dengan mengganti
perlakuan amonia/etanol dengan etanol yang diasamkan.

• Vitamin K dari sayuran,buah-buahan,serelia,daging dan

ikan telah diekstraksi dengan menggerus samel dalam
mortar hingga diperoleh granul halus sebelum di ekstraksi
dengan aseton. Setelah penambahan air dan heksan ke
ekstrak aseton ,maka vitamin K akan terpartisi semuanya di
lapisan atas (heksan), sementara senyawa-senyawa polar
berada di lapisan aseton / air
Struktur Vitamin K
Analisa Vitamin K
• Metoda analisis kuantitatif berdasar pada interaksi 2,4-
dinitro-fenilhidrazin dengan 2-metil-1,4-naftoquinon
dng adanya ammonia alkoholis yang membentuk warna
biru s/d biru-hijau .
• Metoda lainnya didasarkan pada reduksi kata-litik
larutan quinon dalam butil alkohol dengan indikator
fenolsafranin. Hasil hidroquinon kemudian ditambah
larutan Na-2,6-dikhloro- benzeneon-indofenol dalam
butil alkohol berlebihan, yang bebas udara. Menurunnya
intersitas warna proporsional dengan quinon awal yang
ada.
Vitamin C
Vitamin C atau yang biasa disebut Asam karbonat adalah salah satu
jenis vitamin yang larut dalam air. Vitamin ini paling tidak bisa stabil
(mudah teroksidasi). Serta vitamin C rusak karena reaksi enzim
askorbat-oksidase, labil pada suhu tinggi dan stabil pada pH asam
namun tidak pada pH netal dan alkali.
• Ascorbic acid Dehydroascorbic acid

Vitamin C = ascorbic acid + dehydroascorbic acid

 Analisa Vitamin C
Metode Instrumen Metode Non Instrumen

Spektofoto
Iodimetri
metri

2,6-
Spektrofluo dikllorofeno
rometri lindofel
(DCIP)
 Metode Iodimetri
Dasar metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat.
Metode iodimetri (titrasi langsung dengan larutan baku
ioodium 0,1 N) dapat digunakan terhadapa asam
askorbat murni atau larutannya.

Prinsip :
Yodium sebagai oksidator mengoksidasi vitamin
C, kelebihan yodium akan segera terdeteksi
dengan indicator amilum yang dalam suasana basa
berwarna biru muda.
 Prosedur
• Timbang 100-300 gram sampel padat
• Hancurkan dalam blender sampai diperoleh slurry
• Timbang 10-30 g slurry masukkan ke dalam labu takar
100 ml
• Tambahkan aquades sampai tanda
• Saring dengan kertas saring atau disentrifuse untuk
memisahkan filtratnya
• Ambil 5-25 ml filtrate dengan pipet
• Masukkan ke dalam erlenmeter 125 ml
• Tambahkan 2 ml larutan amilum 1% (soluble starch) dan
tambahkan 20 ml aquades
• Kemudian titrasi dengan 0,01 N standar yodium
• T.A.T ditandai dengan terbentuknya warna biru muda
Perhitungan:
• 1 ml 0,01 N yodium= 0,88 mg asam askorbat
 Metode 2,6-diklorofenolindofenol
(DCIP)

Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DICP) ini berdasarkan atas sifat

mereduksi asam askorbat terhadap zat warna 2,6-dilorofenolindofenol.
Asam askorbat akan mereduksi indicator warna 2,6-diklorofenol-
indofenol membentuk larutan yang tidak berwarna. Pada titik akhir
titrasi, kelebihan zat warna yang tidak mereduksi akan berwarna
merah muda dalam larutan asam.
Metode Kolorimetri
Asam askorbat dengan 4-metoksi-2-nitroanilin yang
telah didiazotasi membentuk senyawa yang berwarna
biru.

Metode Spektofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral
menunjukkan absorbansi maksimum pada
264 nm dengan nilai E1%= 579. Panjang
gelombang maksimum ini akan bergeser
oleh adanya asam mineral.
Metode Spektrofluorometri
Suatu metode spektrofluorometri untuk menentukan kadar vitamin C
yang mendasar pada reaksi yang dikatalisis oleh hemoglobin telah
dikembangkan.
Metode spektrofluorometri lain untuk analisis kuantitatif vitamin
adalah berdasarkan pada reaksi antara asam askorbat (AA) dengan
metilen biru (MB).
 Vitamin B
• 8 vitamin yang larut dalam air dan memilki peran
penting dalam metabolisme sel
• Daftar jenis vitamin B
1. B1 (tiamin)
2. B2 (riboflavin)
3. B3 (niasin , termasuk asam nikotinat)
4. B5 (asam pantotenat)
5. B6 (piridoksin)
6. B7 (dikenal juga vitamin H(biotin)
7. B9 (dikenal sebagai vitamin M dan vitamin
B-c (asam folat))
8. B12 (kobolamin)
Vitamin B1 (Thiamin)
• Berbentuk kristal putih bersifat higroskopis
• Berbau ragi, titik leleh 246-250 C
• BM 337.26
• Mudah larut dalam air
• Membantu sel tubuh mengubah karbohidrat menjadi
energi
• Berperan penting bagi organ jantung, otot dan sistem
saraf agar berfungsi dengan baik
 Metode Analisa Vitamin B1 (Thiamin)

I. Metode spektrofluorometri
II. Metode kolorimetri
III. Metode alkalimetri
IV. Metode argentomeri
V. Metdode gravimetri
VI. Kromatografi
Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara
Spektrofluorometri:
1.Penyiapan kolom kromatografi
2.Penyiapan larutan baku Tiamin HCL
3.Penyiapan sampel (ekstraksi)
4.Hidrolisis dengan enzim
5.Pemurnian
6.Oksidasi Tiamin menjadi Tiokrom
Penentuan thiamin dengan Kolorimetri
PRINSIP :
Thiamin + garam reinecke  endapan
Endapan + aseton  larut  diukur kadarnya pada λ 525 nm

*diperlukan standar thiamin

Kromatografi
• Kromatografi dengan deteksi UV-Vis dan fluoresensi
merupakan metode yang paling umum digunakan untuk
analisis vitamin B1 dalam bahan makanan.
• tiamin tidak bersifat fluoresen,akan tetapi vitamin ini
dan ester fosfatnya dapat direaksikan dengan kalium
heksasianoferat atau disebut juga dengan kalium
ferisianida,untuk menghasilkan senyawa tiokrom yang
bersesuaian yang menunjukan fluoresensi biru yang
kuat
• penggunaan tiokrom sebagai produk oksidasi tiamin
yang spesifik dan sangat berfluorosensi telah digunaka
secara rutin
Prosedur ekstraksi untuk analisis tiamin dengan
kromatografi
• Untuk pengujian vitamin total, ekstraksi harus membebaskan
tiamin dari matrik sampel yang kompleks dan menghidrolisis
esternya. Ekstraksi semacam ini melibatkan hidrolisis asam dan
enzim mengikuti AOAC
• The European Union Measurement and Testing Program Telah
mempublikasikan prosedur ekstraksi yang optimal dengan cara :
1.autoklav-kan sejumlah 0,2 – 5,0 g sampel dalam HCL 0,1 N
selama 30 menit pada suhu 121 °C
2.Atur pH alikuot 4,0 dengan bufer natrium asetat4,0 M (Ph 6,1)
3.Tambahkan 100 mg takadiastase tiap g sampel
4.Inkubasikan pada suhu 37 °C sampai 45 °C
5.Didinginkan, disaring dan sentrifus
 Penentuan thiamin dengan fluorometer

PRINSIP :
• oksidasi thiamin menjadi thiokrom (turunan thiamin yang dapat
berpendar dengan sinar UV)
• Bila senyawa yg dapat berfluoresen lain dapat dipisahkan, maka
tingkat fluoresensi thiamin akan proporsional dng kadarnya
• REAGENSIA : kalium ferrisianida 1% baru
Metode analisis vitamin B1, engan fluoremetri
melibatkan tahapan-tahapan sebagai berikut:

1.Hidrolisis asam
2.Hidrolisis enzimatis
3.Pembersihan (clean up) ekstrak
4.Pembentukan tiokrom
Metode Argentometri
Adanya klorida dalam tiamin hidroksida dapat ditetapkan secara
argentometric dengan menggunakan metode Volhard. Pada penetapan
dengan metode Volhard suasananya harus asam sebab jika suasananya
basa akan terjadi reaksi antara perak nitrat dengan basa membentuk
Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan membentuk endapan Ag2O,
akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi dengan sampel tetapi juga
bereaksi dengan basa.
Metode Gravimetri

Tiamin dalam tablet vitamin B1 dan dalam injeksi dapat ditetapkan secara
gravimetric dengan cara mengendapkan larutan tiamin menggunakan asam
silikowolframat.
PRINSIP :
Thiamin + garam reinecke  endapan  dikeringkan  ditimbang

*hanya dapat dilakukan jika sampel mengandung banyak thiamin (>50 mg)
*jika kurang, lebih baik menggunakan fluorometer atau kolorimeter
VITAMIN B2 (RIBOFLAVIN)
 Bentuk kristal jarum oranye-kuning
 Kurang larut dalam air (11 mg/100 ml)
 Dalam bentuk kristal bersifat stabil
 Dalam bentuk larutan, mudah rusak, terutama
dalam suasana alkalis dan oleh cahaya nampak
maupun sinar UV  analisa dilakukan di ruang
gelap
 Riboflavin relatif stabil terhadap panas
Penentuan Vitamin B2 (Riboflavin)

Metode Spektrofluorometri

Metode Spektofotometri
 Metode Spektrofluorometri
1.Fluorometri langsung
• Prosedur manual. AOAC Official Method 970.65 merupakan metode utama yang
digunakan untuk analisis kandungan riboflavin dalam bahan makanan.
• Metode ini mengukur riboflavin total setelah hidrolisis asam FMN dan FAD menjadi
riboflavin bebas
• Hidrolisis disempurnakan dengan autoklav menggunakan HCL 0,1 N selam 30 menit
• Protein dipisahkan dengan mengatur pH 4,5 dan menyaring atau mensentrifusnya untuk
menjernihkan ekstrak
• pH selanjutnya ditingkan kan secara bertahap sampai pH 6,8 untuk mengecek bahwa
tidak ada pengendapan lanjut yang terjadi
• Prosedur AOAC mencatata bahwa penambahaan natrium hidrosulfit lebih dari 20 mg
tiap tabung dapat mengurangi bahan-bahan berfluoresensi yang mengganggu,yang
dapat menimbulkan ketidakakuratan hasil uji
Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang
bebas dari senyawa bewarna yang menggunakan atau senyawa
penganggu lain dan mengandung riboflavin lebih besar dari 0,1%.

Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang

tidak mengandung senyawa berfluoresensi atau senyawa harus
dilakukan secepat mungkin karena riboflavin terurai oleh sinar
ultraviolet. Beberapa senyawa pengganggu dapat dioksidasi dengan
penambahan kalium permanganat, kemudian kelebihan pemanganat
dapat dihilangkan dengan penambahan hydrogen peroksida.
• Riboflavin dapat diperoleh dng penyerapan menggunakan fuller’s
earth dari extrak hati segar atau extrak lain yg mengandung
laktoflavin dlm larutan netral atau asam kuat.
• Adsorpsi umumnya selesai dalam 10 menit.
• Selanjutnya dilakukan elusi dengan larutan dietilamina 10-15% atau
lart NaOH 0.2% .
• Kadar vit. B2 dapat dianalisis secara fluorimetrik.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

• Teknik ekstraksi standar yang sesuai untuk kromatografi dan dapat

diaplikasikan untuk semu jenis bahan makanan apapun adalah
dengan mengubah flavin terikat menjadi riboflavin dengan cara
melakukan autoklav sampel dengan asam mineral encer , diikuti
dengan digesti enzimatis pada pH optimum

• Kromatografi mampu memisahkan FMN dan riboflavin, oleh karena

itu estimasi total vitamin B2 dengan teknik ini tergantung pada
perubahan FMN menjadi riboflavin.
Metode Spektofotometri
Larutan riboflavin dalam dapar pH 4,0 menunjukkan absorban
simaksimum (λ maks) pada 444 nm dengan E1%320. Cara ini digunakan
untuk menetapkan kemurnian ribloflavin atau untuk penetapan
riboflavin dengan kadar lebih besar dari 90%. Penetapan riboflavin
dilakukan dengan cara terindung dari cahaya.
Metoda Cepat Analisis Riboflavin dalam Susu

10ml susu dlm 125ml erlenmeyer ditambah 25ml 0.1N HCl. Gojog dan
panaskan dlm autoclave 120oC selama 30 menit
Dinginkan dan atur pH dng 1N NaOH menjadi pH 6.0 (jangan lebih karena
akan tidak stabil)
Asamkan kembali dng 1N HCl sampai pH 4.5 kmd pindahkan kedlm labu ukur
100ml, encerkan sampai tanda dng aquades, dan saring dng kertas Whatman
no.42
Ambil filtrat jernihnya, baca transmitannya pada 440-400nm (riboflavin
berfluoresensi pd λ tsb)
Buat kurva standar transmitansi lart standar riboflavin murni dng kadar 0.1 –
0.5 g/ml dg perlakuan sama dng di atas.
VITAMIN B6 (PIRIDOKSIN

• Piridoksin berupa bubuk tak berwarna dan berasa pahit

• Piridoksin mudah larut dalam air, alkohol, dan aseton; bersifat
stabil dalam asam, basa, dan panas, namun terpengaruh oleh
cahaya
• Dengan asam-asam mineral (misal HCl) akan membentuk
garam
• Piridoksin-HCl berbentuk bubuk putih, bersifat larut dalam air
dan alkohol, serta berasa asin
• Pyridoxin dapat diestimasi dng metoda kimiawi, mikrobiologi dan
bioassay.
• Pyridoxin memiliki gugus fungsional fenolat, sehingga dapat
membentuk reaksi warna yang dapat dimanfaatkan dalam tehnik
analisis.
Vitamin B2 (Riboflavin)
• Berbentuk kristal putih bersifat higroskopis
• Berbau ragi, titik leleh 246-250 C
• BM 337.26
• Mudah larut dalam air
• Membantu sel tubuh mengubah karbohidrat menjadi energi
• Berperan penting bagi organ jantung, otot dan sistem saraf
agar berfungsi dengan baik
 Analisa Vitamin B2
• Metode spektrofluoro-metri
Riboflavin dapat diperoleh dengan penyerapan menggunakan fuller’s
earth dari extrak hati segar atau extrak lain yg mengandung laktoflavin
dlm larutan netral atau asam kuat. Adsorpsi umumnya selesai dalam 10
menit.
Selanjutnya dilakukan elusi dengan larutan dietilamina 10-15% atau lart
NaOH 0.2% .
Kadar vit. B2 dapat dianalisis secara fluorimetrik.
Penentuan Vitamin B6

Spektofotometri Kolorimetri

Titrasi Bebas Air Kromatografi

 Analisis vitamin b6
Fluorometri
• Metode fluometri melibatkan hidrolisi asam terhadap sampel-
sampel bahan makana, pemurnian secara kromatografi,serta
perubahan vitamin-vitamin yang terelusi menjadi asam 4-
piridoksat, dan perlakuan asam pada zat antara untuk
membentuk turunan lakton
• Metode fluorometri telah digunakan untuk analisis vitamin b6
pada kedelai .
• Ekstraksi sampel melibatkan :
• - sampel diautoklav dengan adanya asam sulfat
• - dibufer sampai pH 4,5 lalu didigesti dengan Claradiastase,
• - diencerkan ,dan disaring
Prinsip analisa piridoksin (metoda Hochberg,
Melnick, and Oser)
• Piridoksin yang terikat dibebaskan melalui hidrolisis dengan HCl
dan pemanasan
• Setelah diasamkan (pH 3,0), piridoksin bebas diserap oleh
absorben Lloyd
• Setelah pencucian dengan HCl, dilakukan elusi terhadap
piridoksin yang terserap dalam absorben, dengan larutan NaOH
• Eluat dijernihkan dengan isopropil alkohol
• Supernatan diambil 3 kali dan diperlakukan sebagai berikut :
a. Supernatan saja
b. Supernatan + larutan standar piridoksin (sebagai standar internal)
c. Supernatan + asam borat (asam borat mengubah piridoksin
menjadi INAKTIF)
• Setiap tabung ditambah reagen Gibb (mengan-dung 2,6-
dikhloro quinon khloroimida)
• Piridoksin + 2,6-dikhloro-quinon-khloro-imida  terbentuk kompleks
berwarna biru
Prosedur analisa
a. Reagen Gibb (larutan A)
100mg 2,6-dikhloroquinonkhloroimida dilarut-kan dalam 250ml
isopropanol, dimasukkan dalam botol gelap & disimpan di
almari pendingin. Bila selama penyimpanan timbul warna pink
 reagen harus dibuang (tdk murni)

b. Larutan ammonia-HCl (larutan B)

160g NH4Cl + 700ml aquades + 160ml NH4OH jenuh,
kemudian diencerkan sampai 1000ml
Metode Spektofotometri
Pada daerah ultraviolet, piridoksin, piridokamin, dan piridoksal
menunjukan daerah penyerapan yang karakteristik walaupun tidak ada
maksimum untuk ketiganya. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan
buffer pH 6,75 dapat ditetapkan pada panjang gelombang 325 nm.
Pada panjang gelombang ini, piridoksin dan piridoksal menunjukkan
absorbansi maksimum pada 316 nm. Kurva absorbsi piridoksin sendiri
berubah dengan berubahnya pH larutan. Larutan piridoksin dalam
asam klorida 0,1 N menunjukkan absorbansi maksimum pada 291 nm.
Metode Kolorimetri
Metode ini pertama kali diketengahkan oleh Seudi yang mendasarkan
pada reaksi fenol dengan 2,6-dikloro-p-benzokuin-4-klorimina dengan
menghasilkan warna biru yang dapat disari dengan pelarut organik.
Reaksi ini merupakan reaksi umum untuk senyawa fenol yang
berkedudukan para terhadap gugus hidroksi lfenol tidak tersubtitusi.
Metode ini menunjukkan kepekaan yang rendah jika sampel
mengandung kurang dari 0,1 mg dan peruraian dapat terjadi sebelum
warna berkembang mencapai maksimum.
Metode Titrasi Bebas Air
Piridoksin hidroklorida dapat
ditetapkan secara titrasi bebas air Metode Kromatografi
setelah ditambah raksa (II) asetat.
Kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT) dengan
detektor fluorometri telah
digunakan secara luas untuk
analisis kuantitatif vitamin
B6 dalam ayam dan bahan
lainnya.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

• Kromatografi dengan elusi isoratik telah digunakan untuk analisis bahan

makanan . Metode ini memberikan pemisahan vitamin-vitanin B6
(PN,PL,PM) dalam 12 menit
ANALISIS VITAMIN B12
(KOBALAMIN) SECARA MIKROBIOLOGIS
Prinsip analisa (Apriyantono, 1989)
• Vitamin B12 dipisahkan dari makanan memakai larutan buffer asetat
pH 4,5
• Kobalamin (tidak stabil) ditambah Na-sianida  terbentuk
sianokobalamin yang stabil
• Kadar vitamin ditetapkan dengan menumbuh-kan Lactobacillus
leichmanii (bakteri tersebut membutuhkan vitamin B12 untuk
pertumbuhannya sehingga pada kondisi terkontrol pertumbuhannya
spesifik)
Vitamin B12
Penentuan Vitamin B12

Metode Kromatografi

Metode Spektofotometri
Metode Spektofotometri
• metode ini digunakan untuk produk-produk farmasetik dengan
konsentrasi tinggi
•Diukur pada panjang gelmbang 362 nm
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Pengembangan metode kromatograf ini untuk analisis vitamin B12
dibatasi oleh sensitifitas dan selektifitasnya yang rendah. Oleh karena
itu, kebanyakan prosedur melibatkan tahapan clean up dan
pemekatan untuk menguji vitamin ini dalam konsentrasi rendah
• Detektor spektrometer massa mampu menawarkan sensitifitas dan
selektifitas yang lebih baik dibandingkan detektor UV
Contoh analisis vitamin B12 dengan KCKT

Sampel: produk-produk makanan

Penyiapan sampel:
vitamin B12 bebas menjadi digesti dengan α-amilase
vitamin B12 total menjadi digesti dengan α-amilase,pepsin
Clean up: kolom imunifitas
Kolom: C18
Fase gerak: gradien. Asam trifluoroasetat 0.025% dalam air ph(2.6)- asetonitril.
Kecepatan alir=0.25 ml/menit
Deteksi: UV 361 nm
Vitamin B9 (Asam Folat)
• Asam folat merupakan sekelompok senyawa yg bersumber pada
dedaunan hijau, memiliki karakter seperti vitamin, yg memiliki
aktivitas antianemia
ANALISIS FOLAT
SECARA MIKROBIOLOGIS
• Folat merupakan nama umum, termasuk asam folat. Folat bersifat
labil terhadap oksidasi, sinar, panas, dan leaching saat makanan
diolah
• Analisa dilakukan secara mikrobiologis
• Prinsip analisa
- Folat sampel diekstrak dalam buffer pada 100oC
- Ekstrak diperlakukan dengan -amilase, protease, dan conjugase
- Respons pertumbuhan L. rhamnosus diukur dengan %
transmitansi
Critical Point
• Perlu kehati-hatian tingkat tinggi untuk mencegah folat teroksidasi
dan mengalami degradasi fotokimia.
• Agen pereduksi (asam askorbat, -mercapto ethanol, and
dithiothreitol) efektif untuk mencegah oksidasi.
ANALISIS BIOTIN (vitamin H / B7)
• Biotin dianggap sebagai kelompok vitamin B kompleks
• Merupakan kristal yang larut dalam air dan alkohol
• Bersifat stabil dalam suasana asam, alkalis, oleh cahaya dan
suhu normal
• Tidak stabil pada suhu tinggi maupun oleh senyawa oksidator
• Analisa kadar biotin : metoda mikrobio-logis dan bioassay
 Terima Kasih
apakah ada pertanyaaan :D