IMUNOASAI

(PEMERIKSAAN SEROLOGI)

Departemen Patologi Klinik

Univ. Wijaya Kusuma Surabaya
dr. Febtarini R, Sp.PK
 Serologi
• Suatu ilmu yang mempelajari cara mendeteksi suatu infeksi di dalam
serum pasien, misalnya adanya antibodi (Ab) spesifik terhadap
mikroba tertentu

• Uji serologi didasarkan atas ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan
antibodi (Ab)
 Ag yang telah diketahui akan bereaksi/berikatan dengan Ab yang
belum diketahui di dalam serum
 Sebaliknya Ab yang telah diketahui dapat digunakan untuk
mendeteksi Ag dalam serum pasien

• Reaksi Ag-Ab dapat diamati atas terbentuknya presipitasi, aglutinasi

atau dengan bantuan label tertentu, misalnya label radioaktif, label
enzims dll
2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu
ANTIBODI

Fc

-S-S-
-S-S- -S-S-
Fab
Regio
variabel

L H L H
Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi
L = Light Chain H = Heavy chain
Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai
a. Spesifitas dari Ab
Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak
kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur
mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya
tergantung dari :
- profil spesifitas Ab-nya &
- kemurnian Ag-nya

Ab yang amat spesifik = Ab dengan binding

sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan
struktur molekul yang unik/tertentu saja.
 Antigen I Antibodi I
X x X x
Y y Y y
Z z Z z

Z
Antigen II Antibodi II
Y
V v X x
W w w
X x v

Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu

epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi
yang mungkin terbentuk
b. Ukuran kuantitas Ab

Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam

serum.
- Kualitatif pos. /neg.  adanya perubahan fisik dari
bahan pemeriksaan. (+/-)
- Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran
serum secara progresif  Titer (1/10, 1/100, 1/640)
- Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan
beberapa sera baku  kurva baku. Akurasi dicek
dengan serum kontrol. (100 pg/mL, 2 μL/mL)
Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.
OD

0 5 g/dl
Kadar Bahan
Gambar 3. Kurva baku uji ELISA
FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI

1 Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara

penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin
dll
2 Elektrolit dan pH
3 Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap
a. Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuai
b. Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll)
4 Mekanisme Daya Tahan Nonspesifik
Bahan yg normal/abnormal terdapat dalam
sekret/cairan tubuh.
5 Rasio Ag dan Ab
prozone postzone
Prozone, Equivalent zone, Post zone,
Tak ada presipitasi Presipitasi Tak ada presipitasi

Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan

implikasinya
= ANTIBODI
= ANTIGEN
BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI

MACAM BAHAN : serum , plasma, css

Usahakan jangan hemolisis
Inaktivasi C  56°C, 30 menit

Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat

sendiri dari strain lokal, lebih baik yang
multistrains.
IMUNOASAI

KADAR
KADAR BAHAN
BAHAN

RENDAH ( ng/ml, pg/ml ) TINGGI (mg/ml,ug/ml)

Hasil reaksi tak tampak Hasil reaksi DAPAT

DILIHAT
 Presipitasi/RID
FAKTOR PENGUAT (LABEL)
 UJI AGLUTINASI

IF RIA EIA ICA

Homogen Heterogen
= ELISA
 JENIS IMUNOASAI
Ada 2 jenis imunoasai.
I. IMUNOASAI TAK BERLABEL
II. IMUNOASAI BERLABEL

I. IMUNOASAI TAK BERLABEL

 UJI PRESIPTASI
 UJI AGLUTINASI
 UJI FIKSASI KOMPLEMEN
 UJI NETRALISASI TOKSIN
UJI PRESIPITASI

Ag yang
larut Antibodi

Presipitasi adalah bila Ag + Ab dalam

bentuk larutan menghasilkan suatu
agregasi yang terlihat dengan mata PRESIPITASI

Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi

 Ag.

Inkubasi

Serum dengan Ab Presipitasi

Gambar 6. Uji presipitasi tabung

 Sera baku
1
Tes serum

8 2

3
7 Antisera
dalam agar
Tes serum
4
6
Tes serum
Tes serum 5
Tes serum
GAMBAR 10. R.I.D
APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI
Uji Tabung : VDRL - Makro
Uji Slide : VDRL - Mikro

Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP

RID : Penentuan kelas Ig

 Imunoelektroforesis

• Migrasi protein serum di dalam

gel dan apabila bertemu dengan
antigen yang sesuai akan terjadi
presipitasi
UJI AGLUTINASI
Ag. pada permukaan sel Aglutinasi
Ab.

Tak larut

Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi

 + -
Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide
 Susp.
Ag

Inkubasi

Aglutinasi

Serum ( Ab )

Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung

 AGLUTINASI TAK LANGSUNG

A. AGLUTINASI PASIF

B. Ab TAK LENGKAP

a. Ab Monovalen

b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )

 + +
Partikel Ab dalam serum
Ag Larut Partikel disalut Ag

Partikel:
Seldarah merah
Lateks
Carbo adsorben

(Ko-aglutinasi)
Aglutinasi
Gambar 14. Uji aglutinasi pasif
APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI

 Uji Slide (lempeng): uji Widal slide

 Uji Tabung : uji Widal tabung
 Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler

III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh

IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN

Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung,
Hanya Anti – Ig diganti C  Lisis Imun
 UJI LISIS IMUN & FIKSASI
KOMPLEMEN

• Komplemen di dalam plasma sebanyak 3

mg/ml dalam bentuk inaktif

• Jika bertemu dengan kompleks Ag-Ab

komplemen menjadi aktif (melalui jalur
klasik), dan menghasilkan berbagai kaskade
aktivasi, misalnya lisis dari sel target
Prinsip Uji
Komplemen
 Uji Lisis Imun
Komplemen

Ab
Ag pada Sensitized cell
permukaan sel

= Komplemen

Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun

A.

Komplemen Komplemen
Tak ada
C C Lisis
Serum Terikat
dgn. Ab
Sensitized SDM Uji Positif
B.
Komplemen Komplemen

Serum
C C Lisis
tanpa Ab Bebas
Uji Negatif
Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen
An example of the complement fixation test.

Fig. 17.14 Complement fixation test.

II. IMUNOASAI BERLABEL
1. CAT FLUORESENS: IF
2. RADIOISOTOP: RIA
3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA )
A. EIA HOMOGEN
B. EIA HETEROGEN (ELISA)
C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE
4. EMAS KOLOIDAL:
ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)
1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF)
Mikroskop
Fluoresens
CUCI
Ab diket berlabel cat
fluoresens
Ag tak diket.
Fiksasi pada
slide

Kompleks Ag-Ab
Berfluoresensi
Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens
langsung (direct).
 Cuci AHG dilabel
Fluorescein

Ab tak
Ag diket. diket Kompleks Ag – Ab Cuci
tak tampak

Mikroskop
Fluoresens
Kompleks Ag – Ab – AHG
berfluoresensi
Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens
tak langsung (indirect).
An example of direct and indirect immunofluorescence
testing.

Fig. 17.15 Immunofluorescence testing

KELEMAHAN UJI IF
 Peralatan canggih dan mahal

 Perlu tenaga terlatih

 Per hari maks 25 slide / analis

 Sukar dibuat otomatis

 Pelaksanaan agak kompleks & membosankan

2. Uji RIA
R
R R
R
R
R RR
R

Radioisotop : 3H Thymidin, 131 I

Radiation
Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA
Counter
R = label
 R R
R R
R
R
R Cuci

RADIATION
COUNTER

Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif

KELEMAHAN UJI RIA

 Butuh alat mahal & tenaga terlatih

 Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )

 Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.

 Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus

 ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• Prinsip dasar Elisa adalah pemakaian enzim
untuk mendeteksi adanya ikatan Antigen-
Antibodi (Ag:Ab)

• Enzim akan merubah (mengkonversi)

substrate yang tidak berwarna (kromogen)
menjadi produk berwarna yang
mengindikasikan adanya ikatan Ag:Ab
 Ab Anti –Ig berlabel
enzim SUBSTRAT
Ag pada berkromogen
Fase padat

PRODUK
berwarna
Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA langsung
 Direct ELISA
• Untuk mendeteksi Ab

Enzim: AK (Alkalin fosfatase) atau HRPO (Horse Raddish

Peroxidase)

Substrate : TMB (Tetra methyl benzidine) atau NPP (p-

nitrophenyl phosphate)
 Ab II berlabel
Ag
enzim
SUBSTRAT
Ab I pada berkromogen
Fase padat
PRODUK
berwarna
Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung)
double antibody sandwich ELISA
 Indirect ELISA (Sandwich ELISA)

• Untuk mendeteksi adanya antigen (Ag)

 ELISA

Antibodi dilapiskan pada dasar sumuran

Bahan yg diperiksa ditambahkan → terjadi

reaksi Ag-Ab

Ditambahkan anti-antibodi ( Mo anti-Ab)

berlabel BIOTIN (biotinylated)

Ditambahkan streptavidin berlabel enzim

Ditambah kromogen → Warna, diukur secara

kolorimetri memakai Elisa-reader
Uji ELISA
Ag dlm serum

SUBSTRAT
BERKROMOGEN

Ag berlabel
Ab pada
enzim PRODUK
Fase padat
berwarna

Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif

An example of the indirect and capture ELISA methods.

Fig. 17.16 Methods of ELISA testing.

CONTOH APLIKASI KLINIS
SEROLOGI TEST

1. Sifilis
2. Demam tifoid
3. Tuberkulosis
 SIFILIS
Paling Ideal ; Ig. M- ELISA ( Dx, keaktivan,
mengikuti hasil Rx )

Di Indonesia ; TPHA  Dx
VDRL  Aktivitas &
mengikuti hasil Rx
Neurosyphilis : VDRL  Dx
Jumlah sel Keaktivan &
Protein Total mengikuti hasil Rx
 UJI SEROLOGI DEMAM
TIFOID
1. TES WIDAL
2. TES IgM Salmonella
3. ELISA
4. BIAKAN / KULTUR DARAH
UJI WIDAL (AGLUTINASI)
Dari hasil 1X tes belum dapat ditarik kesimpulan yang berarti.
Perlu ulangan setelah 5-7 hari

Harga normal tes Widal tabung.

Aglutinin O : 1/160 Aglutinin PA : 1/80
Aglutinin H : 1/160 Aglutinin PB : 1/320
Vaksinasi; aglutinin H dapat dipertahankan beberapa
tahun,

Antibiotika ; dapat memperlambat kenaikan titer

 INDIKASI SEROLOGI TB
• INDIKASI:
1. BTA DAHAK NEGATIF
2. TB EKSTRAPULMONUM
3. TB ANAK
4. SPESIFISITAS:
– TGT JENIS ANTIGEN (REAKSI SILANG)
5. KONTROVERSI KARENA:
– Kurang pemahaman patogenesis
– Bersikukuh pada Postulat Koch
 Lateral flow immuno assay
LATERAL FLOW IMMUNOASSAY

62
 CONTOH PARAMETER
PEMERIKSAAN SEROLOGI
CRP = Protein C reaktif
- Suatu alfa globulin yg ada di serum pd inflamasi
- Suatu reaktan fase akut, indikator non spesifik
inflamasi yg berhbgn dg imunologi
- Tidak dipengaruhi oleh anemia, kehamilan,
hiperglobulinemia
- serial, utk indeks aktivitas penyakit dan
monitoring terapi
 FAKTOR
REMATOID
Antibodi
Rheumatoid
factor

•Poliklonal antibodi
•Antibodi IgG dalam kelas IgM
•Kadar IgM terbesar, bisa dideteksi oleh alat
•Antibodi terhadap determinan antigenik pada fragmen Fc immunoglobulin

Sumber: PKB PK,2002 64

TERIMA KASIH ATAS
PERHATIAN ANDA