SIFAT FISIKO KIMIA

ISOLASI & IDENTIFIKASI

  SENYAWA FENOL

FISIKO KIMIA UMUM

Bentuk Reaksi
KARAKTER Kelarutan
senyawa kimia

kurang larut air, Bentuk dialam : Mudah

Umumnya teroksidasi (jika
kelarutan bertambah bebas atau terikat
Padatan tak murni)
jika gugus hidroksil dg gula (glikosida)
berwarna Bersifat asam
makin banyak, atau sebagai
(murni) lemah.
Kelarutan dalam ester/eter Bereaksi dg basa
pelarut organic polar  mbtk fenolat,
umumnya tinggi. kelarutan??
. Berpengaruh pada Dengan logam 
Kelarutan?? komplek
 Efek ikatan hidrogen

Senyawa polifenol
 mampu membentuk ikatan hydrogen O
H
Interaksi intramolekular dan
intramolekular O
 Membentuk komplek dengan logam

Interaksi Intramolekuler : 2-hidroksiasetofenon

(o-dihidroksi atau orto terhadap carbonil)
• menurunkan reaktifitas ggs hidroksi
• Menurunkan kemampuan membentuk eter
atau ester
• Mengurangi kelarutan pada alkohol
• terjadi pembentukkan cincin
Interaksi Intermolekul :
- meningkatkan titik lebur
- menurunkan kelarutan
- menyulitkan dalam pemurnian
senyawa
- Senyawa cenderung berupa OH
padatan pd suhu kamar

OH
HO OH HO
resorsinol phloroglusinol
Pembentukan komplek dengan logam :
- Penting : di alam ataupun di laboratorium
- Logam yang terlibat biasanya Al, Mg, Fe membentuk
senyawa berwarna tergantung dari pola substitusinya
 Sifat Asam Senyawa Fenol
• Umumnya fenol bersifat asam.
• Dibandingkan dengan alcohol alifatis tak tersubstitusi gugus OH
fenolik lebih asam karena anion yang terbentuk setelah pelepasan
proton relative stabil karena adanya resonansi.
• Anion yang terbentuk disebut anion fenolat
• Nilai pKa fenol 10 diantara pKa asam karboksilat pKa 4-5 dan
alkohol alifatik pKa 16-19

Reaksi dengan basa (Na bikarbonat atau Na Karbonat) fenolat (larut air)
 Sifat Planaritas senyawa Fenol
• Struktur 3 dimensi molekul penting karena berpengaruh pada
reaktifitas kimia dan aktivitas biologi. Ikatan rangkap antara atom
karbon dapat mempengaruhi suatu molekul planar atau non planar.
• Sudut antara orbital sp3 adalah 109,5 °, alkana (rantai atom karbon
yang terhubung melalui ikatan tunggal) tidak terletak pada bidang
datar. Namun dalam inti aromatis terdapat sistem terkonjugasi, maka
cincin benzena adalah planar.

Sp3
Sp3

flavone flavanonol
ASAM FENOLAT
• mengandung ggs –OH dan gugus karboksilat 
sehingga bersifat seperti fenol (lebih asam)
• kelarutan dalam air rendah
• Dapat dijumpai dalam bentuk :
• bebas (misal asam-p hidroksi benzoat, asam
vanilat, protokatekuat, vanilat).
kelarutan ..? Sulit larut air
• terikat dengan gula (asam galat sebagai
gallotannin) dalam ikatan ester
kelarutan …? Mudah larut air
Isolasi senyawa fenol dan asam fenolat
Asam Fenolat O
Fenol
OH
C
OH

OH
OH
o-kresol Asam salisilat

• Ekstraksi dengan air (dalam larutan asam), MeOH, EtOH, aceton,

etilacetat.
• Sebelum pemisahan dan identifikasi  umumnya dilakukan
hidrolisis.
Cara: Jaringan (segar/kering) atau ekstrak pekat dengan
asam/basa.
• Hidrolisis asam : HCl 2N, dipanaskan 30 menit
• Hidrolisis basa : NaOH 2N, suhu kamar 4 jam
(hati-hati terjadi oksidasi)
• Fenol yang terbebas dari hidrolisis diekstraksi dg eter  dilakukan
deteksi dengan pereaksi untuk golongan fenol.
EKSRAKSI CAIR-CAIR
• Ekstraksi fenol dan asam fenolat dari bahan tanaman
dipengaruhi oleh sifat kimianya (misalnya, polaritas,
keasaman, ikatan hidrogen).
• Fenol dan asam fenolat umumnya tersimpan di
vakuola , dan dapat diekstraksi dengan pelarut
organik atau alkohol.
• Pelarut umum untuk ekstraksi : air panas, etanol,
aseton, dietil eter, kloroform, etil asetat, dan metanol
(atau berair metanol).
 DETEKSI / IDENTIFIKASI FENOL

Kromatografi Lapis Tipis :

pengembangan 2 arah :
• fase diam silika gel
fase gerak (Fg)1 : Asam asetat-CHCl3 (1:9),
Fg2 : Etil Asetat -benzena (9:11)
• Fase diam selulosa
Fg 1 : benzena-metanol-asam asetat (45:8:4), Fg 2 : asam asetat 6%

Deteksi :
• Fenol & as.fenolat mengabsorbsi UV pendek fluoresensi254nm
• Pereaksi :
o Folin –Ciocalteu (camp phosphotungstic dan phosphomolybdic)
 biru (fenol inti katekol, hidrokuinon dll)
o Vanilin – asam (HCl atau H2SO4)
o Pereaksi Gibbs, diikuti dg amonia  warna bervariasi,
membedakan asam vanilat (mm) dg asam isovanilat (biru)
 Reaksi dengan Pereaksi Folin-Ciocalteu

Pereaksi mengoksidasi sampel dan pereaksi komplek asam

phosphomol/phosphotungstat mengalami reduksi membentuk
kromogen yang berwarna biru dengan Panjang gelombang maks
725 nm
 O
Pereaksi vanillin-asam
C
H

Asam : H

- HCl
HO OCH3
- Asam sulfat OH Vanilin

- Asam phosporat HO
H
-H2O
H3CO
HO

H3CO
HO

Terjadi reaksi kondensasi sehingga terjadi perpanjangan kromofor

Pereaksi Gibbs
(2,6-dibromokuinon-kloroimida 2% dlm CHCl3)

Reaksi : dg fenol pada posisi p- yang tak tersubstitusi

Fenilpropan (C6C3)
asam sinamat, kumarin, fenilpropene
Asam sinamat
sering dijumpai dalam bentuk ester :
• Dipisahkan dengan hidrolisis basa lemah, jika dg asam (panas)
terjadi dekarboksilasi.
• Hasil hidrolisis diekstraksi dg eter atau etil asetat  ekstrak
diuapkan
• Fenilpropene
seperti : eugenol, anetol, miristisin,
sering terdapat sebagai senyawa yang mudah
menguap, sulit larut air dan sering bersama dengan
terpen yang atsiri.
Kumarin :
Hidroksikumarin :
• Dalam bentuk bebas sulit larut air
• sering dijumpai dalam bentuk glikosida larut air
• pembukaan cincin lakton mjd natrium kumarinatlarut air.
Furanokumarin :
• larut lipid atau pelarut organik (eter), kadang sbg glikosida
Deteksi Kumarin :
o O HO O
• Kertas saring ditetesi
KOH atau NaOH  NaOH 10%
dikeringkan, Kumarin cis-asam sinamat
kemudian sampel UV 366nm
diteteskan 
diamati pada
UV366 O

flourescensi HIJAU cis-asam sinamat

OH
KUNING
 HIDROKSI SINAMAT DAN KUMARIN
• Umumnya isolasi didahului dengan hidrolisis asam atau
basa
• Hidroksi sinamat dan kumarin dapat diekstraksi dengan
eter atau etil asetat
• Ekstrak dicuci, diuapkan hngga kering
• Deteksi
• KLT fase diam selulosa 2 arah  terjadi pemisahan
Fg 1 : benzene – HAc – air (6 – 7 – 3)
Fg 2 : asam asetat 15% dalam air
• KKt (1 arah)
Fg : - n-butanol – HAc – air ( 4 : 1: 5 )
- air
- HAc 10% (untuk kumarin)
 FENILPROPANOID
Asam hidroksisinamat & hidroksikumarin
metode mirip fenol sederhana.
• ekstrak tumbuhan dihidrolisis dg asam/basa, dan diekstraksi dg
eter/etilasetat.
• sisa penguapan dipisahkan dg KKt atau KLT, dideteksi : dibawah uv
 flouresens , jika diuapi NH3 warna makin kuat
• Asam sinamat, fase gerak :
• BAA = n-BuOH-HOAc-H2O (4:1:5, lapisan atas)
• BN = n-BuOH-NH4OH 2M (1:1, lapisan atas)
• BEA = n-BuOH-EtOH-H2O (4:1:2,2)
p- dan o-Kumarat, kafeat, ferulat, sinaptat, metoksisinamat dll.
• Hidroksikumarin, fase gerak :
• BAA, HOAc 10%
Aglikon : kumarin, umbeliferon, eskulentin dll
Glikosida : eskulin, skopolin dll
Senyawa kuinon
Senyawa dengan struktur 1,4 kuinon  di alam sebagai produk
akhioksidasi.
Atom karbon dengan struktur kuinon dapat berasal dari beberapa
kemungkinan :
• asam asetat (kuinon poliketida)
• asam mevalonat (kuinon terpen)
• asam sikimat

Dialam berupa :
Senyawa bebas
Terikat dengan gula : glikosida
 TAHAPAN PEMISAHAN SENYAWA FENOL
Ekstraksi senyawa fenol dari bahan tanaman :
1. Langkah awal
Sampel digiling/diserbuk :
• untuk meningkatkan luas permukaan
• memungkinkan kontak lebih baik dgn pelarut
• membantu pencampuran sampel untuk memastikan bahwa
bagian diekstrak merupakan perwakilan dari seluruh sampel
• senyawa fenolik terjadi sebagai glikosida atau ester.

2. pemurnian dari ekstrak kasar

metode yang umum diterapkan : ekstraksi cair-cair, kromatografi
kolom, ekstraksi fase padat (SPE)
 
PENETAPAN KADAR
FENOL TOTAL
 Metode Folin and Ciocalteau
• Untuk menentukan fenol total (termasuk antosianin, tanin hidrolisa dan tanin tak
terhidrolisa). Dapat untuk menentukan kandungan tirosin dan triptophan dalam protein
hidrolisat
• Prinsip reaksi : terjadi reduksi campuran reagen phosphotungstat dan phosphomolybdat
oleh gugus fenol produk warna biru, intensitas warna dapat dikuantifikasi
berdasarkan serapan yang terbaca pada spectrophotometer pada 750nm.
• Merupakan metode spectrophotometric  memerlukan kurva standar yg
menghubungkan antara kadar dan serapan. Umumnya digunakan asam
gallat atau klorogenat.
• Konsentrasi senyawa fenol yang dilaporkan relatif terhadap asam gallat
atau klorogenat.

Hasil tergantung kondisi sample yg disebabkan variasi fenol

(mempengaruhi efisiensi reduksi reagen)
 Dibandingkan dengan metode lain hasil bisa berbeda
PRINSIP METODE
• Pereaksi Folin-Ciocalteu berisi larutan kompleks ion polimerik dari
asam fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat. (Pereaksi
terbuat dari air, natrium tungstat, natrium molibdat, asam fosfat,
asam klorida, litium sulfat, dan bromin)
• Prinsip metode Folin-Ciocalteu adalah :
• Oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi mengoksidasi menjadi
fenolat (garam alkali), dan terjadi reduksi asam heteropoli
menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten (Mo-W).
• Selama reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi
dengan pereaksi Folin-Ciocalteu, membentuk kompleks
fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru (dengan
struktur yang belum diketahui), dapat dideteksi dg
spektrofotometer.
• Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan
konsentrasi ion fenolat yang terbentuk,
Prosedur Folin and Ciocalteau
1. Dilute an aliquot of the sample (9 parts water to 1 part sample). This
is not necessary if the phenol content is low.
2. Add 2 ml of freshly prepared 2% (w/v) sod. carbonate (anhyd) to 0.1
ml of the sample extract (diluted if necessary).
3. Mix vigorously on a Vortex mixer. Let stand for 5 min.
4. While mixing on a Vortex add 0.1 ml of a 1:1 dilution of Folin-
Ciocalteu reagent. This reagent can be purchased from chemical
supply companies,such as Merck. If the reagent has a green color, it is
no longer good and should be replaced.
6. Allow the sample to stand for a minimum of 30 minutes, but not
more than one hour.
7. Read the absorbance in a spectrophotometer at 750 nm.

Metode serupa  Folin-Denis

Reagent berisi campuran sodium tungstate dan asam (phospho)
molibdat dalam asam phosphat
PENETAPAN
KADAR TANIN
 Penetapan Tanin

• Tanin terkondensasi dan tanin terhidrolisis  variasi kimiawi tinggi,

ikut berpengaruh terhadap efisiensi metode.
• Adanya kandungan non tanin (favonoid) dapat memberikan hasil yang
bias.

Penetapan Tanin Terkondensasi :

1. The butanol-HCl assay
2. The vanillin assay

Penetapan Tanin Terhidrolisis

1. PK Gallotanin
 Rhodanine assay
2. PK Ellagitanin
The NaNO2/HCl assay
Penetapan Kadar (PK) Tanin Terkondensasi :
1. Metode : Butanol-HCl assay
Prinsip PK :
dengan Metode colorimetri yang melibatkan pemutusan
oksidasidatif protoantocyanidin menjadi antocyanidin.

Prosedur :
• 5 ml ekstrak air ditambahkan 5 ml larutan asam yang
mengandung ferro sulfat (77 mg of FeSO4.7H2O dissolved in
500 mL of 2:3 HCl/n-butanol)  dipanaskan di water bath
95°C for 15 min.
• The absorbance is read at 530 nm.
• Konsentrasi prothoanthocyanidin dinyatakan sebagai
cyanidin equivalents (used for the standard curve).
• The molecular extinction coefficient εmol that can be used to
convert the absorbance values to a concentration is equal to
34700 L mol-1cm-1.
Penetapan Tanin Terkondensasi :
2. The vanillin assay
Metode colorimetric berdasar reaksi dengan vanillin pada suasana
asam
Prinsip :
• A 2-mL aliquot of a freshly prepared solution of vanillin (1 g/100
mL) in 70% sulfuric acid is added to 1 mL of aqueous plant extract.
• The mixture is incubated in a 20°C-waterbath and after exactly 15
min. the absorbance at 500 nm read.
• The concentration of proanthocyanidins is expressed as (+)-
catechin equivalents (used for the standard curve).

monomeric flavonols, such as catechin and epicatechin,

can interfere
Pereaksi vanillin-asam
O

C
Asam : H

- HCl
H
- Asam sulfat
- Asam phosporatHO OCH3

OH Vanilin

HO
H
-H2O
H3CO
HO

H3CO
HO
 Penetapan Gallotanin (tanin terhidrolisa):

Rhodanine assay
Prinsip :
• Rhodanine (2-thio-4-ketothiazolidine)
reacts with the vicinal hydroxyl groups of
gallic acid to produce a red complex that
can be detected spectrophotometrically at
520 nm.
• This reaction is specific for gallic acid, and
can thus be used for the detection of
gallotannins.
• This requires acid hydrolysis of the
gallotannins before the reaction with
rhodanine.
Penetapan Ellagitanin

The NaNO2/HCl assay

Prinsip :
Didasarkan pada reaksi pembentukan electophile NO+, yang dapat
bereksi dengan asam ellagat pada 2 sisi melalui reaksi substitusi
(4.3) atau adisi (4.4 ) yang akhirnya membentuk quinine
oxime (4.5) yang pada kondisi basa menghasikan warna merah
(4.6).

Keuntungan Metode NaNO2/HCl :

• sensitif terhadap asam ellagitannin
• tidak sensitif terhadap senyawa fenol lain seperti asam gallat,
phloroglucinol, hidroksisinamat. Dengan senyawa fenol lain
membentuk warna kuning  tidak mengganggu deteksi dengan
spektrofotometri.
,
Deteksi lignin dan asam fenolat
unit penyusun lignin : - p-coumaryl alkohol,
- coniferil alkohol,
- sinapyl alkohol
Prinsip deteksi :
dilakukan hidrolisis asam diikuti oksidasi nitrobenzen
membentuk aldehide dan produk yang berkaitan (asam fenolat) :
- p-hidroksi benzoat,
- asam vanilat,
- asam siringat

deteksi :
dengan KLT pereaksi gibbs  bercak berwarna.
• Nitrobenzene oxidation degrades the phenylpropane
structure from a C6-C3 unit to a C6-C1 unit. After
incubation the soluble fraction is acidified and
extracted with ether.
• The degradation products can be separated on an
HPLC column to determine the lignin composition.
Alternatively, gas chromatography (GC) or gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS) can be
used.
The degradation
products :
–p-hydroxy
benzaldehyde (4.13),
vanillin (4.14), and
syringaldehyde (4.15),
and the corresponding
acids p-hydroxybenzoic
acid (4.16), vanillic acid
(4.17), and syringic acid
(4.18)
 Lignin-Acetylbromide

Prinsip :
Menggunakan
acetyl bromide
(4.10) untuk :
• asetilasi gugus
hidroksil bebas
dalam lignin dan
• mensubstitusi gugus
hidroksi bebas pada
α-carbon dengan
bromine .

Lignin tersubstitsi
larut asam dan
konsentrasinya
dapat ditetapkan
dengan
spectropho-tometer
pada 280 nm.