11/04/2016

KELOMPOK 1

AMELIA MARIANA
MANURUNG
APTRIS MEIDI
ASPUJI YULIA PUTRI MPLC
CINDY CLAUDIA
EDO RINALDI (KROMATOGRAFITEKANANMEDIUM)
ELSI LOVIA
HARMITA SURYANTI
IKA NOFRIANTI
IRMA KOMALA SARI
IRDATI
IZON PERMANA
IRAWANTI

MPLC

1
 11/04/2016

MEDIUM PRESSURE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (MPLC)
MPLC mengatasi
MPLC merupakan salah kekurangan dari low
satu teknikkromatografi pressure liquid
kolom preparatif. chromatography (LPLC)
Pemisahan dibawah yaitu terbatasnya
tekanan menggunakan pemasukan sampel
ukuran partikel
kecilmendukung
kemungkinan dan MPLC diperkenalkan pada
peningkatan penggunaan tahun 1970an sebagai
beragam dari fase diam teknik yang efisien untuk
memisahkan senyawa
organik.

Secara garis besar, prinsip kerja antara LPLC, MPLC dan HPLC sama.
Perbedaan ketiganya didasarkan pada tekanan yang digunakan.

2
 11/04/2016

INSTRUMENTASI MPLC

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak yang digunakan harus bersih dan inert.

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan

gas) sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
di pompa dan detektor sehingga akan mengganggu analisis.

3
 11/04/2016

Pompa

Kriteria untuk memilih pompa MPLC meliputi :

• Rentang laju alir yang digunakan
• Keberadaan peredam getaran
• Pengaturan tekanan dan gradien.
Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase
gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan dan bebas dari
gangguan.
Ada 2 jenis pompa pada MPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.

Tempat Injeksi Kolom

• Sampel disuntikkan secara • Kolom merupakan
langsung ke dalam fase gerak tempat terjadinya
yang mengalir di bawah tekanan pemisahan.
menuju kolom dengan • Hal-hal yang harus diperhatian
menggunakan alat penyuntik. untuk mengoptimalkan pemisahan
antara lain jumlah sampel yang
akan dimurnikan, kemasan kolom,
panjang kolom dan diameter
kolom.
• Peningkatan diameter kolom
dapat memungkinkan
penginjeksian sampel dalam
jumlah besar, tetapi ukuran
partikel yang digunakan harus
kecil.
• Selain itu, meningkatnya
panjang kolom akan
menghasilkan resolusi yang lebih
tinggi.

4
 11/04/2016

Detektor dan Rekorder Fraction Collector

• Pemantauan pemisahan • Pengumpulan fraksi dapat
MPLC dapat dilakukan dilakukan dengan
dengan TLC dari fraksi yang menghubungkan fraction
telah dikumpulkan. collector kepada kolom
• Detektor yang dapat ataupun detektor.
digunakan pada metode MPLC • Volume fraksi yang
adalah detektor LC-UV. dikumpulkan sangat bergantung
• Detektor LC-UV adalah pada diameter kolom dan laju
detektor yang dirancang khusus alir.
untuk pemisahan preparatif
dengan laju alir hingga 500
mL per menit.
• Detektor lalu dihubungkan
dengan rekorder untuk
memungkinkan visualisasi dari
pemisahan kromatografi.

FASE
DIAM
Pemilihan fase diam merupakan parameter
penting yang mempengaruhi kualitas
pemisahan. Faktor yang harus dipertimbangkan
ketika memilih fase diam antara lain: Ukuran
partikel, Panjang kolom, Tekanan, Jenis sampel
dan Biaya
Fase diam yang paling sering digunakan karena
harganya yang cukup efisien adalah silika gel.
Selain menguntungkan dalam segi biaya, silika
gel juga memiliki keuntungan seperti banyaknya
pelarut yang dapat digunakan sebagai eluen,
mudah menguap dari fraksi dan elusi dengan
laju alir yang tinggi. Kelemahan utama dari
silika
gel ini adalah kemungkinan terjadinya adsorpsi.

Ukuran partikel fase diam yang tersedia di pasaran sangat

bervariasi. Ukuran partikel kecil 5 – 10 m biasa digunakan
untuk tujuan analisis sedangkan untuk tujuan preparatif
ukuran fase diam yang digunakan dimulai dari 15 m dan
pemisahan optimal terjadi pada fase diam dengan ukuran 20
m.

5
 11/04/2016

METODE PENGEMASAN KOLOM

Dry Filling Slurry

Metho
d

Dry Filling
• Pada metode kering,
kolom diisi dengan fase
diam kering diikuti
dengan penambahan
fase gerak hingga kolom
benar-benar basah.
Pengemasan kolom
dilakukan
dibawah
tekanan nitrogen
sehingga didapatkan
kepadatan yang tinggi.

6
 11/04/2016

Slurry Method
• Pada metode basah,
bubur (slurry) disiapkan
dengan
cara
mencampurkan eluen
pada serbuk fase diam
dan dimasukkan ke
dalam kolom secara
hati-hati agar tidak
terbentuk gelembung
udara.

PENYIAPAN KOLOM
Sebelum diinjeksikan sampel, sangat dianjurkan untuk melakukan pengujian
pemisahan
terhadap campuran standard.
Campuran standar yang biasa digunakan untuk pengujian kolom silika gel
adalah phthalic acid dimethyl-diethyl dan dibutyl esters.
Sedangkan campuran standard benzene dan naphthalene dapat digunakan
untuk kolom fase terbalik.
Biasanya fase diam dapat diregenerasi setelah dilakukan pemisahan kromatografi.
Silika gel dapat dicuci dengan metanol, etil asetat dan n-heksana secara
berturut- turut.
Namun setelah waktu tertentu, fase diam harus diganti dan kolom perlu dikemas
ulang.

7
 11/04/2016

PEMILIHAN ELUEN ATAU FASE GERAK

Pemilihan eluen juga merupakan faktor penting dalam pengembangan
dan
optimalisasi pemisahan MPLC.
Dua metode yang biasa digunakan untuk pemilihan pelarut adalah
1). Optimalisasi dengan TLC atau 2). Transposisi dari kondisi HPLC kepada
MPLC.
TLC dapat mempercepat pemilihan pelarut untuk MPLC dimana pelarut
Berdasarkan polaritas fase gerak dan fase diam yang digunakan dikenal dua
yang digunakan
fase dalam sistem pada
MPLC TLC
yaitudialihkan pada
fase normal teknik
(fase diamMPLC.
lebih polar daripada fase
gerak) dan fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak).
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-
ubah selama elusi). Elusi bergradien ini digunakan untuk meningkatkan resolusi
campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas
yang luas.

PERSIAPAN SAMPEL
Beberapa kriteria yang harus dipertimbangkan sebelum sampel diinjeksi antara
lain: Persiapan sampel, Jumlah dan volume sampel dan kelarutan sampel
Eluen yang digunakan harus dapat melarutkan sampel. Konsentrasi dari sampel
juga amat penting dimana jika konsentrasi sampel terlalu besar maka viskositas
larutan akan meningkat. Viskositas yang tinggi dapat menyebabkan terjadinya
tailing pada puncak kromatografi.
Proporsi campuran sampel umumnya terdiri dari 1 bagian sampel dicampur
dengan
2 – 5 bagian fase diam. Sampel disiapkan kemudian diinjeksikan dan eluen
dilewatkan menuju kolom untuk terjadi pemisahan.

8
 11/04/2016

FLASH
CHROMATOGRAPHY

9
 11/04/2016

Kromatografi flash pada dasarnya

Flash Chromatography
diperkenalkan pada tahun 1978
oleh Still, Khan dan Mitra
mendorong tekanan udara
menengah
1.5 – 2.0 bar sehingga
terjadi pemisahan yang
cepat.

Prinsipnya, eluen akan didorong

oleh tekanan udara ke dalam
kolom kaca pendek (15 cm) dengan
diameter dalam kolom yang besar Viskositas larutan juga tidak boleh
(1 – 5 cm). terlalu tinggi agar laju alir tidak
Kolom kaca dikemas dengan rendah (laju alir sekitar 100
adsorbent dengan ukuran partikel mL/ menit).
yang telah ditentukan. Fase diam
yang paling sering digunakan adalah
silika gel
dengan ukuran 40 – 63 m.

INSTRUMENTASI
Apparatus kromatografi flash terdiri
dari tiga komponen utama. Kolom
kaca (A) dengan panjang 30 - 40
cm. Tekanan udara dimasukkan
melalui T- way stopcock (B) B29
atau B34. Pelarut dimasukkan ke
dalam kolom dengan corong kaca
(C) sehingga pelarut tidak akan
mengganggu permukaan bahan
kemasan.

10
 11/04/2016

FASE DIAM
Pemilihan adsorbent yang tepat penting untuk mendapatkan pemisahan yang baik. Fase
diam yang paling sering dipakai dalam kromatografi kolom adalah silika. Silika gel
(SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah dua adsorben yang umum digunakan dalam
kromatografi kolom. Adsorben ini dijual dalam ukuran yang bervariasi. Ukuran partikel
adsorben mempengaruhi laju alir pelarut ke dalam kolom. Ukuran partikel yang kecil
biasanya digunakan untuk Flash Chromatography sedangkan ukuran partikel yang
besar biasanya digunakan untuk kromatografi gravitasi. Jumlah silika gel yang
digunakan tergantung pada perbedaan Rf dari senyawa yang akan dipisahkan dan
jumlah sampel. Biasanya rasio yang digunakan adalah 30:1 (silika gel : sampel).
Beberapa jenis adsorben yang digunakan dalam flash chromatography:
Silika
Florisil
Alumina
Silika
fase
terbalik

11
 11/04/2016

SOLVEN
Flash chromatography biasanya menggunakan campuran dua pelarut yang bersifat polar dan non polar.
Senyawa harus mempunyai nilai Rf TLC sekitar 0.15 – 0.20 pada sistem pelarut yang kita pilih. Sistem
pelarut biner dengan salah satu pelarut memiliki polaritas tinggi sering digunakan dalam teknik flash
chromatography.
Satu-komponen sistem pelarut
Hidrokarbon: pentana, petroleum eter, heksana
Ether dan diklorometana (polaritas sangat
mirip)
Etil asetat
Dua komponen sistem pelarut
Eter / Petroleum Ether, Ether / Hexane, dan Ether /
Pentane Etil Asetat / Hexane
Methanol / Dichloromethane

12
 11/04/2016

PENGEMASAN
KOLOM
Pengemasan kolom silika gel, Metode basah (slurry method) lebih
mudah untuk dikerjakan dan memberikan kemasan yang lebih baik
daripada metode dry filling. Hal ini terutama berlaku untuk kolom
dengan diameter lebar (> 6 cm). Pertama-tama, diletakkan cotton
wool dibagian bawah kolom untuk mencegah keluarnya silika gel
dari kolom. Lalu diberi pasir kurang lebih 0.5 inchi. Setelah itu
dimasukkan silika gel menggunakan corong. Selanjutnya dibagian
atasnya diberi lagi pasir. Setelah itu, pelarut dimasukkan.
Pembuatan bubur silika gel-pelarut yang sangat encer
membantu meminimalkan pembentukan gelembung udara. Pelarut
yang cukup (sekitar 5 cm) ditempatkan di kolom (dengan kran
tertutup) lalu dimasukkan bubur silika. Setelah beberapa cm
dari bubur telah dimasukkan, stopcock kolom dibuka
untuk mempercepat sedimentasi. Tekanan dapat diterapkan
pada kolom menggunakan pompa. Bagian lain dari bubur
ditambahkan dengan cara yang sama sampai ketinggian yang
diinginkan.

PERSIAPAN SAMPEL
Sampel dilarutkan dalam pelarut. Lalu dimasukkan ke dalam kolom. Hati-hati
ketika memasukkan agar permukaan bagian atas silika gel tidak rusak. Lalu
stopcock kolom dibuka dan tekanan diatur sehingga pelarut akan mendorong sampel
dan meresap ke dalam silika gel. Selanjutnya bilas kolom dengan sedikit
mungkin pelarut untuk memastikan tidak ada sampel yang tertinggal di dinding
kolom. Kumpulkan fraksi sampel Fraksi-fraksi yang didapat lalu di uji dengan TLC
untuk melihat kandungan senyawa yang didapat. Lebih baik menggunakan 1 plat
silika untuk semua fraksi agar terlihat jelas perbedaan masing-masing fraksi. Lalu
fraksi yang memiliki spot yang sama disatukan dan sampel tersebut lalu dipekatkan
menggunakan rotary evaporator. Selain identifikasi menggunakan TLC, dapat juga
digunakan detektor UV dan ELSD (Evaporating Light Scattering Detector)

13
 11/04/2016

ISOLASI PRODUK ALAM DENGAN MPLC

DAN FLASH CHROMATOGRAPHY

Claeson et al (1993)
mengisolasi dua
seskuiterpen dan tiga
diarylheptanoid sebagai
antiinflamasi dari Rimpang
Curcuma xanthorrhiza
Roxb. (Zingiberaceae)

14
 11/04/2016

Bahan tanaman diperkolasi pada suhu kamar secara

berurutan dengan heksana kloroform dan metanol. Ekstrak
heksana dan kloroform menunjukkan aktivitas antiinflamasi
yang signifikan terhadap tikus edema yang diinduksi
karagenan. Ekstrak metanol tidak menunjukkan adanya
aktivitas antiinflamasi. Selanjutnya ekstrak heksana dipisahkan
dengan kromatografi flash dengan tiga gradien berturut-turut
menjadi tujuh fraksi (A – G). Fraksi C dan D merupakan fraksi
aktif bioassay. Hasil 1H-NMR dan TLC dari fraksi D, E dan F
praktis identik sehingga fraksi E dan F tidak perlu dilakukan
uji bioassay. Fraksi C lalu dipisahkan lebih lanjut dengan
kromatografi flash dengan gradien heksana – etil asetat
sehingga diperoleh lima fraksi (I – V). Fraksi I dipisahkan lebih
lanjut dengan MPLC (kombinasi elusi gradien dan isokratik
heksana – etil asetat) dan menghasilkan sesquiterpen
germakron (Gambar 8.1) dan Curzerene (Gambar 8.2). Fraksi II
direkristalisasi setelah penguapan pelarut dan menghasilkan
Diarylheptanoid bentuk jarum berwarna kuning (Gambar 8.3).
Senyawa 3 ini menunjukkan aktivitas antiinflamasi yang
signifikan dalam uji bioassay. Fraksi IV dipisahkan lebih lanjut
dengan MPLC dengan gradien heksana – etil asetat yang
selanjutnya direkristalisasi sehingga dihasilkan senyawa 4 dan
5 (Gambar 8.4 dan Gambar 8.5). Kedua senyawa
tersebut menunjukkan aktivitas antiinflamasi yang signifikan.

15
JURNAL MPLC
 PEMBAHASAN JURNAL

Kromatografi cair tekanan sedang (MPLC) adalah salah satu dari berbagai
teknik kromatografi kolom preparatif.
Pemisahan di bawah tekanan memungkinkan penggunaan penopang ukuran
partikel yang lebih kecil dan meningkatkan keragaman fase diam yang dapat
digunakan. MPLC mengatasi satu kelemahan utama dari kromatografi cair
tekanan rendah (LPLC), yaitu pemuatan sampel yang terbatas.

Metode pemisahan ini sekarang secara rutin digunakan di samping atau

dalam kombinasi dengan alat preparatif umum lainnya: kromatografi kolom
terbuka, kromatografi selempang, LPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi
preparatif (HPLC).
Perbedaan antara tekanan rendah, tekanan sedang dan tekanan tinggi LC
didasarkan pada rentang tekanan yang diterapkan dalam teknik ini dan
tumpang tindih seringkali cukup besar.
MPLC memungkinkan pemurnian jumlah senyawa yang besar dan,
tidak seperti kromatografi kolom terbuka dan kromatografi Sash,
pemisahan yang lebih cepat dan lebih baik diperoleh.
Pengemasan material dengan ukuran partikel yang lebih rendah di
bawah tekanan meningkatkan kualitas pemisahan dan terlebih lagi
fase padat dapat digunakan kembali.

Tabel 1 memberikan deskripsi komparatif dari metode yang

berbeda ini. Kesederhanaan dan ketersediaan instrumentasi,
bersama dengan daur ulang bahan pengepakan dan biaya
perawatan yang rendah, berkontribusi pada daya tarik teknik ini.
Rincian lebih lanjut tentang kondisi eksperimental diberikan di
bawah ini.PeralatanRepresentasi skema dari setup MPLC
sederhana ditunjukkan pada Gambar 1.
THANK YOU