Makalah

Dasar-dasar Rekayasa Genetika

Proses Hibridisasi dan Radiografi untuk Analisis Gen

Disusun Oleh :

HELEN SALUDUNG
H31 114 018

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2016

1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas
berkat dan limpahan rahmat-Nyalah sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah
ini dengan baik. Berikut ini penulis mempersembahkan sebuah makalah dengan judul
Proses Hibridisasi dan Radiografi untuk Analisis Gen yang menurut penulis dapat
memberikan manfaat yang besar bagi kita untuk mengetahui aplikasi dari proses
hibridisasi dan radiografi dalam bidang kesehatan.
Melalui kata pengantar ini penulis lebih dulu meminta maaf yang sebesar-
besarnya bila makalah ini masih jauh dari kesempurnaan dan ada kata-kata penulis
yang menyinggung perasaan. Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Sekian dan terima kasih.

Makassar, 27 November 2016

Penulis

2
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL................................................................................................1
KATA PENGANTAR .............................................................................................2
DAFTAR ISI ............................................................................................................3
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................4
1.1 Latar Belakang .............................................................................................4
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................4
1.3 Tujuan .........................................................................................................6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..............................................................................7
2.1 Hibridisasi ....................................................................................................7
2.2 Identifikasi Spesifik Fragmen DNA ............................................................7
2.3 Aplikasi Teknik Hibridisasi .......................................................................12
2.4 Kelebihan dan Kekurangan Teknik Hibridisasi .........................................12
2.5 Autoradiografi ............................................................................................12
2.6 Aplikasi Teknik Autoradiografi .................................................................14
2.7 Kelebihan dan Kekurangan Teknik Autoradiografi ...................................15

BAB III PENUTUP ...........................................................................................16

A. Kesimpulan ................................................................................................16

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................17

3
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pentingnya gen yang merupakan bagian dari genom yang membawa sifat
suatu organisme dalam melakukan riset biologi molekular dan pengembangan
bioteknologi. Usaha untuk memahami ataupun memodifikasi berbagai proses biologi
pada tingkat molekuler, di perlukan gen-gen di dalam proses tersebut. Identifikasi
dan karakterisasi gen seringkali dibutuhkan dalam berbagai percobaan molekuler
antara lain isolasi, kloning dan proses hibridisasi serta radiografi pada gen ataupun
mempelajari ekspresinya.
Gen adalah bagian kromosom atau suatu kesatuan kimia dalam kromosom
yang mengendalikan cirri genetis makhluk hidup. Gen berperan untuk pewarisan
sifat seperti rasa, warna dan bentuk. Gen terdapat dalam kromosomdan menempati
tempat-tempat tertentu yaitu dalam lokus-lokus kromosom. Pada sel eukariotik,
kromosom berada dalam inti sel, kromosom yang mempunyai sifat menyerap warna
sehingga dalam sel yang sedang membelah, kromosom dapat dilihat dengan
menggunakan mikroskop biasa, tetapi untuk mengetahui struktur halusnya harus
menggunakan mikroskop elektron.
Berbagai teknik atau proses yang dilakukan untuk penentuan gen atau DNA
pada makhluk hidup seperti manusia, hewan dan tumbuhan. Salah satu proses yang
dibahas dalam makalah ini adalah proses hibridasi dan radiografi untuk analisis gen
yang akan menentukan bagaimana menanalisis DNA maupun RNA pada tubuh
makhluk hidup.

1.2 Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dari makalah ini yaitu:
1. Bagaimana teknik analisis gen dengan metode hibridisasi dan radiografi?
2. Bagaimana pengaplikasian hibridisasi dan radiografi untuk analisis gen dalam
dunia kesehatan?
3. Apa keuntungan dan kerugian dari proses hibridisasi dan radiografi untuk analisis
gen?

4
 1.3 Tujuan Penulisan
Adapun tujuan penulisan ini adalah:
1. Mengetahui teknik analisis gen dengan metode hibridisasi dan radiografi.
2. Mengetahui pengaplikasian hibridisasi dan radiografi untuk analisis gen dalam
dunia kesehatan.
3. Mengetahui. keuntungan dan kerugian dari proses hibridisasi dan radiografi untuk
analisis gen.

5
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Hibridisasi
Fenomena hibridisasi adalah salah satu dasar dari biologi molekuler modern.
Hibridisasi merupakan kemampuan suatu asam nukleat untai tunggal untuk
membentuk double helix dengan untai tunggal lain dari urutan (sekuens) basa
komplementer. Dengan hibridisasi, fragmen DNA tertentu dapat diidentifikasi dan
dipisahkan dari fragmen lain.

Gambar 1. Hibridisasi Asam Nukleat

Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau
pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau
perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan
dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di
antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini
kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan.
Hibridisasi merupakan teknik yang sangat bermanfaat. Teknik ini sangat
sensitif karena dapat mendeteksi sejumlah kecil probe yang berikatan ke membran
dan selektif karena berdasarkan komplementari urutan DNA sehingga urutan spesifik

6
dapat diidentifikasi. Probe oligonukleotida umumnya ditargetkan untuk urutan
tertentu dalam gen. Probe oligonukleotida yang paling umum mengandung 18-30
basa, tetapi penyintesis saat ini memungkinkan sintesis efisien probe yang
mengandung minimal 100 basa. Probe oligonukleotida dapat cocok dengan sempurna
pada urutan targetnya dan cukup panjang untuk memungkinkan penggunaan kondisi
hibridisasi yang akan mencegah hibridisasi untuk urutan lain yang terkait erat,
sehingga memungkinkan untuk mengidentifikasi dan mendeteksi DNA dengan
sedikit perbedaan dalam urutan di dalam gen yang sangat terjaga.
Seleksi urutan probe oligonukleotida dapat dilakukan secara manual dari
urutan gen yang diketahui menggunakan pedoman berikut:
Panjang probe harus antara 18 dan 50 basa. Probe yang lebih panjang akan
menyebabkan waktu hibridisasi lebih lama dengan hasil sintesis rendah, probe
pendek akan kurang spesifik.
Komposisi basa harus 40-60% G-C. Hibridisasi non spesifik dapat meningkatkan
rasio GC di luar kisaran tersebut.
Memastikan bahwa tidak ada daerah yang saling melengkapi dalam probe yang
hadir. Hal tersebut dapat mengakibatkan pembentukan hairpin struktur yang
akan menghambat hibridisasi untuk target.
Hindari urutan yang mengandung beberapa ruas (lebih dari empat) basa tunggal.
Setelah urutan memenuhi kriteria di atas telah diidentifikasi, komputerisasi
analisis urutan sangat dianjurkan. Urutan probe harus dibandingkan dengan
wilayah urutan atau genom tempat asalnya. Jika kesamaan dengan daerah
nontarget lebih besar dari 70% atau delapan atau lebih basa berturut-turut
ditemukan, maka penyelidikan sekuens tidak boleh dilakukan.
Namun, untuk menentukan kondisi hibridisasi optimal, probe disintesis harus
hibridisasi asam nukleat targt khusus dan spesifik pada rentang kondisi hibridisasi.

2.2 Identifikasi Spesifik Fragmen DNA

2.2.1 Southern Blots
Hibridisasi Southern adalah proses perpasangan antara DNA yang menjadi
sasaran dan DNA pelacak. Langkah pertama adalah dengan menggunakan enzim
retriksi yang diisolasi dari organisme untuk memotong genom DNA. Enzim retriksi

7
yang paling baik digunakan seperti, EcoRI atau HindIII yang dikenal dengan sisi
pemotongan 6-bp. Enzim tersebut akan memproduksi ribuan fragmen dari genom
DNA dengan ukuran rata-rata sekitar 4000 bp.

Gambar 2. Southern Blots

Selanjutnya, fragmen-fragmen tersebut dielektroporasi pada suatu gel agarosa.
Hasilnya, jika pita divisualisasi oleh noda maka akan menjadi lapisan yang kabur
sehingga tidak ada satupun yang dapat dibedakan dengan yang lainnya. Secepatnya,
pelabelan probe akan terhibrid ke pita untuk melihat berapa banyak pita yang
mengandung kode sekuens dari gen yang dibutuhkan.
Edward Southern adalah pionir dari teknik ini, dia mentransfer atau member
noda fragmen DNA dari suatu gel agarosa ke nitroselulosa oleh difusi. Proses ini
disebut Southern Blotting. Saat ini, blotting sering dilakukan dengan elektroforesis
pita DNA keluar dari gel dan menuju ke blot. Sebelum blotting, fragmen DNA
didenaturasi dengan alkali sehingga dihasilkan DNA untai tunggal yang dapat terikat
ke nitroselulosa membentuk Southern blot. Selanjutnya, klon DNA dilabeli dengan
penambahan DNA polimerase sebagai prekursor label DNA. Kemudian probe

8
berlabel akan terdenaturasi dan terhibridisasi ke Southern blot. Dimanapun probe
bertemu suatu sekuens DNA komplementer, itu terhibridisasi membentuk pita
berlabel yang cocok dengan fragmen dari DNA yang berisi gen yang diinginkan.
Sebagai akhir, pita-pita tersebut divisualisasi oleh autoradiografi dengan film sinar x
atau dengan fosfor-imaging.

2.2.2 Northern Blots

Gambar 3. Tahapan Northern Blotting

Nothern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali tahun 1977. Secara
umum teknik ini mirip dengan Southern Blot yang membedakan adalah sampel yang
digunakan yaitu RNA. Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi)
suatu mRNA gen pada organ atau jaringan tertentu seperti daun, bunga, biji, batang,
dan lain sebagainya.

Gambar 4. Sitoplasmik mRNA yang diisolasi dari jaringan tikus dengan cara
elektroforesis dan Northern Blots
Nothern Blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan informasi mengenai

9
identitas, ukuran dan kelimpahan RNA. Prinsip Nothern Blot adalah memisahkan
RNA bedasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran menggunakan probe
hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau sebagian dari urutan
mRNA target.

2.2.3 Immunoblots (Western Blots)

Immunoblots (Western blots) mengikuti pola eksperimental yang sama
dengan Southern blots. Penyelidik molekul elektroforesis dan kemudian memberi
noda pada molekul ke membran dimana molekul dapat siap diidentifikasi.
Immunoblots melibatkan elektroforesis dari protein sebagai ganti asam nukleat.
DNAs pada Southern blots dideteksi dengan hibridisasi oleh pelabelan probe
oligonukleotida atau polinukleotida, namun hibridisasi hanya sesuai untuk asam
nukleat. Sebagai ganti suatu asam nukleat, salah satu yang digunakan yaitu antibodi
(antiserum) spesifik untuk suatu protein khusus. Antibodi terikat dengan protein
target pada blot. Kemudian suatu antibodi label sekunder atau suatu protein berlabel
ikatan IgG seperti protein A, dapat digunakan untuk label pada pita dengan protein
target oleh ikatan antibodi yang siap berikatan.

Gambar 5. Tahapan Immunoblots

Tahapan immunoblot dimulai dengan pemisahan campuran protein oleh SDS-
PAGE. Selanjutnya, protein yang telah dipisahkan diwakili oleh garis putus-putus
dan dihapuskan untuk membran. Blot ini diperiksa dengan antibodi primer spesifik
untuk protein yang diinginkan pada blot. Antibodi kemudian bereaksi dengan salah
satu pita protein (merah). Antibody sekunder berlabel (protein A) digunakan untuk
mendeteksi antibodi primer. Kehadiran antibodi sekunder yang melekat pada
antibodi primer ditandai dengan perubahan warna dari pita merah menjadi ungu.
Akhirnya, pita berlabel dapat dideteksi dengan menggunakan film sinar x atau forfor-
imaging jika berlabel radioaktif.

10
 Protein dapat dideteksi dan diukur dalam campuran kompleks menggunakan
immublot. Protein dielektroforesis, kemudian diblot pada membran dan protein pada
blot tersebut diperiksa dengan antibodi spesifik yang dapat dideteksi dengan antibodi
sekunder berlabel atau protein A.

2.2.4 Hibridisasi In situ

Hibridisasi in situ merupakan hibridisasi probe berlabel untuk seluruh
kromosom dalam menemukan gen atau urutan DNA spesifik lainnya. Jika probe
berlabel fluoresensi, maka teknik ini disebut fluorescence in situ hybridization
(FISH).

Gambar 6. Kromosom dan hibridisasi in situ

Hibridisasi in situ bukan merupakan teknik yang sensitive dan sering kali
hibridisasi yang nonspesifik menghasilkan bintik yang palsu pada autoradiograf.

11
Meskipun demikian beberapa gen telah ditentukan posisinya pada peta sitogenetik
manusia dengan menggunakan prosedur ini.

2.3 Aplikasi Teknik Hibridisasi

Teknik ini memiliki kegunaan besar dalam mendeteksi asam nukleat dalam
lingkungan selulernya. Sangat berguna dalam penelitian dan diagnosis klinis, aplikasi
pentingnya termasuk waktu dan lokasi (diferensial ekspresi gen) dari transkrip
mRNA, lokasi gen kromosom tertentu, mengenali kelainan kromosom dan patologi,
serta diagnosis penyakit genetik. Aplikasi Southern Blot yaitu memberikan
penyelidikan atau analisis untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi
fragmen-fragmen dan mengukur sejumlah relatif dalam contoh berbeda.

2.4 Kekurangan dan Kelebihan Teknik Hibridisasi

a. Kelebihan dari teknik hibridisasi antara lain:
Dapat disuntikkan oleh iontophoresis atau dengan tekanan injeksi.
Labelnya otonom dan diperkuat pada setiap pembelahan sel. Ini merupakan
keuntungan utama teknik ini karena menghilangkan masalah dilusi pada
setiap pembelahan sel.
Jika gen yang sesuai dipilih, produk akan dipertahankan dalam gen.
b. Kekurangan dari teknik hibridisasi antara lain:
Dalam rangka untuk membuat produk ekspresi gen, ada beberapalangkah
reaksi yang kemungkinan akan diperlukan. Label tidak mungkin menahan
fiksasi sehingga bagian beku atau permeabilisasi dari sel-sel berlabel
mungkin sangat diperlukan sebelum reaksi.
Ekspresi gen asing atau virus mungkin tidak seragam di seluruh keturunan sel
yang disuntikkan karena kesulitan dengan transkripsi atau terjemahan. Lokasi
dimana DNA asing dimasukkan ke dalam genom induk tidak dapat
dikendalikan dan dapat menyebabkan pola ekspresi menyimpang atau
diferensiasi.

2.5 Autoradiografi
Autoradiografi adalah teknik yang digunakan untuk menghasilkan gambar
dari distribusi 2D dari zat radioaktif. Dua jenis umum dari metode autoradiografi:

12
 In-vivo autoradiografi, reseptor diberi label dalam jaringan hidup yang utuh
denganpemberian sistemik radioligand. Jaringan akan dihapus, diproses dan
divisualisasikan.
In-vito autoradiografi, potongan jaringan diinkubasi dengan radioligand sehingga
reseptor diberi label di bawah kondisi yang sangat terkendali.
Radiografi umumnya digunakan untuk melihat benda tak tembus pandang,
misalnya bagian dalam tubuh manusia. Gambaran benda yang diambil dengan
radiografi disebut radiograf. Radiografi lazim digunakan pada berbagai bidang,
terutama kedokteran, pengobatan dan idustri.
Radiografi berkaitan dengan suatu perangkat kendali digital tambahan untuk
panel pembangkit sinar-x dan panel akusisi citra radiografi digital. Secara khusus,
suatu perangkat kendali yang berbasis komputer atau mikrokontroller, yang terdiri
dari unit komponen yang dapat digunakan untuk menghidupkan atau mematikan
generator pembagkit sinar-x , unit komponen yang dapat digunakan untuk
mengidentifikasi waktu yang tepat untuk proses proses akusisi citra radiograf oleh
perangkat akusisi citra, unit komponen yang dapat digunakan untuk mengendalikan
motor penggerak penunjang inspeksi, dan unit komponen yang dapat digunakan
untuk memilih antara kamera untuk proses radiografi dengan kamera untuk
pemantauan lingkungan pasien. Pada waktu pemakaiannya, unit-unit komponen ini
dihubungkan dengan komponen-komponen peralatan radiografi fluorokopi yang
telah ada, serta unit-unit pendukung sistem operasional yang sesuai, yang juga telah
ada.

Gambar 7. Prinsip kerja autoradiografi

Prinsip kerja Digital Radiography (DR) atau (DX) pada intinya menangkap
sinar-X tanpa menggunakan film. Sebagai ganti film sinar X, digunakan sebuah
penangkap gambar digital untuk merekam gambar sinar X dan mengubahnya

13
menjadi file digital yang dapat ditampilkan atau dicetak untuk dibaca dan disimpan
sebagai bagian rekam medis pasien, begitu juga pada analisis gen.
Teknik dasar metode autoradiografi adalah sebagai berikut:
Memetakan anatomi lokasi ligan yang diberi label radioaktif untuk
memvisualisasikan dan mengukur reseptor dalam jaringan.
Melacak neutron dengan transportasi aksonal asam amino berlabel radioaktif,
beberapa gula, atau zat transmitter.
Mengukur produksi DNA.

Gambar 8. Autoradiografi-Deteksi menggunakan film

2.6 Aplikasi Teknik Autoradiografi

Teknik autoradiografi dengan menggunakan label radioaktif [18F]
fluoromisonidazole yang merupakan suatu penanda hipoksia dapat mengidentifikasi
letak tumor ganas pada otak. Hipoksia (kekurangan oksigen) pada tumor ganas dapat
mempengaruhi hasil pengobatan anti kanker.

14
2.7 Kelebihan dan Kekurangan Teknik Autoradiografi
a. Kelebihan:
Tidak beracun karena jumlah radioaktif dijaga agar tetap rendah.
Senyawa biasanya terdapat dalam sel yang digunakan.
Penyusunan tetap, tidak memudar
Jika senyawa yang dipilih sesuai maka tidak ada kerusakan.
Sangat baik untuk sel-sel jaringan yang dibiakkan, karena tidak dibutuhkan
sectioning.
b. Kekurangan:
Label hanya tahan fiksasi jika senyawa terikat pada isi sel.
Jika molekul alami digunakan, mungkin akan dipcah oleh metabolisme sel.
Hanya dapat digunakan pada bagian jaringan.
Potensi keterlambatan dalam memperoleh hasil yang dihasilkan oleh
autoradiografi.

15
 BAB III
KESIMPULAN

3.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari makalah ini adalah:
1. Teknik analisis gen dengan metode hibridisasi meliputi dua proses yaitu
denaturasi dan renaturasi. Sementara, teknik analisis untuk autoradiografi yaitu
memetakan anatomi lokasi ligan yang diberi label radioaktif untuk
memvisualisasikan dan mengukur reseptor dalam jaringan.
2. Aplikasi teknik hibridisasi dalam dunia kesehatan adalah untuk mengenali
kelainan kromosom dan diagnosis penyakit genetic. Sementara, aplikasi
autoradiografi dalam dunia kesehatan adalah menentukan letak tumor ganas
pada otak.
3. Teknik hibridisasi dan autoradiografi memiliki kekurangan tetapi kelibihannya
lebih banyak.

16
 DAFTAR PUSTAKA

Antibakterial properties of BRL 36650, - novel 6 - substituted penicillin

Antimicrob Ag. Chemother 26: 734-740.

Basker, M.J., Edmonson, R.A., and White, S.S, 1984, In Vitro.

Brown, T.A, 1993, Recombinant In Genetic molecular Opproach, Chapman & Hall,
London.

Fatchiyah. Lecture. Ub.ac.id/ general-molecular-probe-hybridization.

http://grace25041989, sapaces live.com/

www. SlideShare.net / Rekayasa-genetik-dan-teknik- Siti-Julaiha.

17
Pertanyaan-pertanyaan:
1. Pada teknik hibridisasi, bagaimana cara menghilangkan dilusi pada pembelahan
sel?
Jawab:
Pada teknik hibridisasi labelnya otonom dan diperkuat pada setiap pembelahan sel
sehingga menghilangkan masalah dilusi pada setiap pembelahan sel.
2. Panjang probe harus antara 18 dan 50 basa, bagaimana jika probe yang
digunakan kurang panjang atau lebih panjang?
Jawab:
Probe yang lebih panjang akan menyebabkan waktu hibridisasi lebih lama dengan
hasil sintesis rendah, probe pendek akan kurang spesifik.
3. Apa yang dimaksud dengan probe dan kapan dilakukan probing?
Jawab:
Probe adalah agen yang dimasukkan ke dalam suatu medium untuk mendapatkan
informasi tentang strutur maupun substansi tertentu yang biasanya ditempeli zat
radioaktif. Probing dilakukan pada saat DNA (asam nukleat) mengalami denaturasi,
dimana suatu asam nukleat untai tunggal akan membentuk double helix dengan untai
tunggal lain dari urutan (sekuens) basa komplementer yang telah diberi label.
4. Mengapa komposisi basa harus 40-60% G-C?
Jawab:
Karena pada komposisi basa yang demikian dihasilkan panjang probe antara 18 dan
50 basa.

18