Makalah Bioteknologi Molekul

TEKNIK ISOLASI DAN PEMURNIAN MOLEKUL DNA

DISUSUN OLEH:

KELOMPOK 4

NURYANTI H311 14 028

DIAN EKA PERTIWI H311 14 029
FARIDATUN SHOLEHAH H311 14 030

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
 KATA PEGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena dengan
rahmat dan karunia-Nya lah sehingga penulis dapat menyusun dan menyajikan
makalah mengenai metabolisme obat. Maksud dari penulisan karya tulis ini adalah
sebagai pelaksanaan tugas penulis selaku mahasiswa Jurusan Kimia, Unversitas
Hasanuddin untuk mata kuliah Bioteknologi Molekul.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan karya tulis ini masih terdapat
kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
kritik serta saran yang membangun guna menyempurnakan karya tulis ini sehingga
dapat menjadi acuan dalam menyusun karya tulis selanjutnya. Penulis juga memohon
maaf apabila dalam penulisan karya tulis ini terdapat kesalahan pengetikan ataupun
kekeliruan sehingga membingungkan pembaca dalam memahami maksud penulis.

Makassar, 25 Oktober 2017

Penulis

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR...................................................................................................i
DAFTAR ISI................................................................................................................ii
BAB I PENDAHULUAN.............................................................................................1
1.1 Latar Belakang.......................................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah..................................................................................................2
1.3 Tujuan Penulisan....................................................................................................2
1.4 Manfaat Penulisan..................................................................................................2

BAB II PEMBAHASAN..............................................................................................3
2.1 Teknik Isolasi dan Pemurnian DNA......................................................................3
2.1.1 Ekstraksi Organik................................................................................................6
2.1.2 Mesmbran Silika................................................................................................11
2.1.3 Pemisahan Magnetik.........................................................................................15
2.1.4 Penukar Ion........................................................................................................16
2.1.5 Pemurnian Cesium Clorida (CsCl)....................................................................16
2.1.6 Salting-Out........................................................................................................17
2.1.7 Elektroforesis Gel DNA....................................................................................18
2.2 Teknik Isolasi DNA Kromosom...........................................................................21
2.3 Teknik Isolasi DNA Plasmid................................................................................21
BAB III KESIMPULAN7...........................................................................................23
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................24
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan senyawa kimia yang paling penting

pada makhluk hidup, yang menyimpan informasi genetik yang spesifik untuk setiap

individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi berikutnya.

Bioteknologi modern mulai berkembang setelah penemuan struktur DNA sekitar

tahun 1950, yang diikuti dengan penemuan-penemuan lainnya. Penemuan ekspresi

gen, enzim pemotong DNA, keberhasilan menciptakan DNA rekombinan dengan

menggabungkan DNA dua organisme yang berbeda, dan cloning merupakan contoh

bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan

pada manipulasi atau rekayasa DNA,

Penggunaan DNA untuk analisis atau manipulasi biasanya perlu dilakukan

isolasi dan pemurnian DNA (Walker dan Rapley, 2000). Proses ekstraksi untuk

mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus

dipenuhi dalam analisis molekuler. Berbagai analisis biologi molekuler memerlukan

hasil isolasi DNA dengan tingkat kemurnian dan kualitas yang baik. DNA hasil

isolasi harus terbebas dari berbagai kontaminan seperti protein dan RNA yang dapat

menggangu berlangsungnya proses PCR. Oleh karena itu, metode isolasi dan

purifikasi DNA yang tepat sangat diperlukan untuk mendapatkan DNA dengan

kualitas dan kuantitas yang baik. Berdasarkan uraian di atas maka perlu untuk

mengaji tentang teknik isolasi dan pemurnian DNA.

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Bagaimana teknik isolasi dan pemurnian DNA?

1.3 Tujuan Penulisan

1.2.1 Untuk mengetahui teknik isolasi dan pemurnian DNA.

1.4 Manfaat Penulisan

1.4.1 Dapat menambah wawasan baik kepada penulis maupun pembaca tentang

teknik isolasi dan pemurnian DNA.

1.4.2 Makalah ini dapat dijadikan referensi untuk penyusunan makalah atau karya

tulis lain maupun untuk menyelesaikan tugas.

 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Teknik Isolasi dan Pemurnian DNA

Langkah utama dalam isolasi DNA dimulai dari lisis/disintegrasi sel untuk

memperoleh lisat (lysate: molekul dalam sel), pemisahan DNA terlarut dari puing-

puing sel dan bahan lain yang tidak larut serta pemurnian DNA yang diingikan dari

protein terlarut dan asam nukleat lainnya (hielscher.com; promega.com). Isolasi

DNA dengan berat molekul tinggi merupakan salah satu bagian dari masalah yang

ada, karena ekstrak tanaman seringkali mengandung sejumlah besar polisakarida,

tannin, dan pigmen yang sulit dipisahkan dengan DNA dan menghambat aktivitas

sebagian besa enzim yang memodifikasi DNA itu sendiri (Nasir, 2002).

1) Lisis Sel

Faktor kritis dalam isolasi DNA tanaman adalah penghilangan dindin sel

tanaman secara efisien (Nasir, 2002). Lisis sel dapat dilakukan secara fisik, kimiawi

maupun enzimatik. Pemecahan sel secara fisik dapat dilakukan misalnya dengan

menggunakan alat sonikator, yaitu alat yang menghasilkan suara dengan frekuensi

ultra tinggi. Sel disuspensikan dalam suatu buffer, kemudian ujung alat sonikator

dimasukkan ke dalam suspensi sel. Pemecahan sel dengan cara ini biasanya efeektif

untuk memecah sel bakteri tetapi kurang efektif untuk sel eukariotik karena struktur

sel eukariotik lebih kuat dibanding dinding sel bakteri. Pemecahan sel juga dapat

dilakukan dengan menggunakan enzim lisosim yang dapat memecah dinding sel.
Seingkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya

dengan pemanasan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa yang sering digunakan

untuk memecah sel untuk isolasi DNA genom adalah CTAB (Cetryl Trimethyl

Ammmonium Bromide). Senyawa CTAB biasanya digunakan untuk isolasi DNA dari

jaringan tanaman (Yuwono, 2008).

Gambar 1. Merusak dinding sel dengan cara mekanis (digerus)

DNA diperoleh dari sel dengan metode lembut. Metode ini dilakukan untuk

mencegah agar DNA tidak terfragmentasi oleh pemotongan mekanis. Metode ini

biasaya dilakukan dengan adanya EDTA. EDTA dimaksudkan untuk mengkelat ion

Mg2+ yang dibutuhkan oleh enzim yang mendegradasi DNA atau biasa disebut

DNase sehingga enzim DNase tidak aktif. Idealnya, jika terdapat dinding sel mak

perlu dihancurkan secara enzimatik, misalnya lisozim terhadap bakteri. Selain itu

membran sel harus dilarutkan dengan menggunakan deterjen. Jika perlakuan fisik

diperlukan maka harus dijaga seminimal mungkin dan harus melibatkan pemotongan

atau pelumatan sel, dan bukan menggunaan gaya geser. Lisis sel (dan sebagian besar

langkah selanjutnya) harus dilakukan pada 4 °C, menggunakan alat gelas dan larutan
yang telah diautoklaf untuk menghancurkan aktivitas DNase (Walker dan Rapley,

2000).

Gambar 2. Penggunaan detergen untuk merusak membrane lipid

2) Penghilangan Kontaminan

Setelah pelepasan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan dengan

pengguanaan ribonuklease (RNase) yang telah dipanaskan. Pemanasan dilakukan

untuk menonaktifkan kontaminan DNase karena RNase relatif stabil terhadap panas

akibat ikatan disulfida, yang menjamin cepatnya renaturasi molekul pada

pendinginan (Walker dan Rapley, 2000).

Kontaminan utama lainnya adalah protein. Protein dapat dihilangkan dengan

ekstraksi fenol-klorofom. Langkah ini dilakukan dengan mengocok larutan dengan

lembut dengan fenol jenuh. Sentrifugasi pada emulsi yang terbentuk oleh

pencampuran ini menghasilkan fase organik yang lebih rendah, dipisahkan dari fasa

air bagian atas dengan antarmuka adalah protein terdenaturasi. Setelah disentrifugasi,

protein terdenaturasi tetap berada dalam fase organik sedangkan asam nukleat pada

fasa air. Larutan kemudian dicampur dengan kloroform yang menghilangkan residu

fenol dari larutan. Hal ini dilakukan berulang kali sampai tidak ada protein

terdenaturasi yang terlihat di bagian antarmuka (Walker dan Rapley, 2000; Rice).
3) Pengumpulan DNA

Preparasi DNA yang sudah bebas protein dicampur dengan dua volume

etanol absolut, dan DNA dibiarkan mengendap dalam freezer. Setelah sentrifugasi,

pelet DNA dilarutkan dalam buffer yang mengandung EDTA untuk menonaktifkan

setiap DNases yang ada. Larutan ini dapat disimpan pada suhu 4 °C paling lama

selama sebulan. Larutan DNA dapat disimpan dalam keadaan beku, meskipun

pembekuan dan pencairan berulang cenderung merusak molekul DNA (Walker dan

Rapley, 2000).

Sel
Lisis Sel
Fisika/Kimia/Enzim

Lisat

Bebas Lipid

Bebas Protein

+ RNase
Bebas RNA

DNA Murni

Gambar 3. Langkah utama dalam isolasi DNA.

Terdapat beberapa metode yang tersedia untuk memurnikan DNA plasmid,

meliputi (gbiosciences.com; labome.com):

2.1.1 Ekstraksi Organik

Salah satu metode tradisional yang efektif dan relatif murah untuk purifikasi

DNA plasmid adalah metode ekstraksi fenol-kloroform. Campuran pelarut organik

ini secara signifikan dapat mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid.

Jumlah fenol-kloroform yang ditambahkan umumnya satu kali volume larutan yang

akan dipurifikasi. Metode ini sangat bermanfaat untuk aplikasi PCR karena dapat

membantu menghilangkan penghambat PCR yang terdapat pada larutan ekstrak.

Metode ini akan menghasilkan lapisan air yang mengandung asam nukleat, lapisan

antara fenol dan air yang berisi protein penghambat yang mengalami presipitasi dan

polimer (termasuk karbohidrat), dan lapisan khloroform-isoamilalkohol yang

mengikat lemak. Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran

fenol-kloroform-isoamil alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran

fenol-kloroform adalah campuran yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak

dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase

fenol-kloroform. Fenol-kloroform lebih berat daripada air sehingga fasenya berada di

bawah fase air. Kedua fase kemudian dicampur dengan cara vorteks. Pencampuran

akan membuat fenol merangsek ke dalam lapisan air dan membentuk emulsi droplet.

Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenol-kloroform, sedangkan

DNA tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat dipisahkan dengan baik dengan

sentrifugasi. Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan mudah diambil dengan

pemipetan, dan fase fenol-kloroform dapat dibuang (Davis, 2012).

Air adalah pelarut yang sangat polar, sedangkan fenol bersifat kurang polar

dibandingkan dengan air. DNA adalah molekul polar yang disebabkan oleh adanya

gugus-gugus fosfat dalam kerangkanya. Hal ini membuat DNA sangat larut dalam air

dan kurang larut dalam fenol. Ketika isolat DNA yang larut dalam air dicampurkan

dengan fenol, DNA tidak akan larut dalam fenol, namun tetap berada dalam fase air

(Davis, 2012).
 Protein memiliki sifat yang berbeda dari DNA. Protein adalah polimer rantai

panjang polipeptida yang tersusun atas berbagai macam asam amino. Asam amino

ada yang bersifat polar (seperti glutamat, lisin dan histidin) karena memiliki residu

yang bermuatan, dan ada juga asam amino yang non polar (seperti fenilalanin, leusin

dan triptofan) akibat residunya yang tak bermuatan. Dalam lingkungan berpelarut air,

rantai polipeptida melipat sedemikian rupa sehingga residu-residu asam amino yang

kurang polar daripada air akan berada di sisi dalam protein (jauh dari air), sedangkan

rantai samping asam amino yang polar akan tertata pada sisi luar protein, berikatan

dengan air. Dengan kata lain residu-residu asam amino yang polar bersifat hidrofilik

(suka air), dan yang non polar bersifat hidrofobik (takut air). Maka, ketika

dicampurkan dengan fenol, protein terekspos dengan pelarut yang kurang polar,

sehingga pola pelipatannya protein berubah. Pada dasarnya dalam kondisi tersebut

residu-residu asam amino dari protein akan bertukar tempat. Residu yang kurang

polar yang tadinya tersembunyi di sisi dalam protein ketika berada dalam pelarut air,

kini mendesak menuju ke sisi luar untuk berinteraksi dengan pelarut fenol.

Sebaliknya, residu-residu asam amino yang polar akan terselip ke sisi dalam protein,

berlindung dari fenol. Dalam waktu singkat, protein mengalami denaturasi akibat

perubahan pola pelipatannya. Residu non polar yang kini berada di sisi luar protein

yang terdenaturasi membuat protein tersebut lebih larut di dalam fenol daripada di

dalam air. Hal inilah yang mendasari proses pemisahan DNA dari protein dalam

metode ekstraksi fenol. Protein akan terpisah di fase fenol, sedangkan molekul DNA

yang polar tetap berada pada fase air.

 Gambar 4. Perbedaan polaritas DNA dan protein (bitesizebio.com).

Setelah menghilangkan protein dari DNA tahap selanjutnya yaitu

memisahkan DNA dari larutan dengan cara presipitasi etanol/ isopropanol. Prosedur

dasarnya adalah etanol absolut ditambahkan ke larutan DNA. Proses presipitasi

etanol umumnya dapat dibantu dengan penambahan garam. Setelah perlakuan itu,

DNA akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya pelet

DNA dicuci dengan etanol 70%. Kemudian pelet dikeringkan dan setelah itu

dilarutkan kembali ke dalam air atau buffer tris EDTA (TE).

Gambar 5. Ekstraksi fenol-kloroform dan presipitasi etanol

 Sebagai pelarut polar, molekul air memiliki muatan negatif parsial di sekitar

atom oksigennya, dan muatan positif parsial di sekitar atom hidrogennya. Oleh

karena itu DNA yang bermuatan negatif dapat berinteraksi dengan molekul air, dan

larut di dalamnya. Garam berfungsi untuk menetralkan muatan pada kerangka gula

fosfat. Kation monovalen dalam hal ini ion (Na+) sodium akan menetralkan muatan

negatif pada gugus fosfat (PO43-) DNA, sehingga membuat molekulnya kurang larut

dalam air. Dengan adanya kation monovalen seperti Na +, dan pada suhu -20 °C,

etanol absolut secara efisien mengendapkan asam nukleat polimerik dan

meninggalkan komponen asam nukleat rantai pendek dan monomer termasuk

ribonukleotida dari pemberian RNase dalam larutan. Metode ini menggunakan

pelarut organik berbahaya, relatif memakan waktu, dan fenol atau kloroform residual

dapat mempengaruhi aplikasi downstream seperti PCR.

Dalam prakteknya isopropanol juga dapat digunakan untuk presipitasi DNA.

Isopropanol kurang volatil daripada etanol sehingga butuh waktu lebih lama untuk

diuapkan. Selain itu, beberapa garam kurang larut dalam isopropanol (dibandingkan

dengan dalam etanol) dan akan lebih cenderung terpresipitasi bersama dengan DNA.

Oleh karena itu, pencucian ekstra dengan etanol 70% perlu dilakukan untuk

menghilangkan kontaminasi garam. Isopropanol memiliki kelebihan karena jumlah

volume yang dibutuhkan untuk presipitasi DNA hanya setengah dari jumlah volume

etanol.

Secara umum metode ekraksi DNA dengan ekstraksi Organik dapat di lihat

pada gambar di bawah ini:

 Gambar 6. Tahap 1. Ekstraksi dengan pelarut organik

Gambar 7. Tahap 2. Presipitasi DNA

2.1.2 Membran Silika

Metode ini banyak digunakan dalam kit saat ini. DNA mengadsorpsi secara

spesifik membran/manik-manik/partikel silika dengan adanya garam tertentu dan

pada pH tertentu. Kontaminan seluler dikeluarkan dengan langkah pencucian. DNA

dielusi dalam buffer garam rendah atau buffer elusi. Garam chaotropik dimasukkan

untuk membantu denaturasi protein dan ekstraksi DNA. Metode ini dapat

dikombinasikan dengan kolom spin dan microchip, hemat biaya, memiliki prosedur
yang lebih sederhana dan lebih cepat daripada ekstraksi organik, dan cocok untuk

otomatisasi.

Cara lain pemanfaatan silika dalam proses ekstraksi asam nukleat adalah

dengan melakukan perubahan kimia pada matriks silika sehingga akan secara

spesifik berikatan dengan protein atau polisakarida. Ekstraksi asam nukleat berbasis

silika ini telah menjadi dasar metode ekstraksi asam nukleat kit komersial. Matriks

silika dalam kit komersial tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti

filter (spin column), gel (glassmilk, silica gel), suspensi (celite, plain-coarse silicate),

bahkan partikel berselubung magnetik (Dynabeads). Filtrasi, sentrifugasi, atau

penggunaan magnet memungkinkan pemisahan asam nukleat yang berikatan dengan

silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan protein melalui langkah pembilasan

yang multipel. Metode ini juga mendasari pembuatan alat ekstraksi asam nukleat.

Gambar 8. Prinsip pengikatan antara membrane silica dengan kerangka

DNA/RNA
 Gambar 9. DNA berikatan dengan silica akibat adanya konsentrasi garam

yang tinggi

Proses ekstraksi DNA dilakukan menggunakan prosedur kerja PureLink

Genomic DNA mini Kits dari invitrogen. PureLinkTM Genomic DNA mini Kits

adalah paket ekstraksi DNA yang terdiri atas lysis buffer, digestion buffer, wash

buffer 1, wash buffer 2, elution buffer, Rnase, proteinase K. Kit PureLink Genomic

DNA menggunakan kolom yang prinsip kerjanya didasarkan pada ikatan selektif

DNA pada membran berbahan silika dan garam chaotropic sehingga dapat mengikat

dan melepaskan DNA lebih efisien. Lysis buffer pada kit ini telah dioptimasi untuk

meningkatkan aktivitas proteinase K sebagai enzim yang membantu dalam denaturasi

protein.

Pemurnian DNA dengan silika menjadi bahan alternatif dalam metode isolasi

DNA yang efisien dan efektif. Prinsip silika adalah pengikatan molekul air oleh

denaturan dan interaksi hidrogen dengan permukaan silika. Silika berperan sebagai

pengikat DNA sehingga pengotor dan protein yang ada di dalam sampel tidak dapat
terikat. Pengotor dan protein yang ada di dalam sampel dapat dihilangkan dengan

larutan pencuci (Aini dkk., 2011).

Beberapa senyawa mempunyai fungsi multipel dalam protokol ekstraksi asam

nukleat. Agen chaotropic seperti GuSCN (guanidine isothiocyanate), NaI (sodium

iodide), dan LiCl (lithium chloride) memiliki kemampuan untuk menghancurkan

kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein dan menginaktivasi

nuklease. GuSCN dengan molaritas di atas 4 M dapat mempresipitasi DNA dan RNA

berberat molekular tinggi. Dalam lingkungan yang tinggi garam chaotropic ini

senyawa silika dapat berikatan secara spesifik dengan molekul DNA dan RNA,

sedangkan lemak dan protein kontaminan hanya mempunyai afinitas yang moderat

terhadap silika sehingga dapat dicuci bersih darinya. Absorbsi asam nukleat pada

matriks silika meningkat pada pH asam dan konsentrasi garam yang tinggi, sehingga

larutan bufer yang mengandung pH yang tinggi dan konsentrasi garam yang rendah

dapat digunakan untuk mencuci-lepaskan asam nukleat dari matriks silika.

Metode alternatif yang berbasis matriks silika antara lain teknik hibridisasi

fragmen asam nukleat yang menggunakan probe yang didesain spesifik yang melekat

pada matriks solid atau bead magnetik. Kelemahan umum dari teknik penangkapan

seperti ini adalah selama proses pelekatan dan cuci-lepas, dapat terjadi fragmentasi

dan hilangnya DNA target.

 Gambar 10. Ekstraksi DNA dengan metode silica

2.1.3 Pemisahan Magnetik

Metode ini didasarkan pada DNA yang mengikat secara reversibel ke

permukaan padat/manik-manik/partikel magnetik, yang telah dilapisi dengan antibodi

pengikat DNA atau kelompok fungsional yang berinteraksi spesifik dengan DNA.

Setelah mengikat DNA, manik-manik dipisahkan dari komponen seluler yang

terkontaminasi lainnya, dicuci dan akhirnya DNA yang dimurnikan dielusi dengan
menggunakan ekstraksi etanol. Cara ini cepat dan bisa otomatis. Namun, bisa lebih

mahal daripada metodologi lainnya.

2.1.4 Penukar Ion

Metode ini didasarkan pada interaksi spesifik antara fosfat bermuatan negatif

dari asam nukleat dan molekul permukaan bermuatan positif pada substrat. DNA

mengikat secara khusus ke substrat dengan adanya garam rendah, kontaminan

dihilangkan dengan langkah mencuci menggunakan buffer garam rendah atau

sedang, dan DNA yang dimurnikan dielusi dengan menggunakan buffer garam

tinggi. Teknologi ini lebih umum digunakan pada peralatan isolasi plasmid.

2.1.5 Pemurnian Cesium Klorida (CsCl)

DNA juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel virus. Untuk

ekstraksi DNA semacam ini sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau virus

tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi DNA-nya karena isolasi DNA

target dari campuran DNA (DNA total) relatif sulit. Jika dibutuhkan isolat DNA

dengan kemurnian yang tinggi, DNA dapat dimurnikan dengan density gradient

centrifugation menggunakan CsCl (Caesium chloride).

DNA genom dapat dimurnikan dengan sentrifugasi dengan gradien densitas

cesium klorida (CsCl). Sel dilisis menggunakan deterjen, dan lisatnya diendapkan

dengan alkohol. DNA resuspended dicampur dengan CsCl dan etidium bromida dan

disentrifugasi selama beberapa jam. DNA dikumpulkan dari tabung sentrifugal,

diekstraksi dengan isopropanol untuk menghilangkan etidium bromida, dan

kemudian diendapkan dengan etanol untuk mengumpulkan DNA. Metode ini

memungkinkan isolasi DNA berkualitas tinggi, namun memakan waktu,

membutuhkan tenaga kerja besar, dan mahal (diperlukan ultracentrifuge), sehingga

tidak sesuai untuk penggunaan rutin. Metode ini menggunakan bahan kimia beracun

dan juga tidak mungkin untuk mengotomatisasi.

2.1.6 Salting-Out

Salting-Out adalah teknik konvensional lain dimana protein dan kontaminan

lainnya diendapkan dari lisat menggunakan garam konsentrasi tinggi seperti

potassium asetat atau amonium asetat. Endapan dipisahkan dengan sentrifugasi, dan

DNA dikumpulkan dengan pengendapan alkohol. Pengeluaran protein dan

kontaminan lainnya dengan menggunakan metode ini mungkin tidak efisien, dan

pengolahan RNase, dialisis, dan/atau pengendapan alkohol berulang seringkali

diperlukan sebelum DNA dapat digunakan dalam aplikasi downstream. Hasil dan

kemurnian DNA sangat bervariasi dengan menggunakan metode ini.

Gambar 11. Metode Salting-out

2.1.7 Elektroforesis Gel DNA

Untuk memeriksa integritas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada

gel agarose. Material elektroforesis gel yang sering digunakan untuk DNA adalah

agarose dan akrilamid. Elektroforesis menggunakan gel agarose atau poliakrilamid

merupakan metode standart untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan

fragmen DNA. Metode paling mudah dan paling sering digunakan adalah dengan gel

agarose horisontal. Teknik ini sangat sederhana, tidak memakan banyak waktu, dan

dapat menghasilkan fragmen DNA yang tidak dapat dipisahkan secara adekuat

dengan prosedur lain seperti density gradient centrifugation. Gel agarose merupakan

turunan polisakarida yang di dapat dari alga merah. Gel agarose dapat digunakan

untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 100 bp (base pairs). Untuk

resolusi yang lebih tinggi atau untuk separasi yang lebih efektif dari molekul DNA

yang lebih pendek sebaiknya menggunakan gel poliakrilamid. Gel agarose

merupakan fasa diam dalam pemisahan fragmen DNA dan muatan listrik sebagai

fasa geraknya.

Gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan fragmen DNA kecil,

biasanya berukuran kurang dari 100 bp. Gel ini biasanya menggunakan akrilamid

berkonsentrasi rendah (<6%) dan mengandung agen denaturing non-ionik (urea 6M).

Agen denaturing ini berperan untuk mencegah pembentukan formasi struktur

sekunder oligonukleotida sehingga memungkinkan penentuan massa molekular yang

akurat.

DNA merupakan molekul yang bersifat asam, sehingga akan bergerak dari

kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda). Pergerakan DNA di dalam gel
tergantung pada berat/ukuran molekul DNA, bentuk konformasi DNA, konsentrasi

agarosa, tegangan listrik yang digunakan dan kekuatan bufer elektroforesis. Jenis

bufer yang digunakan untuk elektroforesis juga mempengaruhi resolusi pemisahan

DNA. Bufer TAE (Tris-Acetate-EDTA) akan menghasilkan resolusi yang lebih baik

untuk fragmen DNA yang berukuran lebih dari 4 kb, sedangkan bufer TBE (Tris-

Borate-EDTA) akan menghasilkan resolusi yang lebih baik untuk fragmen DNA

berukuran 0,1–3 kb. Hasil dari elektroforesis dapat diamati dengan sinar ultraviolet,

yang nantinya akan tampak seperti pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah

molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis.

Gambar 12. Bagian-bagian elektroforesis

Gambar 13. Tahapan Elektroforesis. A) Pemasangan sisir pada cetakan gel agarosa
B) Menuangkan larutan agarosa yang cair setelah pemanasan C) setelah
permukaan gel padat, sisir diangkat D) setelah ditambahkan dengan
larutan TBE, masukkan DNA sampel pada setiap sumuran E)
menghidupkan mesin elektroforesis dengan waktu, set voltase dan arah
migrasi yang telah ditetapkan F) hasil dari elektroforesis G) hasil
elektroforesis setelah diamati dengan UV illuminator.

Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose

tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA kita. Cara

yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh

adalah dengan menggunakan spektrofotometer UV. DNA untai tunggal mempunyai

koefisien absorbsi 0,027, DNA untai ganda 0,02 dan RNA 0,025 g per-ml per-cm

pada panjang gelombang 260 nm. Rasio absorbsi 260/280 nm dapat digunakan untuk

mengetahui adanya kontaminasi protein atau fenol (protein memiliki absorbsi

maksimum pada 280 nm). Sampel DNA yang murni memiliki rasio 260/280 nm

sebesar 1,8-1,9, sedangkan sampel RNA yang murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di

bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang masih tertinggal di dalam
sampel. Saat ini sudah banyak dijual alat spektrofotometer otomatik yang secara

otomatis mengkalkulasi rasio 260/280 nm dan kuantitas asam nukleat. Yang perlu

diingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu

melakukan kalibrasi dengan larutan blank sebelum memeriksa konsentrasi asam

nukleat sampel. Yang digunakan sebagai blank adalah pelarut yang digunakan untuk

melarutkan asam nukleat yang diperiksa.

2.2 Teknik Isolasi DNA Kromosom

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari

komponen komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur

mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen

untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan

protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk

mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak

tersebut dipanaskan sampai suhu 90°C untuk menginaktifasi enzim yang

mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi atau diendapkan

dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Ahmad, 2014).

2.3 Teknik Isolasi DNA Plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga

DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai

ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA

plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas.

Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan

DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom

dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. Kompleks DNA, protein, dan
potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang

mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian

ditambahkan RNase dan protease untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya

DNA plasmid dapat diendapkan atau dipresipitasi menggunakan etanol (Ahmad,

2014).
 BAB III
KESIMPULAN

Langkah utama dalam isolasi DNA dimulai dari lisis sel untuk memperoleh

lisat, pemisahan DNA terlarut dari puing-puing sel dan bahan lain yang tidak larut

serta pemurnian DNA yang diingikan dari protein terlarut dan asam nukleat lainnya.

Terdapat beberapa metode yang tersedia untuk memurnikan DNA plasmid, meliputi;

ekstraksi organik, membran silika, pemisahan magnetik, penukar ion, salting-out dan

pemurnian CsCl. Kemudian Untuk memeriksa integritas DNA dapat dilakukan

dengan elektroforesis pada gel agarose.

 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, A., 2014, Bioteknologi Dasar, Universitas Hasanuddin, Makassar.

Nasir, M., 2002, Bioteknologi: Potensi dan Keberhasilannya dalam Bidang Pertanian, PT
Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Rice, G., DNA Extraction. Educational Resources, Microbial Life, Montana State
University,

Tistama, R., Widyastuti, U. dan Suharsono, 2013, Isolasi dan Karakterisasi Gen Sitrat
Sintase Bakteri Pseudomonas aeruginosa dari Filosfer Hevea brasiliensis Muell. Arg,
Jurnal Penelitian Karet, 31(2): 127-138.

Walker, J.M. dan Rapley, R., 2000, Molecular Biology and Biotechnology, Fourth Edition,
The Royal Society of Chemistry, Cambridge.

Yuwono, T., 2008, Bioteknologi Pertanian, Gajah Mada University Press, Yogyakarta.

http://bitesizebio.com/384/the-basics-how-phenol-extraction-works/

https://info.gbiosciences.com/blog/bid/172096/dna-purification-why-should-you-purify-
your-dna-samples

https://www.labome.com/method/DNA-Extraction-and-Purification.html

https://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-
applications-guide/dna-purification/

https://www.hielscher.com/id/ultrasonic-lysis-cell-disruption-extraction.htm