Validasi Metode Analisis Quercetin dalam Ekstrak Menggunakan

Spektrofotometer UV-Vis

Ayu Apriliani 260110140078

I. Tujuan
Melakukan validasi untuk metode penentuan kadar kuersetin dalam ekstrak
dengan Spektrofotometer UV-Vis.

II. Prinsip

2.1 Quercetin
Kuersetin adalah senyawa golongan flavonoid jenis flavonol dan flavon yang
berkhasiat diantaranya untuk mengobati kerapuhan pembuluh kapiler pada manusia
(Yuliani, 2003).

2.2 Validasi
Validasi merupakan kegiatan untuk melakukan konfirmasi melalui bukti-bukti
pemeriksaan dan telah sesuai dengan tujuan pengujian. Validasi harus dilakukan
terhadap metode non-standar dan metode yang dikembangkan laboratorium. Rentang
ukur dan akurasi dapat diperoleh dari hasil validasi metode yang sesuai dengan
kebutuhan customer (Commission, 2005).

2.3 Spektrofotometer UV-Vis

Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energi yang
berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul.
Besar energi yang diserap menyebabkan elektron tereksitasi dari orbital dasar ke
orbital yang memiliki energi lebih tinggi. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa
ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan
linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik
dengan transmitan. Hukum Lambert-Beer:

(Peshkova & Gromova, 1961).

III. Reaksi

(Harborne,1975)

IV. Teori Dasar

Kuersetin adalah polifenol flavonoid yang mempunyai aktivitas antiinflamasi,

antihepatotoksik, antiulker, antialergi, antidiabetes, antivirus dan antioksidan.
Senyawa ini ditemukan pada banyak tanaman herbal seperti Cocculus hirsutus (Patil,
2015).
Dalam analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang masuk
ke dalam daerah spektrum ultraviolet itu. Dari spektrum ini, dipilih panjang-panjang
gelombang tertentu dengan lebar pita kurang dari 1 nm. Proses ini menggunakan
instrumen yang disebut spektrofotometer. Alat ini terdiri dari spektrometer yang
menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer
sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi
(Bahera et al., 2012).
Validasi terhadap suatu metode analisa menjadi faktor penting karena hanya
metode analisa yang telah dibuktikan validitasnya maka hasil pengukurannya bisa
dipertanggung jawabkan dan dipergunakan sebagai landasan dalam perhitungan
berikutnya. (Sugihartini, 2014).
Menurut USP ada 8 langkah dalam validasi metode analisis sebagaimana
sebagai berikut: Validasi metode, Ketahanan, Kekasaran, Linieritas & Rentang,
Spesifitasi, Batas deteksi, Akurasii, Presisi, Batas kuantifikasi. Sementara itu, ICH
membagi karakteristik validasi metode yang sedikit berbeda berbeda dengan USP
sebagaimana sebagai berikut: Validasi metode, Ketahanan, Kisaran, Linieritas,
Spesifitas, Batas deteksi, Akurasi, Presisi, Batas Kuantifikasi, Kesesuaian Sistem
(Rahman, 2009).
Pembuatan Kurva kalibrasi dilakukan untuk mengevaluasi hubungan linier
antara daerah puncak dan konsentrasi kuersetin. Slope, intercept, dan koefisien
determinasi (r2) dihitung sebagai parameter regresi dengan regresi linier berbobot
(He at al., 2012).
Hukum Lambert-Beer menjadi dasar aspek kuantitatif spektrofotometri
dimana konsentrasi dapat dihitung berdasarkan rumus di atas. Absorptivitas (a)
merupakan konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet dan
intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung pada suhu,
pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi (Day, 1999).
 V. Alat dan Bahan
5.1 Alat
1. Neraca analitik 5.2 Bahan
2. Labu ukur 1. AlCl3
3. Spatel 2. Buffer Asetat pH 3,8
4. Kaca arloji 3. Ekstrak Sampel
5. Pipet tetes 4. Metanol
6. Pipet volume 5. Ultra-pure water
7. Spektrofotometer UV-Vis

VI. Data Pengamatan

Pembuatan pereaksi
Tujuan : Membuat sejulah pereaksi yang digunakan dalam analisis
AlCl3 2%
No. Prosedur Hasil
1 Memasukkan sebanyak 10 gram aluminium klorida Didapatkan alumunium
ke dalam labu ukur 100 mL klorida dalam labu ukur
2 Menambahkan asam asetat 5% dalam metanol 25 mL Didapatkan campuran
ke dalam labu ukur alumunium klorida dan
pelarut dalam labu ukur
3 Melakukan degassing selama 5 menit Didapatkan labu ukur yang
tidak berisi gas berlebih
4 Menambahkan asam asetat 5% dalam metanol ke Didapatkan alumunium
dalam labu ukur sampai tanda klorida dengan konsentrasi
2%
5
Asam setat glasial 5% (v/v)
No. Prosedur Hasil
1 Memasukkan asam asetat glasial 25 mL ke dalam Didapatkan asam asetat
labu 500 mL glasial dalam labu ukur
2 Menambahkan metanol ke dalam labu hingga tanda Didapatkan asam asetat
batas glasial dengan konsentrasi
5%
3
4
5
HCl 25% (v/v)
No. Prosedur Hasil
1 Mengambil HCl 12 N sebanyak 6,79 mL Didapatkan HCl dengan
volume tersebut
2 Menambahkan air suling sebanyak 3,9 mL Didapatkan campuran HCl
dan air suling
3 Mengocok larutan hingga diperkirakan merata Didapatkan konsentrasi HCl
25% yang homogen
4
5

Preparasi sampel
Tujuan : Hidrolisis glikosida kuersetin
No. Prosedur Hasil
1 Menimbang ekstrak pekat sebanyak 200 mg Didapatkan ekstrak pekat
dengan berat tersebut
2 Memasukkan ekstrak ke dalam labu alas bulat Didapatkan ekstrak dalam
labu alas bulat
3 Menambahkan larutan hidrolisis yaitu Didapatkan campuran
heksametilentetramina 1 Ml 0,5% (b/v), 20 mL aseton, larutan dalam labu
dan 2 mL HCl 25% (v/v).
4 Melakukan refluks pada bahan selama 30 menit Terjadi pemisahan
komponen
5 Menyaring campuran hasil hidrolisis menggunakan Hasil hidrolisis tersaring
kapas ke dalam labu ukur 100 mL
6 Melakukan refluks kembali pada residu degan 20 mL Terjadi pemisahan yang
aseton selama 30 menit lebih spesifik
7 Menyaring hasil refluks ke-dua dan mencampurkannya Hasil hidrolisis tersaring
ke dalam fultrat dalam labu ukur 100 mL
8 Manambahkan aseton ke dalam campuran filtrat Didapatkan larutan yang
sampai volume 100 mL kemudian dikocok hingga homogen
tercampur sempurna
9 Mengambil sebanyak 20 mL filtrat kemudian Terdapat filtrat dalam
memasukannya ke dalam corong pisah corong pisah
10 Menambahkan akuades sebanyak 20 mL Didapatkan campuran
akuades dan filtrat
11 Mengekstraksi sebanyak tiga kali maisng-masing Didapatkan fraksi etil asetat
dengan 15 mL etil asetat
12 Mencampurkan fraksi etil asetat ke dalam labu ukur 50 Didapatkan campuran fraksi
mL etil asetat dalam labu
13 Menambahkan etil asetat sampai volume labu Didapatkan fraksi semi polar
dimana terdapat kuersetin
didalamnya

Pengukuran kadar Total Flavonoid Content (TFC)

Tujuan : Mengukur kadar flavonoid dalam ekstrak sebagai kuersetin
No. Prosedur Hasil
 1 Memindahkan 10 mL fraksi etil asetat ke dalam labu Didapatkan fraksi etil asetat
ukur 25 mL dalam labu ukur
2 Menambahkan 1 mL larutan AlCl3 2% Didapatkan campuran fraksi
dengan alumunium klorida
3 Menambahkan larutan asam asetat glasial 5% (v/v) Didapatkan campuran ketiga
secukupnya sampai tepat 25 mL komponen
4 Menyiapkan larutan blangko dengan memindahkan 10 Didapatkan blanko tanpa
mL etil asetat dan ditambahkan asam asetat glasial 5% sampel.
(v/v) sampai tepat 25 mL Didapatkan kadar 4.63%

Pembuatan kurva standar

No. Perlakuan Hasil
1. Ditimbang 10 mg baku standar kuersetin dan Didapatkan larutan stok
dilarutkan dalam 10 ml etanol (1000 ppm) kuersetin 1000 ppm
2. Dipiet 1 ml dan dilarutkan dalam 10 ml metanol (100 Larutan stok diencerkan
ppm).
3. Dibuat beberapa konsentrasu yaitu 11. 12 dan 13 ppm Didiapat pengenceran larutan
stok engan konsentrasi 11 12
13 ppm
4. Masing masing larutan ditambhkan 1 ml Alcl3 10%, Didapatkan larutan stok yang
0,5 ml asam asetat dan di add dengan etanol sampai terkompleks dengan reagen
10 ml
5. Didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar Larutan berubah menjadi
warna kuning cerah
6. Dibuat blanko dengan melarutkan 1 ml alcl3 10%, 0.5 Didapatkan blanko
ml asam asetat (pH 3.8) dan di add dengan etanol
sampai 10 ml
7. Diukur absorbansinya padapanjang gelombang425 nm Didapat absorbansi larutan
yaitu :
11 ppm ; 0.5317
12 ppm : 0.7277
13 ppm ; 0.8687
8. Dibuat kurva kalibrasi kemudian dilihat hasil dari Didapatkan persamaan linear
regresi linier (r2) yaitu
y; 0.1685x-1.3127
r2: 0.9912

Validasi
Tujuan : Menentukan parameter validasi
Linearitas
No. Prosedur Hasil
1 Diambil larutan stok lalu diencerkan pada Didapatkan larutan
variasi konsentrasi 11 12 dan 13 ppm pengenceran 11 12 13
ppm
2 Diukur absorbansinya padapanjang Didapat absorbansi
 gelombang425 nm larutan yaitu :
11 ppm ; 0.5317
12 ppm : 0.7277
13 pm ; 0.8687
3. Dibuat kurva kalibrasi kemudian dilihat hasil Didapatkan persamaan
dari regresi linier (r2) linear yaitu
y; 0.1685x-1.3127
r2: 0.9912
Akurasi

No. Prosedur Hasil

1 Disiapkan larutan standar 80%, 100% dan Larutan kuersetin standar
120% yaitu 11 12 dan 13 ppm dengan konsentrasi 11 12
13 ppm
2 Ke dalam abu10 ml ditambahkan maisng
masing 4 ml larutan sampel, 1 ml alcl3 : 0.5
ml asam asetat glasial serta 1 ml larutan
standar kuersetin dengan 3 konsentrasi ( 11 12
13 ppm)
3 Dihitung % recoverynya
Presisi
Presisi dilakukan dengan konsentrasi sama (100%) sebanyak 6 kali replikasi
No. Prosedur Hasil
1 Dilakukan pengkuran pada larutan standar 13 Didapatkan
ppm sebanyak 6 kali pengukuran absrobansinya yaitu :
menggunakan spektrofotometro uv vis pada 0.5131
panjang gelombang 425 nm 0.6272
0.5283
0.649
0.6263
0.658
2 Dihitung nilai RSD nya 3.0266646 %
Stabilitas
No. Prosedur Hasil
1 Dilakukan pengukuran kadar dengan Didapatkan absorbansi
konsentrasi 100% yaitu 13 ppm pada jam ke 1 jam ke
2 3 serta 24 jam
1: 0.7073
2 : 0.6568
3 : 0.5089
4 : 0.4014
 2 Dihitung konentrasi dari masing maisng jam Didapatkan konsentrasi
tersebut tpada jam tersebut

- LINEARITAS
Konsentrasi A1 A2 A3 ARata2
11 0.5389 0.5303 0.5258 0.5317
12 0.7323 0.7293 0.7214 0.7277
13 0.873 0.8648 0.8682 0.8687

Persamaan Linier Y = 0,1685x - 1,3127

R2 = 0,9912

- PRESISI
Absorbans Absorbans Absorbans Absorbans Konsentras (Xi-
Presisi i1 i2 i3 i rata2 i (Xi-Xav) Xav)^2
13 ppm
(1) 0.514 0.5102 0.5152 0.51 10.836 -0.3295417 0.1085977
13 ppm
(2) 0.5275 0.5256 0.5285 0.53 10.919 -0.24606 0.0605455
13 ppm
(3) 0.5274 0.5305 0.527 0.53 10.926 -0.2395318 0.0573755
13 ppm
(4) 0.6471 0.6495 0.6504 0.65 11.642 0.47678866 0.2273274
13 ppm
(5) 0.6288 0.6242 0.626 0.63 11.508 0.34226838 0.1171476
13 ppm
(6) 0.5648 0.5704 0.5688 0.57 11.161 -0.0039235 1.539E-05
Sigma(Xi-
11.165 Xav)^2 0.5710092
SD 0.3379376
%RSD 3.0266646
 - AKURASI

kadar sampel (sambiloto) + baku kuersetin

% ppm A1 A2 A3 Rata-rata kadar
80% 15 0,0495 0,0501 0,0523 0,050633333 8,090999011
100% 18 0,0447 0,0436 0,0477 0,045333333 8,059545005
120% 21 0,0522 0,0509 0,0513 0,051466667 8,095944609

Y = 0,1685x - 1,3127

kadar baku kuersetin

% ppm A1 A2 A3 Rata-rata kadar
85% 80 % 11 0,5389 0,5303 0,5258 0,531666667 10,94579624
92,30% 100 % 12 0,7323 0,7293 0,7214 0,727666667 12,10900099
100% 120 % 13 0,873 0,8648 0,8682 0,868666667 12,94579624

% recovery = C (sampel+spike) - C (sampel) / C (standar)

% recovery = 0,01580011 X 100 %
% recovery = 1,580011002

- STABILITAS
Jam ke- Absorbansi Rata-rata Kadar (ppm)
1 0.7095 0.7071 0.7053 0.7073 8.49780
2 0.6579 0.6548 0.6577 0.6568 8.44730
3 0.5095 0.5084 0.5087 0.5089 8.29937
24 0.4004 0.4019 0.4019 0.4014 8.19190
Persamaan Linier Y= 0.1685x - 1.3127
R = 0.9912
 - KADAR
1X 0,0165 0,0235 0,0218

KE 2 YANG INI AD PAKE ETANOL

y = 0.1685x -
0,0112 0,0108 0,0106 1.3127

0,010867
x 7,854995054 ppm
kadar 27963,78239 ppm (setelah dikali fp 3560)

VII. Simpulan
- Dari data linearitas, hasilnya linear karena koefisien korelasi yang didapat
sebesar r2=0,912
dengan persamaan Y = 0,1685x - 1,3127
- Akurasi yang didapat 1,58% yang berarti tidak akurat
- Presisi yang didapat 3,02% yang berarti tidak presissi
- Stabilitas pada ke empat waktu memiliki kadar yang sama, sehingga bisa
dikatakan stabil
- Kadar dari sampel yang dihasilkan 7,855 ppm, setelah dikalikan factor
pengenceran (3560) menjadi 27963,8 ppm
 DAFTAR PUSTAKA

Bahera S, Gharly S, Ahmad F, Santra S, Banerjee S. 2012. UV-Visible

Spectrophotometric Method Development and Validation of Assay of
Paracetamol Tablet Formulation. J. Anal Bioanal Techniques. 3 : 151.
Bakti, a., Liling T dan muhammad I. 2017. Penentuan kadar flavonoid total
dan uji antioksidan ekstrak etanol daun kasturi (mangifera casturi
kosterm.) Dengan metode DPPH. Jurnal pharmascience vol
04.No.01.
Basset, J. et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Commission, I. O. for S. E. (2005). ISO/IEC 17025, General Requirements for
the Competence of Testing and Calibration Laboratories. International
Organization for Standardization/International Electrotechnical
Commission, Geneva, Switzerland.
Das, N., Md. E. Islam., N. Jahan., M. S. Islam., A. Khan, md. R. Islam, & mst.
S. Parvin. 2014. Antioxidant activities of ethanol extracts and fractions
of crescentia cujete leaves and stembark and the involvement of
phenolic compounds. BMC complementary and alternative
medicine.14-45.
Day, R.A. & Underwood, A.L. 1999. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi 6.
Jakarta:Erlangga.
Harborne, J.B., T.J., dan Mabry, H., 1975, The Flavonoids, 421, Chapman and
Hall,London.
He, Yu. et al. Determination Of Quercetin, Plumbagin And Total Flavonoids
In Drosera Peltata Smith Var. Glabrata Y.Z.Ruan. Pharmacogn Mag.
2012 Oct-Dec; 8(32): 263267.
Patil, Vandana. Determination of Quercetin by UV Spectroscopy as Quality
Control Parameter in Herbal Plant: Cocculus hirsutus. Journal of
Chemical and Pharmaceutical Research, 2015, 7(1): 99-104.
Peshkova, V. M., & Gromova, M. I. (1961). Practical Handbook on
Spectrophotometry and Colorimetry. Izd-vo MGU, 147.
Rahman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha
Ilmu.
Sugihartini, Nining, dkk. Validasi Metode Analisa Penetapan Kadar
Epigalokatekin Galat Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Validation Method Of Quantitative Analysis Of Epigallocathecin
Gallat By High Performance Liquid Chromatography. Pharmaiana,
Vol. 4, No. 2, 2014: 111-115
Yuliani, S. L Udarno & E. Hayani. 2003. Kadar Tanin dan Quersetin Tiga
Tipe Daun Jambu Biji (Psidium Guajava). Buletin Tanaman
Rempah dan Obat. 14 (1):1724.