Anda di halaman 1dari 13

Validasi Metode Analisis Quercetin dalam Ekstrak Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis

Ayu Apriliani 260110140078

I. Tujuan Melakukan validasi untuk metode penentuan kadar kuersetin dalam ekstrak

dengan Spektrofotometer UV-Vis.

II.

Prinsip

2.1

Quercetin

Kuersetin adalah senyawa golongan flavonoid jenis flavonol dan flavon yang berkhasiat diantaranya untuk mengobati kerapuhan pembuluh kapiler pada manusia (Yuliani, 2003).

2.2 Validasi

Validasi merupakan kegiatan untuk melakukan konfirmasi melalui bukti-bukti pemeriksaan dan telah sesuai dengan tujuan pengujian. Validasi harus dilakukan terhadap metode non-standar dan metode yang dikembangkan laboratorium. Rentang ukur dan akurasi dapat diperoleh dari hasil validasi metode yang sesuai dengan kebutuhan customer (Commission, 2005).

2.3 Spektrofotometer UV-Vis

Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar energi yang diserap menyebabkan elektron tereksitasi dari orbital dasar ke orbital yang memiliki energi lebih tinggi. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan

absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan

linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Hukum Lambert-Beer:

berbanding terbalik dengan transmitan. Hukum Lambert-Beer: III. Reaksi (Peshkova & Gromova, 1961). IV. Teori Dasar

III. Reaksi

(Peshkova & Gromova, 1961).

Lambert-Beer: III. Reaksi (Peshkova & Gromova, 1961). IV. Teori Dasar (Harborne,1975) Kuersetin adalah polifenol

IV. Teori Dasar

(Harborne,1975)

Kuersetin adalah polifenol flavonoid yang mempunyai aktivitas antiinflamasi, antihepatotoksik, antiulker, antialergi, antidiabetes, antivirus dan antioksidan. Senyawa ini ditemukan pada banyak tanaman herbal seperti Cocculus hirsutus (Patil,

2015).

Dalam analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang masuk ke dalam daerah spektrum ultraviolet itu. Dari spektrum ini, dipilih panjang-panjang gelombang tertentu dengan lebar pita kurang dari 1 nm. Proses ini menggunakan instrumen yang disebut spektrofotometer. Alat ini terdiri dari spektrometer yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer

sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi

(Bahera et al., 2012).

Validasi terhadap suatu metode analisa menjadi faktor penting karena hanya metode analisa yang telah dibuktikan validitasnya maka hasil pengukurannya bisa dipertanggung jawabkan dan dipergunakan sebagai landasan dalam perhitungan berikutnya. (Sugihartini, 2014). Menurut USP ada 8 langkah dalam validasi metode analisis sebagaimana sebagai berikut: Validasi metode, Ketahanan, Kekasaran, Linieritas & Rentang, Spesifitasi, Batas deteksi, Akurasii, Presisi, Batas kuantifikasi. Sementara itu, ICH membagi karakteristik validasi metode yang sedikit berbeda berbeda dengan USP sebagaimana sebagai berikut: Validasi metode, Ketahanan, Kisaran, Linieritas, Spesifitas, Batas deteksi, Akurasi, Presisi, Batas Kuantifikasi, Kesesuaian Sistem (Rahman, 2009). Pembuatan Kurva kalibrasi dilakukan untuk mengevaluasi hubungan linier antara daerah puncak dan konsentrasi kuersetin. Slope, intercept, dan koefisien determinasi (r2) dihitung sebagai parameter regresi dengan regresi linier berbobot (He at al., 2012). Hukum Lambert-Beer menjadi dasar aspek kuantitatif spektrofotometri dimana konsentrasi dapat dihitung berdasarkan rumus di atas. Absorptivitas (a) merupakan konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi (Day, 1999).

V.

Alat dan Bahan

5.1 Alat

1. Neraca analitik

5.2 Bahan

2. Labu ukur

1.

AlCl3

3. Spatel

2.

Buffer Asetat pH 3,8

4. Kaca arloji

3.

Ekstrak Sampel

5. Pipet tetes

4.

Metanol

6. Pipet volume

5.

Ultra-pure water

7. Spektrofotometer UV-Vis

VI. Data Pengamatan

Pembuatan pereaksi

 

Tujuan : Membuat sejulah pereaksi yang digunakan dalam analisis

 

AlCl3 2%

No.

Prosedur

 

Hasil

1

Memasukkan sebanyak 10 gram aluminium klorida ke dalam labu ukur 100 mL

Didapatkan alumunium klorida dalam labu ukur

2

Menambahkan asam asetat 5% dalam metanol 25 mL ke dalam labu ukur

Didapatkan campuran alumunium klorida dan pelarut dalam labu ukur

3

Melakukan degassing selama 5 menit

Didapatkan labu ukur yang tidak berisi gas berlebih

4

Menambahkan asam asetat 5% dalam metanol ke dalam labu ukur sampai tanda

Didapatkan alumunium klorida dengan konsentrasi

2%

5

   

Asam setat glasial 5% (v/v)

 

No.

Prosedur

 

Hasil

1

Memasukkan asam asetat glasial 25 mL ke dalam labu 500 mL

Didapatkan asam asetat glasial dalam labu ukur

2

Menambahkan metanol ke dalam labu hingga tanda batas

Didapatkan asam asetat glasial dengan konsentrasi

5%

3

   

4

   

5

   

HCl 25% (v/v)

 

No.

Prosedur

 

Hasil

1

Mengambil HCl 12 N sebanyak 6,79 mL

Didapatkan

HCl

dengan

volume tersebut

2

Menambahkan air suling sebanyak 3,9 mL

Didapatkan campuran HCl dan air suling

3

Mengocok larutan hingga diperkirakan merata

Didapatkan konsentrasi HCl 25% yang homogen

4

   

5

   

Preparasi sampel

 

Tujuan : Hidrolisis glikosida kuersetin

 

No.

Prosedur

 

Hasil

1

Menimbang ekstrak pekat sebanyak 200 mg

Didapatkan ekstrak pekat dengan berat tersebut

2

Memasukkan ekstrak ke dalam labu alas bulat

Didapatkan ekstrak dalam labu alas bulat

3

Menambahkan larutan hidrolisis yaitu heksametilentetramina 1 Ml 0,5% (b/v), 20 mL aseton, dan 2 mL HCl 25% (v/v).

Didapatkan campuran larutan dalam labu

4

Melakukan refluks pada bahan selama 30 menit

Terjadi

pemisahan

komponen

5

Menyaring campuran hasil hidrolisis menggunakan kapas ke dalam labu ukur 100 mL

Hasil hidrolisis tersaring

6

Melakukan refluks kembali pada residu degan 20 mL aseton selama 30 menit

Terjadi

pemisahan

yang

lebih spesifik

7

Menyaring hasil refluks ke-dua dan mencampurkannya ke dalam fultrat dalam labu ukur 100 mL

Hasil hidrolisis tersaring

8

Manambahkan aseton ke dalam campuran filtrat sampai volume 100 mL kemudian dikocok hingga tercampur sempurna

Didapatkan

larutan

yang

homogen

9

Mengambil sebanyak 20 mL filtrat kemudian memasukannya ke dalam corong pisah

Terdapat

filtrat

dalam

corong pisah

10

Menambahkan akuades sebanyak 20 mL

Didapatkan campuran akuades dan filtrat

11

Mengekstraksi sebanyak tiga kali maisng-masing dengan 15 mL etil asetat

Didapatkan fraksi etil asetat

12

Mencampurkan fraksi etil asetat ke dalam labu ukur 50

Didapatkan campuran fraksi etil asetat dalam labu

mL

13

Menambahkan etil asetat sampai volume labu

Didapatkan fraksi semi polar dimana terdapat kuersetin didalamnya

Pengukuran kadar Total Flavonoid Content (TFC)

 

Tujuan : Mengukur kadar flavonoid dalam ekstrak sebagai kuersetin

 

No.

Prosedur

 

Hasil

1

Memindahkan 10 mL fraksi etil asetat ke dalam labu ukur 25 mL

Didapatkan fraksi etil asetat dalam labu ukur

2

Menambahkan 1 mL larutan AlCl 3 2%

Didapatkan campuran fraksi dengan alumunium klorida

3

Menambahkan larutan asam asetat glasial 5% (v/v) secukupnya sampai tepat 25 mL

Didapatkan campuran ketiga komponen

4

Menyiapkan larutan blangko dengan memindahkan 10

Didapatkan blanko tanpa sampel. Didapatkan kadar 4.63%

mL

etil asetat dan ditambahkan asam asetat glasial 5%

(v/v) sampai tepat 25 mL

Pembuatan kurva standar

No.

Perlakuan

Hasil

1.

Ditimbang 10 mg baku standar kuersetin dan dilarutkan dalam 10 ml etanol (1000 ppm)

Didapatkan larutan stok kuersetin 1000 ppm

2.

Dipiet 1 ml dan dilarutkan dalam 10 ml metanol (100 ppm).

Larutan stok diencerkan

3.

Dibuat beberapa konsentrasu yaitu 11. 12 dan 13 ppm

Didiapat pengenceran larutan stok engan konsentrasi 11 12

13

ppm

4.

Masing masing larutan ditambhkan 1 ml Alcl3 10%,

Didapatkan larutan stok yang terkompleks dengan reagen

0,5

ml asam asetat dan di add dengan etanol sampai

10 ml

 

5.

Didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar

Larutan berubah menjadi warna kuning cerah

6.

Dibuat blanko dengan melarutkan 1 ml alcl3 10%, 0.5 ml asam asetat (pH 3.8) dan di add dengan etanol sampai 10 ml

Didapatkan blanko

7.

Diukur absorbansinya padapanjang gelombang425 nm

Didapat absorbansi larutan yaitu :

11 ppm ; 0.5317

12 ppm : 0.7277

13 ppm ; 0.8687

8.

Dibuat kurva kalibrasi kemudian dilihat hasil dari regresi linier (r2)

Didapatkan persamaan linear yaitu y; 0.1685x-1.3127 r2: 0.9912

Validasi

Tujuan : Menentukan parameter validasi

 

Linearitas

No.

Prosedur

Hasil

 

1

Diambil larutan stok lalu diencerkan pada variasi konsentrasi 11 12 dan 13 ppm

Didapatkan

larutan

pengenceran

11

12

13

 

ppm

2

Diukur absorbansinya padapanjang

Didapat absorbansi

 
 

gelombang425 nm

larutan yaitu :

11 ppm ; 0.5317

12 ppm : 0.7277

 

13

pm ; 0.8687

3.

Dibuat kurva kalibrasi kemudian dilihat hasil dari regresi linier (r2)

Didapatkan persamaan linear yaitu y; 0.1685x-1.3127 r2: 0.9912

Akurasi

No.

 

Prosedur

 

Hasil

1

Disiapkan larutan standar 80%, 100% dan 120% yaitu 11 12 dan 13 ppm

Larutan kuersetin standar dengan konsentrasi 11 12

13

ppm

 

2

Ke

dalam abu10 ml ditambahkan maisng

 

masing 4 ml larutan sampel, 1 ml alcl3 : 0.5

ml

asam asetat glasial serta 1 ml larutan

standar kuersetin dengan 3 konsentrasi ( 11 12 13 ppm)

3

Dihitung % recoverynya

 

Presisi

Presisi dilakukan dengan konsentrasi sama (100%) sebanyak 6 kali replikasi

No.

 

Prosedur

 

Hasil

1

Dilakukan pengkuran pada larutan standar 13 ppm sebanyak 6 kali pengukuran menggunakan spektrofotometro uv vis pada panjang gelombang 425 nm

Didapatkan

absrobansinya yaitu :

0.5131

 

0.6272

 

0.5283

0.649

0.6263

0.658

2

Dihitung nilai RSD nya

3.0266646 %

Stabilitas

No.

 

Prosedur

 

Hasil

1

Dilakukan pengukuran kadar dengan konsentrasi 100% yaitu 13 ppm pada jam ke 1 2 3 serta 24 jam

Didapatkan absorbansi jam ke

1: 0.7073

 
 

2 : 0.6568

3 : 0.5089

4 : 0.4014

2

Dihitung konentrasi dari masing maisng jam tersebut

Didapatkan konsentrasi tpada jam tersebut

-

LINEARITAS

 

Konsentrasi

A1

A2

A3

ARata2

11 0.5389

0.5303

0.5258

0.5317

12 0.7323

0.7293

0.7214

0.7277

13 0.873

0.8648

0.8682

0.8687

Persamaan Linier

Y = 0,1685x - 1,3127 R2 = 0,9912

0.8687 Persamaan Linier Y = 0,1685x - 1,3127 R2 = 0,9912 - PRESISI   Absorbans Absorbans

- PRESISI

 

Absorbans

Absorbans

Absorbans

Absorbans

Konsentras

 

(Xi-

Presisi

i 1

i 2

i 3

i rata2

i

(Xi-Xav)

Xav)^2

13

ppm

             

(1)

0.514

0.5102

0.5152

0.51

10.836

-0.3295417

0.1085977

13

ppm

             

(2)

0.5275

0.5256

0.5285

0.53

10.919

-0.24606

0.0605455

13

ppm

             

(3)

0.5274

0.5305

0.527

0.53

10.926

-0.2395318

0.0573755

13

ppm

             

(4)

0.6471

0.6495

0.6504

0.65

11.642

0.47678866

0.2273274

13

ppm

             

(5)

0.6288

0.6242

0.626

0.63

11.508

0.34226838

0.1171476

13

ppm

             

(6)

0.5648

0.5704

0.5688

0.57

11.161

-0.0039235

1.539E-05

   

Sigma(Xi-

 

11.165

Xav)^2

0.5710092

 

SD

0.3379376

%RSD

3.0266646

- AKURASI

kadar sampel (sambiloto) + baku kuersetin

%

 

ppm

A1

A2

A3

Rata-rata

kadar

80%

 

15

0,0495

0,0501

0,0523

0,050633333

8,090999011

100%

 

18

0,0447

0,0436

0,0477

0,045333333

8,059545005

120%

 

21

0,0522

0,0509

0,0513

0,051466667

8,095944609

Y = 0,1685x - 1,3127

 

kadar baku kuersetin

%

 

ppm

A1

A2

A3

Rata-rata

kadar

85%

80 % 11

0,5389

0,5303

0,5258

0,531666667

10,94579624

92,30%

100

% 12

0,7323

0,7293

0,7214

0,727666667

12,10900099

100%

120

% 13

0,873

0,8648

0,8682

0,868666667

12,94579624

%

recovery = C (sampel+spike) - C (sampel) / C (standar)

 

%

recovery = 0,01580011 X 100 %

 

%

recovery = 1,580011002

 

- STABILITAS

Jam ke-

 

Absorbansi

Rata-rata

Kadar (ppm)

1

0.7095

0.7071

0.7053

 

0.7073

8.49780

2

0.6579

0.6548

0.6577

 

0.6568

8.44730

3

0.5095

0.5084

0.5087

 

0.5089

8.29937

24

0.4004

0.4019

0.4019

 

0.4014

8.19190

Persamaan Linier

Y= 0.1685x - 1.3127 R = 0.9912

 

-

1 X

KADAR

0,0165

0,0235

0,0218

- 1 X KADAR 0,0165 0,0235 0,0218 KE 2 YANG INI AD PAKE ETANOL    

KE 2

YANG INI AD PAKE ETANOL

   
 

y = 0.1685x -

 

0,0112

0,0108

0,0106

1.3127

 

0,010867

x

7,854995054

ppm

kadar

27963,78239

ppm

(setelah dikali fp 3560)

VII. Simpulan - Dari data linearitas, hasilnya linear karena koefisien korelasi yang didapat sebesar r2=0,912 dengan persamaan Y = 0,1685x - 1,3127

- Akurasi yang didapat 1,58% yang berarti tidak akurat

- Presisi yang didapat 3,02% yang berarti tidak presissi

- Stabilitas pada ke empat waktu memiliki kadar yang sama, sehingga bisa

dikatakan stabil

- Kadar dari sampel yang dihasilkan 7,855 ppm, setelah dikalikan factor pengenceran (3560) menjadi 27963,8 ppm

DAFTAR PUSTAKA

Bahera S, Gharly S, Ahmad F, Santra S, Banerjee S. 2012. UV-Visible Spectrophotometric Method Development and Validation of Assay of Paracetamol Tablet Formulation. J. Anal Bioanal Techniques. 3 : 151. Bakti, a., Liling T dan muhammad I. 2017. Penentuan kadar flavonoid total dan uji antioksidan ekstrak etanol daun kasturi (mangifera casturi kosterm.) Dengan metode DPPH. Jurnal pharmascience vol

04.No.01.

Basset, J. et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Commission, I. O. for S. E. (2005). ISO/IEC 17025, General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories. International Organization for Standardization/International Electrotechnical Commission, Geneva, Switzerland. Das, N., Md. E. Islam., N. Jahan., M. S. Islam., A. Khan, md. R. Islam, & mst. S. Parvin. 2014. Antioxidant activities of ethanol extracts and fractions of crescentia cujete leaves and stembark and the involvement of phenolic compounds. BMC complementary and alternative

medicine.14-45.

Day, R.A. & Underwood, A.L. 1999. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi 6. Jakarta:Erlangga. Harborne, J.B., T.J., dan Mabry, H., 1975, The Flavonoids, 421, Chapman and Hall,London. He, Yu. et al. Determination Of Quercetin, Plumbagin And Total Flavonoids In Drosera Peltata Smith Var. Glabrata Y.Z.Ruan. Pharmacogn Mag. 2012 Oct-Dec; 8(32): 263267. Patil, Vandana. Determination of Quercetin by UV Spectroscopy as Quality Control Parameter in Herbal Plant: Cocculus hirsutus. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2015, 7(1): 99-104. Peshkova, V. M., & Gromova, M. I. (1961). Practical Handbook on Spectrophotometry and Colorimetry. Izd-vo MGU, 147. Rahman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu.

Sugihartini, Nining, dkk. Validasi Metode Analisa Penetapan Kadar Epigalokatekin Galat Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Validation Method Of Quantitative Analysis Of Epigallocathecin Gallat By High Performance Liquid Chromatography. Pharmaҫiana, Vol. 4, No. 2, 2014: 111-115 Yuliani, S. L Udarno & E. Hayani. 2003. Kadar Tanin dan Quersetin Tiga Tipe Daun Jambu Biji (Psidium Guajava). Buletin Tanaman Rempah dan Obat. 14 (1):1724.