LAPORAN PRAKTIKUM KI3261

METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

PERCOBAAN 07
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI DNA
DENGAN TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Nama : Aviv Sigit Cahyono

NIM : 10513035
Kelompok : Kelompok I
Tanggal Percobaan : 12 April 2017
Tanggal Pengumpulan : 19 April 2017
Asisten : Yessy

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
 Isolasi dan Amplifikasi DNA
Dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

Aviv Sigit Cahyono

NIM : 10513035
Kelompok : 01
Asisten : Yessy
avivsigitcahyono@gmail.com

Abstrak

(Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara
in vitro. Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah DNA cetakan, Oligonukleotida
primer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dan Komponen pendukung
lain adalah senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah
mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan
mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu
terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengn cepat yaitu denaturasi, anneling, dan pemanjangan
untai DNA. Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis
gel agarosa. Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya : PCR- RFLP, PCR –
RAPD, nested- PCR,Quantitative – PCR, RT- PCR dan inverse – PCR. Keunggulan PCR dikatakan
sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya.

Kata kunci: PCR, In vitro, Elektroforesis, Teknik PCR

Abstract

(Polymerase Chain Reaction, PCR) is an enzymatic method for the amplification of DNA by
means of in vitro. In the PCR process takes several main components is DNA template,
oligonucleotide primers, Deoksiribonukelotida triphosphate (dNTP), DNA polymerase
enzymes, and other supporting components are buffer compounds. In using the PCR process
using termosiklus tool. A machine that has the ability to heat the reaction tube at once cool
and regulate the temperature for each stage of the reaction. There are three important stages
in the process of PCR which always recur in cycles and lasts 30-40 with less rapid namely
denaturation, anneling, and elongation of DNA strands. PCR products can be identified by its
size using agarose gel electrophoresis. The PCR technique can be modified into several types
including: PCR- RFLP, PCR - RAPD, PCR nested-, Quantitative- PCR, RT-PCR and inverse
- PCR. The advantages of PCR said to be very high. It is based on the specificity, efficiency
and accuracy.

Keywords: PCR, In vitro, Electrophoresis, PCR technique

1. PENDAHULUAN DNA polymerase dengan keberadaan

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu
teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi bagian
DNA tertentu yang berada di anatra dua bagian
urutan DNA dan ditemukan oleh Kary Mullis pada
1985. Penemuan ini mengantarkan Kary Mullis
menerima hadiah nobel kimia pada 1993 (Newton,
1997). 16S rDNA adalah suatu gen yang mengkode
16 rRNA, yaitu: suatu komponen 30S dari ribosom.
Isolasi gen 16S rDNA dilakukan dengan
mengamplifikasi urutan nukleotida gen dengan
teknik PCR. Amplifikasi DNA dengan PCR dapat
dilakukan menggunakan primer oligonukleotida
atau disebut juga amplimer. Primer ini adalah suatu
molekul DNA untai tunggal pendek yang
berkomplemen dengan ujung urutan DNA templat.
Primer akan diperpanjang pada DNA templat oleh
deoksinukleosida trifosfat (dNTPs). Proses ini akan
menghasilkan rantai DNA baru yang
berkomplemen dengan rantai templat sehingga
menghasilkan rantai DNA untai ganda baru.
Sintesis rantai DNA dapat diulang melalui proses
denaturasi termal molekul DNA untai ganda,
penempelan primer pada DNA dan perpanjangan
primer oleh DNA polimerase pada temperatur yang
sesuai dengan kerja enzim. Pada prokaryota
terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S,
dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA
yang paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA
memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak
ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul
23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier
yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis.
Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi
 prosedur baku untuk menentukan hubungan
filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem. 16S
rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler
karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi
yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini
juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya,
sehingga dapat digunakan sebagai kronometer
evolusi yang baik. Dua molekul 16S rRNA
memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan
basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah
urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa
yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi
pohon filogenetik universal karena mengalami
perubahan relatif lambat dan mencerminkan
kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa
yang bersifat variatif dapat digunakan untuk
melacak keragaman dan menempatkan galur-galur
dalam satu spesies. Saat ini dikembangkan metode
identifikasi berbasis molekuler yang lebih cepat
dengan tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang
tinggi, yaitu dengan analisis sekuensing gen 16S
rRNA (16S ribosomal Ribonucleic acid/Asam
ribonukleat pengkode ribosom 16S, S menyatakan
Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom). Gen 16S
rRNA juga sering disebut sebagai 16S rDNA (16S
ribosomal deoxyribose nucleatic acid), namun
menurut konsensus dari American Society for
Microbiology (ASM), istilah 16S rRNA dinilai
lebih tepat. Tujuan percobaan ini adalah
mengisolasi dan memperbanyak fragmen gen 16S
rDNA dari koloni tunggal dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan menentukan
massa molekul fragmen gen 16S rDNA dengan
metode elektroforesis gel agarosa.
dalam tabung 3 sebagai kontrol positif. Lalu,
dimasukkan semua tabung ke dalam mesin PCR.
C. Elektroforesis Agarosa
Elektroforesis agarosa dilakukan untuk
menganalisis ukuran fragmen DNA. Gel agarosa
dibuat dengan melarutkan 0,75% agarosa ke dalam
buffer TAE 1x (Tris-asetat 0,04 M; Na2EDTA 0,001
M pH 8) dengan cara pemanasan. Digunakan
larutan hingga suhu -50°C. kemudian ditambahkan
EtBr sebanyak 0,5 μL. Larutan ditunangkan ke
dalam cetakan gel dan dibiarkan hingga membeku.
Setelah beku, gel diletakkan ke dalam alat
elektroforsis (Bio-Rad) kemudian diisi dengan
buffer TAE 1x hingga tanda batas. Sampel yang
akan di elektroforesis disiapkan dengan
mencampurkan larutan sampel dan larutan
pemberat (bromfenol biru 0,1 (b/v) dan sukrosa
40% (b/v)) dengan poerbandingan volum 5:1.
Pencampuran dilakukan di atas lembar parafilm.
Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 V
selama 35 menit.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengamatan

2. METODE PERCOBAAN

A. Lisis sel bakteri

Sebanyak 40 μL ddH2O steril dipipet ke dalam
tabung mikro 1,5 mL. Bakteri diinokulasi dari
cawan petri menggunakan tusuk gigi steril ke dalam
tabung yang telah berisi air trsebut. Lalu didihkan
campuran sampel selama 10 menit menggunakan Pembahasan
penangas air. Didiamkan sampel sampai suhunya Pada percobaan ini, dilakukan isolasi dan
sama dengan hingga suhu ruang. Dilakukan memperbanyak fragmen gen 16S rDNA dari koloni
sentrifuga sampel dengan kecepatan 12.000 x g tunggal dengan menggunakan teknik Polymerase
selama 1 menit. Diambil supernatannya dan Chain Reaction (PCR). 16S rDNA adalah subunit
dipisahkan ke alam tabung mikro yang steril. ribosom yang dapat digunakan sebagai pembeda,
penanda dan sebagai tanda evolusi pada bakteri.
B. Amplifikasi DNA dengan PCR
Molekul ini dapat berubah sesuai dengan waktu
Supernatan yang telah diperoleh digunakan
evolusinya sehingga dapat digunakan sebagai
sebagai DNA templat. Dipipet campuran reaksi 4x
kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rDNA
didalam tabung mikro 200 μL kemudian disiapkan
memiliki susunan basa yang relatif konservatif dan
3 tabung mikro 200 μL, aliquot 24,55 μL ke dalam
juga variatif. Urutan basa yang variatif ini dapat
masing-masing tabung dari campuran reagen yang
digunakan untuk mengetahui keragaman galur-
tlah dibuat. Dimasukkan 0,5 μL DNA tempalt ke
galur dalam satu spesies. Gen 16s rDNA yang
dalam tabung 1 (sampel), ddH2O dalam tabung 2
diisolasi berasal dari E. coli yang memiliki jumlah
sebagai kontrol negatif, dan DNA kromosom ke
pasang basa sekitar 1500. E. coli merupakan salah
satu bakteri yang termasuk bakteri gram negatif.
Gram negatif adalah bakteri yang akan berwarna
merah atau merah muda ketika proses pewarnaan
gram, sedangkan gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna violet ketika proses
pewarnaan gram (Madigan, 2006).
Gen 16S rRNA adalah gen yang bersifat lestari
(conserved) dan dijumpai pada setiap organisme.
Struktur yang lestari ini menyebabkan gen 16S
rRNA dapat digunakan dalam PCR dan analisis
sekuensing. Dalam struktur gen ini terdapat
sejumlah basa yang disebut hypervariable region
untuk merupakan ciri khas yang membedakan tiap
organisme. Gen pengkode rRNA adalah gen yang
mampu mempertahankan kelestariannya selama
jutaan tahun keanekaragaman evolusi. Sebagian
besar prokariot memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5S,
16S dan 23S. Penggunaan 5S rRNA juga sudah
dipelajari namun gen ini terlalu kecil untuk
digunakan dalam penentuan filogenetik. Gen 16S
dan 23S rRNA memiliki ukuran yang cukup untuk
dianalisis. Gen 16S rRNA berukuran sekitar 1550
pasang basa dan sekitar 500 basa di bagian ujung
sekuens merupakan daerah yang disebut dengan
hypervariable region. Daerah inimerupakan bagian
yang membedakan antar organisme. Primer yang
digunakan dalam amplifikasi sekuens akan
mengenali daerah yang lestari dan mengamplifikasi
hypervariable region, dengan demikian akan
diperoleh sekuens yang khas pada organisme
tersebut.
PCR adalah teknik amplifikasi DNA secarain
vitro yang dikembangkan oleh Karry Mullis.
Dengan menggunakan teknik ini dapat pula
dilakukan amplifikasi segmen DNA dalam juta-
jutaan kali hanya dalam beberapa jam (Handoyo,
2000). Daerah yang diperbanyak dibatasi oleh dua
buah primer oligonukleotida. Pada teknik ini
dibutuhkan DNAuntai ganda yang berfungsi
sebagai cetakan yang mengandung DNA target
untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim
DNA polierase, deoksinukleosida trifosfat (dNTPs)
dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi
tertentu, primer akan mengenali dan berikatan
dengan untaian DNA komplemennya yang terletak
pada awal dan akhir fragmen DNA target. Setelah
kedua primer menempel pada DNA templat, DNA
polimerase akan mengkatalisis pemanjangan kedua
primer dengan menambahkan nukleotida yang
komplemen dengan urutan DNA templat. DNA
polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan
fosfat pada 5’ DNTP yang ditambahkan. Oleh
karena itu, proses penambahan DNTP berlangsung
dengan arah 5’ ke 3’. Dalam prosesnya PCR
melibatkan beberapa teknik yaitu yaitu pre-
denaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat,
penempelan primer, pemanjangan primer,
pemantapan (post extension). Tahap kedua hingga
keempat merupakan tahapan berulang (siklus).
Denaturasi atau pemisahan ikatan untai ganda DNA
dilakukan dengan menaikkan suhu pada 95-98oC
sehingga dihasilkan dua untai tunggal DNA.
Apabila dalam DNA target mengandung banyak
nukleotida G atau C, suhu denaturasi dapat
ditingkatkan. Dua untai DNA yang dihasilkan ini
akan digunakan sebagai templat. Penempelan
primer terjadi pada kondisi suhu yang diturunkan
menjadi 37-50oC tergantung dari DNA yang
digunakan. Penurunan suhu ini berfungsi untuk
mengikatkan primer dengan untai tunggal DNA
templat yang berkomplemen dengan primer
tersebut. Perpanjangan primer dengan
memanfaatkan DNA polimerase, enzim ini dapat
mensintesis komplemen dari untai tunggal DNA
dari ujung 3’ yang didahului dengan proses
penempelan primer. Pada tahap ini suhu dinaikkan
hingga 72oC. Akhir dari siklus pertama ini adalah
dihasilkan dua untai ganda DNA. Pada percobaan
ini tahapan reaksi PCR digunakan suhu 95 oC
sebagai suhu predenaturasi untuk menyakinkan
bahwa molekul DNA target yang ingin dilipat
gandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi.
Kemudian 48oC untuk anneling dan 72oC untuk
pemanjangan rantai primer. Sedangkan suhu 95 oC
yang kedua adalah suhu untuk memisahkan untai
ganda DNA pada siklus-siklus selanjutnya dan 72 oC
yang kedua adalah untuk mengecek kembali urutan
basa DNA ketika polimerisasi berjalan. Jumlah kopi
fragmen DNA (amplikon) yang dihasilkan dengan
menggunakan teknik PCR ini dapat ditentukan
dengan perumusan: Y = ( 2n– 2n), dimana XX =
jumlah molekul DNA templat awal; n = jumlah
siklus; Y = jumlah amplikon.
Siklus PCR yang terjadi sebagai berikut:
1). Denaturasi, 2). Annealing dan 3). Elongasi,
4). Siklus pertama selesai

Dalam melakukan percobaan dengan teknik
PCR ini digunakan beberapa reagen yaitu DNA
templat, primer maju (primer forward), primer
mundur (primer reverse), ddH2O, dream Taq
polymerase, dNTP dan Buffer dream Taq
polymerase. DNA templat sebagai cetakan dalam
pembentukan molekul DNA baru, DNA templat ini
dapat diperoleh dengan menggunakan metode lisis
sel adalah perusakan dinding sel namun tanpa
merusak DNA yang menjadi target. Dalam
percobaan yang dilakukan lisis sel dilakukan
dengan penambahan air, pemanasan dan
pengadukan secara makanik. Namun tidak hanya
itu, metode lisis juga dapat dilakukan dengan
menggunakan buffer lisis, komposisi yang
digunakan tergantung pada jenis sampel. Contoh
buffer lisis adalah buffer K yang memiliki
komposisi buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-
Cl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100
ug/mL Proteinase-K. Cara lain adalah isolasi DNA
kromosom atau plasmid adalah dengan memecah
dinding sel kemudian DNA kromosom atau plasmid
dipisahkan dari komponen lain sehingga memiliki
kemurnian yang tinggi.
Primer yang digunakan dalam percobaan kali ini
adalah primer maju (primer forward), primer
mundur (primer reverse). Primer mundur memiliki
urutan 5'-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3' dan
primer maju memiliki urutan 5'-
AGAGTTTGATC(A/C) TGGCTCAG-3'
(Nurachman, 2010). Primer ini akan menempel
padaujung untai tunggal DNA templat. Setelah itu
primer akan mengalami polimerisasi dari tempat
penempelannya pada 3’ ke 5’ DNA templat.
Sehingga pada akhirnya akan diperoleh dua pasang
untai ganda DNA apabila DNA templat sebelumnya
berupa sepasang untai DNA. Untuk proses
penempelan primer perlu ada perancangan terlebih
dahulu, apabil urutan DNA yang dituju belum
diketahui maka dapat dilakukan analisis homologi
dari urutan DNAyang memiliki kekerabatan
terdekat. Perancangan primer harus memenuhi
beberapa kriteria yaitu panjang primer, komposisi
primer, titik leleh. Primer yang digunakan biasanya
berkisar 18-30 basa. Apabila digunakan primer
yang pendek maka kemungkinan terjadinya
mispriming (penempelan primer pada tempat yang
salah) akan tinggi yang akan mempengaruhi
efisiensi proses PCR, sedangkan bila digunakan
primer panjang (lebih dari 30 basa) tidak akan
meningkatkan spesifisitas primer.
Dalam percobaan ini digunakan ddH2O (aqua
bidestilasi atau ultra pure water) namun sebenarnya
juga dapat menggunakan buffer TAE yang
merupakan campuran antara larutan Tris-HCl
dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Keduanya
dapat dilakukan untuk melarutkan DNA atau RNA.
DNA akan lebih stabil apabila dilarutkan dalam
TAE buffer karena dijaga pada pH 8. Jika
menggunakan ddH2O akan menimbulkan
perubahan pH karena DNA memiliki sifat asam
lemah dan dapat menyebbakan degradasi DNA.
Namun, dalam kasus penggunaan PCR ddH2O
lebih unggul karena tidak mengandung chelating
agent, sedangkan TAE buffer mengandung EDTA
yang dapat berkompleks dengan ion Mg2+ sehingga
mengganggu kerja enzim Taq polymerase.
Pada enzim polimerase DNA yang digunakan
dalam percobaan ini adalah dream Taq polymerase
yang diisolasi dari bekteri Thermus aquaticus.
Enzim ini berfungsi sebagai katalis untuk reaksi
polimerisasi DNA. Enzim yang digunakan untuk
PCR berasal dari bakteri termofilik dan hiper
termofilik sehingga bersifat termostabil sampai
temperature 95oC. Deoxynucleotide triphosphates
(dNTPs) terdiri dari dATP, dTTP, dCTP dan dGTP
yang bertindak sebagai building block DNA dan
diperlukan dalam proses perpanjangan. dNTP akan
menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari
primer dan memebentuk untai baru yang
berkomplemen dengan untai DNA templat
(Handoyo, 2000). Buffer dream Taq polymerase
berfungsi untuk menjaga pH medium karena
reaksidalam PCR hanya akan berlangsung pada
kondisi pH tertentu. Pada percobaan ini juga
ditambahkan MgCl2 karena untuk menstimulasi
aktivitas DNA polimerase membutuhkan Mg 2+
sebagai kofaktor yang berikatan dengan sisi aktif
dari enzim yaitu gugus karboksilat pada residu
aspartat. Interaksi primer dengan templat akan
meningkat dan membentuk kompleks yang larut amplifikasi. Marker DNA yang berda pada
dengan dNTP. elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan pasangan basa dari molekul. Metode elektroforesis
untuk memisahkan kemampuan atau molekul sebagai berikut:
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini digunakan untuk
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul. Prinsip gel elektroforesis agarosa
adalah suatu elektroforesis DNA dimana teknik
untuk memisahkan sampel dna berdasarkan berat
molekul ddan struktur fisik molekulnya. Molekul
DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan
listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju
kutub positif. Digunakan gel agaraosa karena
memiliki kemampuan untuk menampung fragmen
yang lebih besar dan bertindak sebagai medium
penyongkong dalam proses elektroforesis.
Kecepatan migrasi suatu molekul bergantung pada Pada percobaan ini digunakan EtBr, dimana
muatan listrik, massa DNA, dan titik isoelektrik. EtBr adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik
Gel elektroforesis yang sering digunakan adalah gel sehingga harus berhati-hati di dalam
poliakrilamida berfungsi untuk memurnikan menggunakannya. EtBr berfungsi sebagai pewarna
penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil fluoresensi digunakan untuk alat identifikasi dan
ekstensi primer. Pada percobaan ini digunakan, gel mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang
agarosa karena gel agarosa mampu untuk terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara
memisahkan fragmen DNA yang berukuran besar. dua untai ganda DNA sehingga band DNA dalam
Proses running elektroforesis DNA sampel gel agarosa akan berpedar karena pewarna ini
bersamaan dengan DNA yang telah diketahui mengandung zat fluresence. Intensitas fluoresence
ukurannya dapat berguna dalam analisis. Fungsi dapat diukur dengan menggunakan DNA marker
TAE adalah sebagai running buffer dan merupakan standard sehingga diperkirakan kuantitas DNA-
buffer umum digunakan sebagai buffer Nya.
Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui
elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering
kondisi reagen sehingga pada hasil elektrolisis
yang tinggi pada titik isoelektriknya. Tae buffer
seharusnya tidak diperoleh suatu pita DNA. Kontrol
mengandung komposisi di dalam pembuatannya,
positif berfungsi untuk mengetahui pita yang
yakni: Tris-asetat, EDTA, pH 8. Tri-asetat berfungsi
merupakan pita DNA sampel karena DNA
untuk membuat DNA tetap berada dalam bentuk
kromosom yang digunakan sudah diisolasi
bermuatan negatif. Fungsi EDTA adalah sebagai
sebelumnya sehingga seharusnya pada hasil
pengikat-pengikat logam dan menonaktifkan
elektroforesis diperoleh suatu pita DNA. Didalam
DNAse, yakni enzim pemutus DNA. Loading
kontrol positif dimasukkan DNA komosom
buffer berfungsi untuk membantu proses sampel
sehingga sampel yang di analisis di PCR akan
DNA turun ke dalam well dan bromfenol berfungsi
teramplikasi dan muncum. Sedangkan kontrol
untuk melihat jalannya elektroforesis dan sebagai
negatif dimasukkan ddH2O, sampel yang diketahui
pewarna. Sukrosa berfungsi untuk pemberat agar
apabila di PCR harusnya tidak akan muncul.
sampel DNA tenggelam ke dasar gel dan tidak
Apabila kontrol positif tidak muncul maka ada yang
melayang keluar. DNA yang akan dielektroforesis
salah pada alat PCR, mungkin master mix kappa
pada umumnya dicampur dengan loading dye yang
yang dibuat ada yang salah, enzimnya tidak masuk
berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis.
atau enzim yang digunakan udah rusak dan
Loading dye bermigrasi bersama molekul DNA
sebagainya. Jika kontrol negatif yang muncul
selama proses runnning elektroforesiss. Marker
berarti sampelnya terkontaminasi.
adalah segmen DNA yang spesifik dan telah
Pada percobaan ini, digunakan EtBr. EtBr
diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai
adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik
acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
sehingga harus berhati-hati di dalam
menggunakannya. EtBr berfungsi sebagai pewarna
fluoresensi digunakan untuk alat identifikasi dan
mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang
terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara
dua untai ganda DNA sehingga band DNA dalam
gel agarosa akan berpedar karena pewarna ini
mengandung zat fluresence. Intensitas fluoresence
dapat diukur dengan menggunakan DNA marker
standard sehingga diperkirakan kuantitas DNA-
Nya.
Dari hasil elektroforesis agarosa diperoleh pita
DNA untuk kontrol positif dan marker pita DNA
yang tidak terlalu jelas. Untuk kontrol negatif pita
DNA tidak muncul sehingga kontrol negatif tidak
terkontaminasi air pada saat ditambahkan.
Sedangkan untuk sampel 1 dan sampel 2 tidak di
peroleh pita DNA sehingga tidak dapat dilakukan
analisis. Hal tersebut dapat dikarenakan lisis sel
yang dilakukan memberikan hasil yang tidak
maksimal sehingga sampel tidak diperoleh dan
tidak dapat dihitung massa molekul DNA.
Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan
dalam penelitian biologis kedokteran, sosial, dan
hukum. PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku
kejahatan dari sampel DNA air mani, darah, atau
jaringan tubuh pelaku lainnya atau PCR digunakan
untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi,
sperti DNA virus HIV (Ratnasari, 2007).
Identifikasi Penyakit Genetika untuk
mengetahui segmen DNA dari pasien yang
menderita penyakit mutasi genetika. Teknik ini
dapat dilakukan dengan segmen dari DNA genom
yang tidak diketahui secara lengkap atau hanya
untaian tunggal dari genom tersebut. PCR memiliki
banyak cara untuk mrngkloning DNA secara
tradisonal. PCR dapat mengekstrak segmen untuk
menyisipkan sebuah vektor dari genom yang
memiliki ukuran besar yang hanya tersedia dalam
jumlah yang sedikit.
Aplikasi yang menarik dari PCR adalah analisis
DNA dari fosil, seperti fosil Gajah purba di
belanda. Aplikasi PCR digunakan dalam
mempelajari susubab dari ekspresi gen. Jaringan
(sel tunggal) dapat di analisa pada tahap berbeda
untuk melihat gen mana yang telah aktif atau yang
telah dimatikan.
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan
(baik pelaku maupun korban), atau korban
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika
identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin
lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan
yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian
tubuh manapun kemudian dilakukan analisa
PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian
tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA
sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang.
Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidikjari
keluarganya yang memiliki pertalian darah,
misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki
kecocokan yang sangat tinggi maka bisa
dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang
memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri
orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika
sang orang tua merasa ragu.
Dengan adanya penemuan dan manfaat teknik
PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan
sains dan teknologi secara umum adalah untuk
memperkuat gen spesifik sebelum diklon, membuat
fragmen gen DNA secara berlimpah, dapat
mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk
dideteksi, dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA
sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum
dilahirkan, mengetahui hubungan kekerabatan antar
spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies
tersebut berasal dan melacak asal usul seseorang
dengan membandingkan “finger print".
Kelebihan PCR adalah memiliki spesifisitas
tinggi, sangat cepat, dapat memberikan hasil yang
sama pada hari yang sama, dapat membedakan
varian mikroorganisme, mikroorganisme yang
dideteksi tidak harus hidup, mudah di set up dan
sebagainya. Sedangkan kelemahan PCR adalah
sangat mudah terkontaminasi, biaya peralatan dan
reagen mahal, interpretasi hasil PCR yang positif
belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi
(misalnya infeksi pasif atau laten), Teknik prosedur
yang kompleks dan bertahap membutuhkan
keahlian khusus untuk melakukannya.
Jenis PCR, teknik PCR dapat dimodifikasi ke
dalam beberapa jenis diantaranya:
1. Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP), metode ini digunakan untuk membedakan
organisme berdasarkan analisis model derifat dari
perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika
hanya satu sekuen internal yang diketahui.
Template didigesti dengan enzim restriksi yang
memotong bagian luar daerah yang akan
diamplifikasi, fragmen restriksi yang dihasilkan
ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan
menggunakan sekuen primer yang memiliki titik
ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain
dengan segmen eksternal yang telah tergabung.
Metode ini khusus digunakan untuk
mengidentifikasi ”sekuen antara” dari beragam gen.
3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk
mengurangi kontaminasi pada produk selama
amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk
mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi
target kedua selama proses pertama berlangsung.
Sekuens DNA target dari satu set primer yang
disebut primer inner disimpan di antara sekuens
target set kedua dari primer yang disebut sebagai
outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari
PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR
kedua dilakukan dengan inner primer atau nested
primer menggunakan hasil dari produk reaksi yang
pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer
akan menyatu dengan produk PCR yang pertama
dan menghasilkan produk yang lebih pendek
daripada produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR digunakan untuk
pengukuran berulang dari hasil produk PCR.
Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk
mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA,
cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini juga
menampilkan copy dari sampel
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR), metode ini
digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau
identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.
Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase
(mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup
pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen
diekspresikan.
6. Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD) bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme
pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh
Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara
mengkombinasikan teknik PCR menggunakan
primer – primer dengan sequens acak untuk
keperluan amplifikasi lokus acak dari genom.
PCR adalah teknologi canggih yang dapat
mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi DNA.
Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk
menegakkan diagnosa sepanjang pemeriksaan
tersebut dikerjakan dengan cara yang benar dan
sesuai dengan standar internasional. Keunggulan
PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan
atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya.
Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya
PCR yang masih tergolong tinggi.
4. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan
diperoleh isolasi dan perbanyakan fragmen gen 16S
rDNA dari koloni tunggal dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) tidak berhasil
dilakukan karena tidak dihasilkan pita DNA secara
jelas dan adanya kontrol negatif yang muncul,
sehingga massa molekul dari DNA tersebut tidak
dapat ditentukan.
DAFTAR PUSTAKA
Alaeddini, R., 2012. Forensic implications of PCR
inhibition—a review. Forensic Science
International: Genetics, 6(3), pp.297-305.
Clarridge, J.E., 2004. Impact of 16S rRNA gene
sequence analysis for identification of bacteria
on clinical microbiology and infectious
diseases. Clinical microbiology reviews, 17(4),
pp.840-862.
Gibson, N.J., Newton, C.R. and Little, S., 1997. A
colorimetric assay for phosphate to measure
amplicon accumulation in polymerase chain
reaction. Analytical biochemistry, 254(1),
pp.18-22.
Giasuddin, A.S.M., 1995. Polymerase chain
reaction technique: fundamental aspects and
applications in clinical diagnostics. Journal of
Islamic Academy of Sciences, 8(1), pp.29-32.
Mayo, D.W., Pike, R.M. and Forbes, D.C.,
2010. Microscale organic laboratory: with
multistep and multiscale syntheses. John Wiley
& Sons.
Metzker, M.L. and Caskey, C.T., 2009. Polymerase
chain reaction (PCR). eLS.
Nurachman, Z., Kono, A., Radjasa, O.K. and
Natalia, D., 2010. Identification a novel raw-
starch-degrading-α-amylase from a tropical
marine bacterium. American Journal of
Biochemistry And Biotechnology, 6(4), pp.300-
306.
Handoyo, D. and Rudiretna, A., 2000. Prinsip
umum dan pelaksanaan polymerase chain
reaction (PCR) [general principles and
implementation of polymerase chain
reaction]. Unitas, 9(1), pp.17-29.
Jackson, C.R., Roden, E.E. and Churchill, P.F.,
2000. Denaturing gradient gel electrophoresis
can fail to separate 16S rDNA fragments with
multiple base differences. Mol Biol Today, 1(2),
pp.49-51.
Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006.
Brock Biology of Microorgnisms. NewJersey:
Pearson Prentice Hall.
Rahayu, N., 2013. Perancangan Primer untuk
Pengembangan Sistem Deteksi Berbasis PCR
(Polymerase Chain Reaction) pada Ganoderma
spp.
Ramakers, C., Ruijter, J.M., Deprez, R.H.L. and
Moorman, A.F., 2003. Assumption-free analysis
of quantitative real-time polymerase chain
reaction (PCR) data. Neuroscience
letters, 339(1), pp.62-66.
Rinanda, T., 2011. ANALISIS SEKUENSING 16S
rRNA DI BIDANG MIKROBIOLOGI. Jurnal
Kedokteran Syiah Kuala, 11(3), pp.172-177.