LAPORAN PRAKTIKUM KI3261

METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

PERCOBAAN 04

PENENTUAN AKTIVITAS HIDROLISIS LIPASE

Nama : Aviv Sigit Cahyono

NIM : 10513035

Kelompok : Kelompok I

Tanggal Percobaan : 15 Maret 2017

Tanggal Pengumpulan : 22 Maret 2017

Asisten : Mieki

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
 Penentuan Aktivitas Hidrolisis Lipase

I Tujuan
- Menentukan nilai aktivitas unit lipase dan nilai aktivitas total lipase

II Teori Dasar
Enzim merupakan molekul biokatalisis yang banyak memberikan manfaat dan banyak
digunakan pada reaksi yang terjadi pada makhluk hidup. Enzim sendiri dapat
diklasifikasikan kedalam beberapa kelompok, antara lain: Hidrolase, Isomerase, Ligase
atau Polimerase, Liase, Oxidoreductase, dan Transferase.
Hidrolase merupakan kelompok enzim yang berguna untuk menghidrolisis substrat dari
suatu enzim, salah contohnya adalah enzim lipase. Isomerase merupakan kelompok enzim
yang digunakan untuk menyusun kembali suatu senyawa kedalam bentuk isomernya.
Enzim ligase atau polymerase yang secara keseluruhan kelompok enzim ini berguna untuk
menggabungkan 2 senyawa atau lebih. Kemudian enzim ligase merupakan enzim untuk
memecah suatu senyawa yang kompleks menjadi lebih sederhana tanpa menggunakan air.
Oxidoreduktase merupakan kelompok enzim yang berguna untuk mengkatalisis reaksi
yang merupakan reaksi redoks. Enzim terakhir adalah transferase, merupakan kelompok
enzim yang berguna untuk memindahkan suatu gugus dari molekul ke molekul yang lain.
Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester. Enzim ini
mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam lemak rantai
panjang. Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan
lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran dalam
mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Enzim lipase ini dapat memecah ikatan ester
pada lemak sehingga menjadi asam lemak dan gliserol (Poedjiadi dan Supriyanti, 2007).
Penentuan aktivitas hidrolisis dari ekstrak kasar lipase dilakukan dengan menggunakan
substrat pNP-palmitat. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai enzim yang dapat
melepaskan 1 mol pNP pr menit.

III Data Pengamatan

a Pembuatan Kurva Standar pNP

Konsentrasi Absorbansi
0 0
1 0,085
2 0,152
3 0,219
4 0,304
5 0,376
6 0,427
7 0,474

b Penentuan Aktivitas Hidrolisis Lipase

 Blanko Sampel Kontrol Delta
(A) (B) (C) Absorbansi
0 0,188 0,134 0,054
0 0,209 0,191 0,018
Rata-rata 0,036

Gambar 1.
Larutan
Penentuan Kurva Standar pNP

IV Pengolahan Data
a Pembuatan Kurva Standar pNP

Kurva Standar pNP

0.5
f(x) = 0.07x + 0.01
0.4 R = 0.99
0.3
Absorbansi 0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8

[pNP]
b Penentuan Aktivitas Hidrolisis Lipase

A= A sampel Akontrol

A 1
0,1880,134=0,054

A 2
0,2090,191=0,018

A 1+ A 2 0,054+0,018
Absorbansi rata-rata = 2 = 2 = 0,036

Berdasarkan persamaan yang diperoleh dari grafik A, yaitu: y = 0,0689x + 0,0136

dimana y merupakan nilai absorbansi dan x merupakan nilai [pNP] maka nilai [pNP]
produk :
0,036=0,0689 x +0,0136

0,0360,0136
x= = 0,3251 g/mL
0,0689

[ produk ] x Vtotal
Unit aktivitas = Mr x 15 menit

g
0,3251 x 1,2mL
mL
Unit aktivitas = g
139,11 x 15 menit
mol

mol
Unit aktivitas = 0,0001869 menit Unit
 Digunakan 300 L = 0,3 mL

Unit aktivitas
Aktivitas Total = mL protein

0,0001869Unit
Aktivitas Total = 0,3 mL

Unit
Aktivitas Total = 6,23 x 104
mL

V Pembahasan

Pada percobaan ini, dilakukan penentuan aktivitas hidrolisis lipase. Enzim lipase adalah
enzim yang bekerja untuk menghidrolisis lemak dan minyak. Berdasarkan fungsi
fisiologisnya enzim lipase mempunyai peranan penting menghidrolisis lemak dan minyak
menjadi asam lemak dan gliserol yang dibutuhkan dalam proses metabolisme. Lipase
merupakan kelas enzim hidrolase karena fungsinya untuk hidrolisis pNPP (para Nitro
Phenol Palmitat) menjadi pNP (para Nitro Phenol) dan asam palmitat. Reaksi hidrolisis
para Nitro Phenol Palmitat adalah sebagai berikut:
 Enzim lipase memiliki sisi pusat aktif yang terdiri dari residu yaitu serin-histidin-
aspartat/glutamat yang dikenal dengan catalytic triads. Pada lipase, residu nukleofilik
hampir selalu serin, sedangkan residu katalitik asam selau aspartat atau glutamat. Pada
proses hidrolisis, lipase berikatan dengan gugus asil dari gliserida, sehingga membentuk
kompleks lipase-asil. Gugus asil tersebut kemudian ditransfer ke gugus OH dari molekul
air. Penentuan aktivitas hidrolisis dari ekstrak kasar lipase dilakukan dengan menggunakan
substrat pNP-palmitat. Aktivitas enzim diukur berdasarkan perubahan absorbansi pada
panjang gelombang 405 nm dengan menggunakan standar pNP.

pNP-palmitat pada percobaan ini berfungsi sebagai substrat reaksi yang akan di
hidrolisis oleh enzim lipase membentuk suatu produk, yakni: pNP dan asam palmitat.
Etanol berfungsi sebagai pelarut substrat untuk membentuk kompleks lipase-asil.
Sedangkan asetonitril juga sebagai pelarut substrat. Lipase merupakan enzim yang larut
dalam air dan substratnya mengandung asam lemak, dimana asam lemak akan lebih larut
dalam pelarut organik. Sehingga dengan digunakan etanol dan asetonitril yang dapat
menjadi jembatan atau penghubung agar keduanya dapat larut.

Lipase bekerja diantarmuka, yakni: mengkatalisis proses hidrolisis ikatan ester dari
triasilgliserol pada daerah antarmuka minyak dan air. Sifat ini yang membedakan lipase
dari kelas esterase yang hanya bekerja pada substrat larut air. Sedangkan lipase adalah
enzim yang memecah ikatan ester pada lemak sehingga terjadi asam lemak dan gliserol.
Adanya karakteristik interfacial activation menyebabkan terbentuknya lapisan antarmuka
disekitar lingkungan lipase yang akan meningkatkan aktivitasnya. Peningkatan aktivitas
lipase secara signifikan terjadi apabila substrat telah membentuk emulsi. Hal ini
menunjukkan bahwa aktivitas lipase sangat bergantung adanya daerah antarmuka, sehingga
lipase didefinisikan sebagai kaboksilesterase yang bereaksi terhadap substrat yang
membentuk emulsi.

Pada percobaan ini peran pNP-palmitat sebagai substrat dapat digantikan oleh substrat
lain yang bias digunakan untuk menentukan aktivitas dari enzim lipase, misalnya olive oil.
Agar lipase dapat bekerja dengan maksimum maka digunakan buffer glisin-NaOH yang
dapat mempertahankan pH kerja enzim dan substrat agar tetap dalam rentang pH 9.
Penentuan aktivitas hidrolisis lipase dimana sampel (B) dan kontrol (C) yang digunakan
sebagai faktor koreksi. Pada kontrol (C) ditambahkan enzim kasar yang sudah dididihkan
terlebih dahulu pada suhu 100 oC selama 30 menit. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan
sifat katalitik dari enzim lipase dan agar dapat dilakukan pengukuran sampel dan
membandingkan dari reaksi yang aktif enzim dan non aktif enzim. Dari percobaan yang
telah dilakukan diperoleh nilai absorbansi untuk kontrol (C) memiliki nilai absorbansi yang
lebih kecil dibandingkan dengan aktif enzim pada sampel (B). Hal ini menunjukkan non
aktif enzim pada kontrol (C), dimana enzim lipase tidak membantu atau tidak terlibat
dalam pembentukan pNP karena hilangnya sifat katalitik enzim. Kemudian dilakukan
sentrifugasi yang bertujuan untuk mengendapkan berbagai protein yang ada di dalam
 campuran atau pengotor yang tidak diinginkan agar tidak mempengaruhi pengukuran yang
akan dilakukan. Pengukuran ini dilakukan pada panjang gelombang 405 nm karena pada
panjang gelombang tersebut larutan menghasilkan nilai serapan maksimum.

Aktivitas merupakan jumlah produk 1 mol pNP yang terbentuk persatuan waktu
(menit). Dari aktivitas ini maka akan diperoleh nilai aktivitas unit dan aktivitas total.
Berdasarkan hasil percobaan diperoleh nilai aktivitas unit lipase adalah
mol 4 Unit
0,0001869 6,23 x 10
menit . Sedangkan aktivitas total lipase adalah mL . Aktivitas

enzim lipase dalam menghidrolisis pNP-palmitat memiliki aktivitas yang sangat kecil. Hal
ini disebabkan pada saat pemanasan yang terlalu tinggi menyebabkan enzim dan substrat
yang digunakan mengalami kerusakan sehingga tidak dapat bereaksi sempurna dan
kurangnya ketelitian saat pengambilan jumlah larutan yang ditambahkan sehingga terjadi
kesalahan dalam pengukuran yang dilakukan.

VI Kesimpulan
mol
Berdasakan hasil percobaan, nilai aktivitas unit lipase sebesar 0,0001869
menit .

4 Unit
Sedangkan nilai aktivitas total lipase sebesar 6,23 x 10 mL .

VII Daftar Pustaka

Lehninger, A.L. 2008. Principles of Biochemistry, 5th ed. Worth Publisher, Inc. New York.
Hal. 220-222.

Poedjiadi, A., Supriyanti, F.M.T. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit Universitas

Indonesia. Jakarta

Stryer, W. 2007. Biochemistry, 6th ed. W.H Freeman & Company. Halaman 302-357.