PENERAAN MIKROMETER OKULER, PENGUKURAN SEL BAKTERI,

DAN PEWARNAAN SECARA GRAM

Laporan Praktikum

Dibuat untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Mikrobiologi

yang Dibina oleh Ibu Sitoresmi Prabaningtyas, S.Si., M.Si., dan

Ibu Mardiana Lelitawati, S.Si., M.Si.

Disusun oleh:

Kelompok 3 Offering H 2018

Desvita Risa 180342618008

Nadya Nur Oktaviani 180342618015

Neila Salma Kumala 180342618090

Qathrin Nada Assalimi 180342618085

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

JURUSAN BIOLOGI

PROGRAM STUDI S1 BIOLOGI

JANUARI 2020
A. Topik : Peneraan mikrometer okuler, pengukuran sel bakteri, dan
pewarnaan secara gram.
B. Tanggal : 28 Januari 2020
C. Tempat : Gedung O5 Laboratorium Mikrobiologi
D. Tujuan :
1. Untuk memperoleh keterampilan menera skala mikrometer okuler
2. Untuk mengukur sel bakteri
3. Untuk memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram
4. Untuk menentukan sifat Gram dari bakteri yang diperiksa

E. Dasar Teori

Bakteri merupakan mikroorganisme bersel tunggal selular prokariotik

yang hidup bebas dan mampu bereproduksi sendiri. Bakteri terdiri dari
sitoplasma yang dikelilingi ileh dinding sel yang terbuat dari peptidoglikan.
Reproduksi bakteri terjadi secara aseksual dengan cara replikasi DNA dan
pembelahan sederhana, (Elizabeth J, Corwin. 2009). Berbagai jenis bakteri
memiliki ukuran yang berbeda biasanya bakteri berukuran sekitar 0,5-0,1 µm,
selain memiliki ukuran yang berbeda bakteri juga memiliki bentuk yang
berbeda yaitu: coccus, basil, dan spiril, bentuk bakteri tersebut dapat
dipengaruhi oleh keadaan medium dan usia bakteri.

Pengukuran sel bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan

mikroskop dan mikrometer okuler, sebelum pengukuran dilakukan
mikrometer okuler harus ditera menggunakan mikrometer objektif untuk
mengetahui harga skala yang pasti (Kusnadi, 2003). Selain melakukan
pengukuran bakteri juga harus diklasifikasi.

Bakteri dapat diklasifikasi dengan cara pewarnaan gram, metode ini

menggunakan bakteri yang dipisahkan menjadi dua kelompok yaitu bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif.
1. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif ditentukan dengan cara pewarnaan gram, bakteri

ini memiliki peptidoglikan yang tebal dengan komposisi teichoic, asam
teichuroni, dan berbagai macam polisakarida sehingga saat di tetesi
dengan larutan ammonium oksalat kristal violet akan menjadikan bakteri
berwarna ungu yang menandakan bakteri tersebut merupakan bakteri
gram positif. Asam teikhoat berfungsi sebagai antigen pada permukaan
bakteri gram positif yang terletak pada lapisan membran sitoplasma dan
lapisan peptidoglikan. Selain itu, bakteri gram positif ini memiliki 40
lembar peptidoglikan pada dinding selnya, yang merupakan 50% dari
seluruh komponen penyusun dinding sel. Polisakarida dan asam amino
pada lembar peptidoglikan bersifat sangat polar, sehingga pada bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang sangat tebal, dapat bertahan dari
aktivitas cairan empedu di dalam usus (Prasetyo,T., 2009).

2. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis

dengan komposisi lipoprotein, membran luar dan lipopolisakarida.
Membran luar pada gram negatif juga memiliki sifat hidrofilik yaitu larut
dalam air, namun komponen lipid pada dinding selnya justru memberikan
sifat hidrofobik. Selain itu terdapat saluran khusus yang terbuat dari
protein yang disebut porins yang berfungsi sebagai tempat masuknya
komponen hidrofilik seperti gula dan asam amino yang penting untuk
kebutuhan nutrisi bakteri. Komponen lipid terdiri dari diglyseride
thioether yang terikat pada sistein terminal. Lipoprotein merupakan
komponen yang mendominasi dinding sel gram negatif dan berfungsi
menjaga stabilitas membran luar dan tempat perlekatan pada lapisan
peptidoglikan. Membran luar dari bakteri gram negatif merupakan
struktur bilayeryang memiliki molekul lipopolisakarida, sedangkan
membran dalamnya mirip dengan membran sitoplasma (Prasetyo, T.,
2009).
F. Prosedur Kerja
1. Peneraan Mikrometer Okuler

Dipasang micrometer okuler pada bagian mikroskop yang biasanya

dipakai sebagai tempat lensa okuler

Dipasang micrometer meja pada meja benda pada mikroskop

Diatur posisi garis skala micrometer dari micrometer okuler dan

micrometer meja sehingga titik nol kedua micrometer ini berada pada
satu garis lurus

Diamati garis skala keberapakah dari micrometer okuler yang berada

pada satu garis dengan garis skala micrometer meja (selain titik nol)

2. Pengukuran Sel Bakteri

Dilepaskan micrometer meja dari meja benda mikroskop, kemudian

dipasang sediaan bakteri yang telah diwarnai pada tempat tersebut

Diatur posisi sel-sel bakteri sehingga berada pada bidang skala

micrometer okuler. Hal ini dapat dilakukan dengan memutar
micrometer okuler

Diukur panjang sel atau diameter sel dalam millimeter, berdasarkan

harga tiap skala micrometer okuler yang telah ditera. Pengukuran
dilakukan pada sel-sel dari masing-masing koloni yang diperiksa. Tiap
preparat dipilih 3 sel untuk diukur, lalu dihitung reratanya. Bakteri
yang berbentuk kokus hanya diukur diameter selnya saja, sedang
bakteri yang berbentuk basil diukur panjang dan diameter selnya
3. Pewarnaan Secara Gram

Disediakan kaca benda yang bersih, lalu dilewatkan diatas nyala api
lampu spirtus

Diambil inoculum bakteri secara aseptic yang akan diperiksa, lalu

diletakkan diatas tetesan aquades itu. Kemudian diratakan perlahan-
perlahan dan ditunggu sampai mengering

Diteteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut

Dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas

nyala api lampu spirtus dengan cepat

Diletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada di atas

mangkuk pewarna. Lalu ditetskan larutan Ammonium Oksalat Kristal
Violet di atas sediaan tersebut. Ditunggu selama 1 menit

Dibuang kelebihan zat warna tersebut ke dalam mangkuk dan dibilas

sediaan dengan air kran

Diteteskan larutan iodium di atas sediaan, lalu ditunggu selama 2

menit.

Dibuang kelebihan larutan iodium ke dalam mangkuk lalu dibilas

dengan air kran

Ditetskan alcohol 95% di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 1 menit

Dibuang sisa alcohol ke dalam mangkuk dan dibilas sediaan dengan air
kran
 Diteteskan larutan safranin di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 30
detik.

Dibunag kelebihan safranin ke dalam mangkuk, lalu dibilas dengan air

kran.

Dikeringkan sediaan dengan hati-hati dengan kertas penghisap, lalu

periksalah di bawah mikrosop

G. Data Pengamatan dan Analisis Data

Data Pengamatan
1. Menera Mikrometer Okuler
Perbesaran 400 x

M.ok = 40 0,1
=0,0025 mm=2,5 μm
M.ob = 0,1 40

Perbesaran 1000 x

M.ok = 50 0,05
=0,001 mm=1 μm
M.ob = 0,05 50

2. Pengukuran Sel Bakteri

Perbesaran 1000 x

Kode Bentuk Skala pada Mikrometer Rata-rata x Kalibrasi

sel Okuler M.ok (μm¿
1 2 3
a Basil p=7 p = 10 p=6 7.6 x 1 = 7.6
d=1 d=1 d=1 1x1=1
b Basil p=4 p=4 p=4 4x1=4
d=1 d=1 d=2 1.3 x 1 = 1. 3

3. Pewarnaan Secara Gram

No. Koloni Bentuk Sel Warna Sel Sifat Gram Koloni

1. Basil Merah Gram Negatif
2. Basil Merah Gram negatif
 Analisis Data
1. Peneraan Mikrometer Okuler
Berdasarkan data tersebut peneraan mikrometer okuler dengan
menggunakan mikroskop dilakukan dengan perbesaran 400 x dan 1000
x. Nilai 1 skala mikrometer objektif sama dengan 0.01 mm. Pada
perbesaran 400 x, nilai 1 skala mikrometer okuler =

0,1
=0,0025 mm=2,5 μm. Pada perbesaran 1000 x, nilai 1 skala
40

0,05
mikrometer okuler = =0,001 mm=1 μm.
50

2. Pengukuran Sel Bakteri

Berdasarkan data hasil praktikum, di temukan sejenis koloni bakteri
yang diisolasi dari sungai FMIPA yaitu dengan bentuk basil.
Pengukuran yang dilakukan pada sel bakteri dengan mengukur panjang
skala dan diameter skalannya. Pengukurannya menggunakan
mikroskop dengan perbesaran 1000 x dan dilakukan pengulangan
sebanyak 3 kali. kemudian hasil skala di rata-rata dan dikalikan dengan
Kalibrasi micrometer okuler untuk mengetahui panjang dan
diamternya. Didapatkan hasil rata-rata panjang dan diameter pada
koloni basil 1 panjang skala = 7.6 x 1 = 7.6 μm dan diameter skala =
1x 1 = 1 μm, pada koloni basil 2 panjang skala = 4 x 1 = 4 μm dan
diameter skala = 1.3 x 1 = 1.3 μm.

3. Pewarnaan Secara Gram

Pada praktikum pewarnaan gram yang dilakukan pada bakteri,
berdasarkan data didapatkan hasil pengamatan gambar yang
menunjukkan bahwa bakteri tersebut berwarna merah dan sifat gram
koloninya negatif.

H. Pembahasan
1. Peneraan Mikrometer Okuler
 Pengukuran suatu bakteri dapat menggunakan mikrometer okuler
yang diselipkan pada lensa okuler mikroskop. Sebelum digunakan sebagai
pengukuran, mikroskop okuler harus ditera terlebih dahulu dengan bantuan
mikrometer meja atau mikrometer objektif yang telah memiliki harga skala
yang pasti (Hastuti, 2018). Berdasarkan hasil pengamatan, setiap
perbesaran memiliki skala yang berbeda. Pada perbesaran 40x10, harga 1
skala dari mikrometer okuler adalah 2,5 μm, sedangkan pada perbesaran
100x10, harga 1 skala dari mikrometer okuler adalah 1 μm.

2. Pengukuran Sel Bakteri

Berdasarkan hasil pengamatan, ukuran bakteri dari masing-masing
koloni berbeda meskipun bentuknya sama, yaitu basil. Pada koloni
pertama didapat rata-rata panjang bakteri 7.6 μm dan diameter bakteri 1
μm. Pada koloni kedua didapat rata-rata panjang bakteri 4 μm dan diameter
bakteri 1.3 μm. Ukuran bakteri dari kedua koloni bakteri tersebut hampir
sama dengan ukuran bakteri Bacillus megaterium dengan panjang 3 – 6
µm dan diameter 1 – 1,5 µm (Tarigan, 1988).
Ukuran dari kedua koloni bakteri yang diamati tidak jauh berbeda.
Hal ini dapat terjadi karena faktor usia dan keadaan medium yang
mempengaruhi pertumbuhan bakteri (Dwidjoseputro, 1978). Oleh karena
itu, untuk membandingkan ukuran bakteri maka harus diperhatikan faktor
yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri, seperti faktor suhu, temperatur,
usia, dan juga tempat penyimpanan.

3. Pewarnaan Secara Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-
positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel pada
bakteri tersebut (Pelczar, 2008).
Pelczar (2008) menjelaskan bahwa pewarnaan gram dilandasi pada
komposisi dan struktur dari dinding sel bakteri. Bakteri gram negatif
banyak mengandung lipid,lema kdengan presentase lebih tinggi daripada
 yang dikandung bakteri gram prositif. Percobaan menyarankan selama
prosedur pewarnaan, perlakuan dengan etanol (alkohol) terhadap bakteri
gram negatif menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga dapat
memperbesar daya permeabilitas pada dinding sel gram negatif. Jadi
kompleks ungu Kristal-yodium (UK-Y), telah memasuki dinding sel
selama waktu langkah awal dalam proses pewarnaan, dapat diekstraksi.
Sehingga organisme bakteri gram negative kehilangan warna. Hal ini
terjadi karena kadungan lipid yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram
positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan etanol.
Menurut Hastuti (2012), salah satu prosedur yang penting dan
paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri yaitu pewarnaan secara
gram. Pewarnaan diferensial merupakan kemampuan membedakan suatu
kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya. Namun, dalam
praktikum yang telah dilakukan tidak mengidentifikasi untuk menyusun
klasifikasi koloni yang di amati, hanya melakukan pengamatan morfologi,
pewarnaan gram, dan pengamatan bakteri pada medium miring.
Dari hasil praktikum yang kami lakukan menunjukkan pewarnaan
koloni bakteri 1 dan bakteri 2 berwarna merah yang berarti koloni bakteri
1 dan koloni bakteri 2 termasuk dalam bakteri gram negatif. Kompleks
zat warna kristal violet-yodium yang mengakibatkan warna merah merah
pada sel bakteri yang sebelumnya diberikan larut ketika pemberian larutan
alkohol 90% sehingga saat diberi safranin akan memberi warna merah
pada membran sel bakteri. Hal ini sesuai dengan teori (Fitri, 2011).

I. Kesimpulan
1. Peneraan mikrometer okuler diperlukan untuk memperoleh
keterampilan dalam menentukan skala pada micrometer okuler untuk
memudahkan praktikan pada saat pengukuran sel bakteri. Hasil
peneraan skala micrometer okuler tidak selalu sama pada setiap
mikroskop dan juga perbesarannya.
2. Sel bakteri pada bakteri yang berbentuk basil memiliki ukuran dan
bentuk yang bermacam-macam. Sel tubuh bakteri sangat kecil,
kebanyakan diamternya berukuran 0,5 – 0,1 μm.
 3. Bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri dengan sifat gram positif dan
negative berdasarkan warna pada pewarnaan akhir. Bakteri dengan
warna ungu pada pewarnaan akhir dikatakan sebagai bakteri gram
positif, sedangkan bakteri dengan warna merah pada pewarnaan akhir
dikatakan sebagai bakteri gram negative.

J. Daftar Pustaka
Dwidjoseputro. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Elizabeth J. Corwin. 2009. Buku Saku Patofisiologi Corwin. Jakarta:

Aditya Media.
Fitri, Lenni dan Yasmin, Yekki. 2011. Isolasi Dan Pengamatan Morfologi
Koloni Bakteri Kitinolitik. Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi,
Biologi Edukasi, 3(2): 20-25.
Hastuti, Utami Sri. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang:
UMM Press.
Kusnadi. 2003. Common Text Book Mikrobiologi. Bandung: JICA-
IMSTEP, DGHE, dan FPMIPA UPI.
Pelczar, Michael J. & E.C.S. Chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid
1. Jakarta: UI Press.
Syachrurachman, Agus. Dkk. 2012. Mikrobiologi Kedokteran. Tangerang:
Binarupa Aksara.
Tarigan, Jeneng. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta: Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Pendidikan Tinggi.

K. Diskusi
1. Tulislah hasil perhitungan peneraan harga skala mikrometer okuler
pada pembesaran 400 X dan 1000 X. Mengapa perlu dilakukan
peneraan pada kedua macam pembesaran tersebut?
Jawab:
a. Perbesaran 400X

Mok = 40, Mob = 0,1

 Mob 0,1
= =0,0025 mm ¿ 2,5µm
Mok 40

b. Perbesaran 1000X

Mok = 50, Mob = 0,05

Mob 0,05
= =0,0001 mm ¿ 1µm
Mok 50

Peneraan harga skala mikrometer okuler dengan perbesaran tersebut

perlu dilakukan karena untuk mengetahui harga skala mikrometer
pada mikroskop yang digunakan. Hal ini disebabkan setiap
mikroskop memiliki harga skala yang berbeda. Begitu pula dengan
perbesaran yang digunakan. Jika perbesarannya berbeda maka harga
skala pasti akan berbeda. Jadi perlu diketahui masing-masing harga
skala kedua jenis perbesaran ini untuk digunakan dalam pengukuran
bakteri.

2. Tulislah hasil pengukuran sel bakteri yang diamati dalam 3 ulangan,

lalu hitunglah nilai reratanya. Mengapa sel bakteri yang berbentuk
basil harus diukur panjang dan diameter selnya, sedang sel bakteri
yang berbentuk kokus hanya diukur diameter sel saja?
Jawab:

No. Skala pada mikrometer okuler (µm) Rata-rata x kalibrasi Mok

1 2 3 (µm)
1. (Basil) (Basil) (Basil)
Panjang = 7 Panjang = 10 Panjang = 6 7,6 x 1 = 7,6
Diameter = 1 Diameter= 1 Diameter = 1 1x1=1
2. (Basil) (Basil) (Basil)
Panjang = 4 Panjang = 4 Panjang = 4 4 x1 = 4
Diameter = 1 Diameter = 1 Diameter = 2 1,3 x 1 = 1,3
Perbesaran = 100 x 10
0,01
Skala = =0,001 mm=1 µm
10
 Sel bakteri yang berbentuk basil harus diukur panjang dan diameter
selnya, sedangkan sel bakteri yang berbentuk kokus hanya diukur
diameter sel saja. Hal ini dikarenakan sel bakteri berbentuk kokus
memperlihatkan ukuran dari 1 dimensi yaitu diameter karena
berbentuk bulat. Sedangkan sel bakteri berupa basil memperlihatkan
ukuran dari 2 dimensi yaitu diameter dan panjang karena berbentuk
batang.
3. Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri
gram positif dan gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi
dalam proses pewarnaan Gram!
Jawab: Hal ini terjadi karena bakteri gram positif memiliki satu lapis
dinding sel berupa yaitu peptidoglikan yang tebal. Sehingga setelah
terjadi pewarnaan dengan ammonium kristal violet, pori-pori dinding
sel yang berupa peptidoglikan menyempit akibat dekolorisasi oleh
alkohol hal itu menyebabkan dinding sel tetap menahan warna ungu
dari ammonium kristal violet. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol. Sementara bakteri gram negatif tidak akan mempertahankan
zat warna metil ungu gelap karena bakteri gram negatif memiliki
peptidoglikan yang tipis. Pemberian kristal violet pada bakteri gram
positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon
terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan
pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Pemberian alkohol
pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan ekstraksi pada lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel, hal inimenyebabkan
pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol
sehingga pori-pori mengecil, dinding sel dan membran menurun
sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna
ungu.
Lampiran

Sampel Koloni Bakteri Pewarnaan Secara Gram

Koloni 1 Panjang Diameter

Panjang 1 Diameter 1

Panjang 2 Diameter 2

Panjang 3 Diameter 3
Koloni 2
Panjang 1 Diameter 1

Panjang 2 Diameter 2

Panjang 3 Diameter 3