PENERAAN, PENGUKURAN, DAN PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Laporan Praktikum

Disusun untuk memenuhi mata kuliah praktikum Mikrobiologi yang dibina oleh:
Sitoresmi Prabaningtyas, S.Si., M.Si dan Kennis Rozana, S.Pd., M.si.

Disusun Oleh:
Kelompok 2 Offering B 2018
Annisa' Ihda Fajriyati 180341617589
Laila Badriyatul Habibah 180341617528
Muhamad Arjuna Salim 180341617565
Purwita Wahyu Dwiana 180341617573
Tasha Nada Alrafifah 180341617520

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI S1 PENDIDIKAN BIOLOGI
Februari 2019
A. Topik
Topik pada praktikum adalah Peneraan, Pengukuran, dan Pewarnaan Gram
Bakteri.
B. Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Rabu, 29 Januari 2020 / O5 305
C. Tujuan
Tujuan praktikum adalah
1. Untuk memperperoleh ketrampilan menera skala mikrometer okuler.
2. Untuk mengukur sel bakteri
3. Untuk memperoleh keterampilan pewarnaan bakteri secara gram.
4. Untuk Dapat menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa.

D. Dasar Teori
Struktur seluler yang tak kasat mata dapat diamati dengan jelas atas bantuan
mikroskop. Seperti yang kita tahu bahwa mata manusia untuk tujuan pengamatan
memiliki kemampuan daya pisah terbatas terhadap suatu objek yang memiliki
ukuran renik atau mikron seperti bakteri, sehingga sangat diperlukan alat bantu
(mikroskop). Dengan bantuan mikroskop, pengamat lebih mampu meningkatkan
daya pisah objek mikroskopis, sehingga objek yang sangat halus pun (renik) dapat
diamati strukturnya dengan jelas (Chaeri, dkk, 2008).
Sedangaan mikrometer menurut Pramesti (2000) dan Dwidjoseputro (2003)
merupakan kaca berskala, dan dikenal 2 jenis mikrometer yaitu mikrometer okuler
serta mikrometer objektif. Di mana untuk peletakannya, mikrometer okuler pasang
pada lensa okuler sedangkan mikormeter objektif dipasang di meja benda (tepat di
bawah lensa objektif). Selanjutnya kedua mikrometer ini harus dikalibrasi agar
ditemukan harga untuk satu skala mikrometer okuler.
Dwidjoseputro (2003) menyatakan, mikrometer okuler dapat dibesarkan oleh
signifikasi dari ukuran mikroskop dan mikrometer, sehingga perlu dilakukan
kalibrasi dan didapatkan suatu skala yang sama yang akan dimanfaatkan sebagai
standar.
Bakteri merupakan mikroorganisme bersel tunggal yang memiliki ukuran
bermacam-macam, umumnya memiliki panjang sekitar 0,5-10µm dan lebar sekitar
0,5-2,5 µm. Karakteristik bakteri dilihat dari bentuknya, seperti bulat (cocci),
batang (spirilli), koma (vibrios) (Ansori, 2007).
Bakteri memiliki ukuran yang sangat beragam sesuai dengan jenisnya. Namun
umumnya memiliki ukuran mulai dari 1µm. Pengukuran sel bakteri tersebut dapat
dilakukan dengan menggunakan mikrometer okuler, sehingga didapatkan ukuran
yang tepat. Tetapi, sebelumnya mikrometer okuler ini harus ditera dengan bantuan
mikrometer objektif yang sudah diketahui harga skalanya (Hastuti, 2012).

1
 Pewarnaan secara gram pada bakteri merupakan metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan
gram negatif yang bergantung pada reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau
ammonium kristal oksalat violet. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan
pewarnaan gram, karena dinding selnya banyak mengandung lipid, sehingga
digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya ( Pratita, 2012)
Pada pewarnaan secara gram, reagen atau larutan yang digunakan ada 4 jenis ,
yaitu ammonium oksalat kristal violet, iodium, alkohol dan safranin. Bakteri gram
positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga ketika
diamati mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri gram negatif
tidak dapat mempertahankan warna ungu dari ammonium kristal violet tetapi zat
warna safranin dapat terserap didinding sel sehingga akan terlihat warna merah
(Pratita, 2012).
E. Alat dan Bahan
Alat
- Mikroskop
- Mikrometer okuler (occuler micrometer)
- Mikrometer meja (stage micrometer)
- kaca benda
- mangkuk pewarna
- kawat penyangga
- pipet
- pinset
- lampu spirtus
- botol penyemprot.
Bahan
- Alkohol 70%
- Alkohol 95%
- Aquades steril
- Biakan murni bakteri umur 1 x 24 jam
- Kertas lensa
- Kertas penghisap
- Kertas Penghisap
- Korek Api
- Lap
- Larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet
- Larutan Iodium
- Larutan safranin
- Lisol
- Sabun cuci.

2
F. Prosedur Kerja
Peneraan Bakteri

Pasangkanlah mikormeter okuler pada bagian mikroskop yang biasanya

dipakai sebagai tempat lensa okuler

Pasanglah mikrometer meja pada meja benda pada mikroskop

Aturlah posisi garis skala mikrometer okuler dan mikrometer meja sehingga
titik no kedua mikrometer ini berada pada satu garis lurus.

Amatilah garis skala keberapakah dari mikormeter okuler yang berada

pada satu garis skala mikrometer meja (selain titik nol)

Pengukuran Bakteri

Lepaskan Mikrometer meja dari meja benda mikroskop, kemudian

pasanglah sediaan bakteri yang telah diwarnai pada temppat tersebut.

Aturlah posisi sel-sel bakteri sehingga baera pada bidang skala mikrometer
okuler. Hal ini dapat dilakukan dengan cara memutar mikro meter okuler.

Ukurlah panjang sel atau diameter sel dalam mili meter, berdasarkan harga
tiap sekala mikrometer yang telah ditera.

Pilihlah 3 sel lalu hitung reratanya

3
Pewarnaan Gram Bakteri

Sediakan Lewatkan di atas Teteskan setetes

kaca nyala api spirtus 0 aquades steril
benda

Ratakan dan Letakkan di atas Secara aseprik,

Tunggu hingga tetesan aquades ambil inokulum
mengering bakteri

Lakukan fiksasi Letakkan diatas Teteskan laruan

kawat penyangga Ammonium Oksalat
Kristal Violet

Teteskan laruan Buanglah kelebihan Tunggu hingga 1

Iodium zat dan bilas dengan menit
air kran

Tunggu hingga 2 Buanglah kelebihan Teteskan alkohol

menit zat dan bilas dengan 95%
air kran

Teteskan Buanglah kelebihan Tunggu hingga

larutan safranin zat dan bilas dengan 1 menit
95% air kran

Tunggu hingga Buanglah kelebihan Keringkan dengan

30 detik zat dan bilas dengan kertas hisap
air kran

Amati di bawah
mikroskop

4
G. Data
Peneraan dan pengukuran bakteri
1. Mikroskop dengan perbesaran 400x
Lensa okuler = 80
Lensa objektif = 10
10 x 0,01 mm = 0,1 mm
1 skala mikrometer okuler = 0,1/80 = 0,00125 mm = 1,25 µm
2. Mikroskop dengan perbesaran 1000x
Lensa okuler = 40
Lensa objektif = 2
2 x 0,01 mm = 0,02 mm
1 skala mikrometer okuler = 0,02/40 = 0,0005mm = 0,5 µm

Pewarnaan secara gram

Tabel pewarnaan gram
No Bentuk Warna sel Sifat gram
1 Basil Merah Negatif
2 Basil Merah Negatif

H. Analisis data
Pada peneraan mikrometer okuler dengan menggunakan lensa okuler dan lensa
objektif pada perbesaran 400x, didapatkan angka untuk lensa okuler sebesar 80 dan
lensa objektif sebesar 10, di mana angka untuk lensa objektif setelah dikalikan
dengan 0,1 mm mendapatkan hasil sebesar 0,1 mm. Kemudian dilakukan
perhitungan nilai untuk satu skala mikrometer okuler da mendapatkan hasil sebesar
0,00125 mm. Hasil tersebut selanjutnya harus dikali 1000 sehingga didapatkan nilai
satu skala untuk mikrometer okuler sebesar 1,25 µm.
Kemudian pada peneraan mikrometer okuler dengan menggunakan lensa okuler
dan lensa objektif pada perbesaran 1000x, didapatkan angka untuk lensa okuler
sebesar 40 dan lensa objektif sebesar 2, di mana angka untuk lensa objektif setelah
dikalikan dengan 0,1 mm mendapatkan hasil sebesar 0,02 mm. Kemudian dilakukan
perhitungan nilai untuk satu skala mikrometer okuler dan mendapatkan hasil sebesar
0,0005 mm. Hasil tersebut selanjutnya harus dikali 1000 sehingga didapatkan nilai
satu skala untuk mikrometer okuler sebesar 0,5 µm.
Dalam pengukuran bakteri, dipilih dua koloni yang berbeda. Masing-masing
koloni dipilih 3 sel bakteri yang berbeda dan dirata-rata, untuk pengukuran ini hanya
digunakan perbesaran lensa sebesar 1000x. Untuk koloni A, didapatkan bakteri
dengan bentuk basil, di mana panjang dari ketiga bakteri secara berurutan adalah 8,
8 dan 7 dengan rerata 7,7. Setelah dikalikan dengan harga skala mikrometer okuler
(0,5µm) didapatkan hasil 3,85 µm. Untuk ukuran diameter dari ketiga bakteri secara

5
berurutan adalah 3, 2, dan 3 dengan rerata 2,7. Setelah dikalikan dengan harga skala
mikrometer okuler (0,5µm) didapatkan hasil 1.35 µm.
Untuk koloni B, didapatkan bakteri dengan bentuk basil, di mana panjang dari
ketiga bakteri secara berurutan adalah 7, 5 dan 9 dengan rerata 7. Setelah dikalikan
dengan harga skala mikrometer okuler (0,5µm) didapatkan hasil 3,5µm. Untuk
ukuran diameter dari ketiga bakteri secara berurutan adalah 2, 2, dan 2 dengan rerata
2. Setelah dikalikan dengan harga skala mikrometer okuler (0,5µm) didapatkan hasil
1µm.
Pewarnaan secara gram pada bakteri diamati menggunakan perbesaran lensa
1000x. Larutan yang digunakan untuk pewarnaan secara gram mengunakan dua
larutan utama yaitu, larutan Amonium oksalat kristal violet dan juga larutan safranin.
Larutan lain yang digunakan adalah aquades steril, alkohol 95% dan juga larutan
iodium. Setelah proses pewarnaan pada 2 koloni bakteri, untuk koloni A didapatkan
bakteri dengan bentuk basil yang memiliki warna sel berupa warna merah
menandakan bakteri koloni A memiliki sifat gram negatif. Untuk koloni B,
didapatkan bakteri dengan bentuk basil yang juga memiliki warna sel berupa warna
merah yang menandakan bakteri koloni B memiliki sifat gram negatif.
I. Pembahasan
Pada praktikum pengukuran sel bakteri ini, kelompok kami melakukan peneraan
terhadap mikrometer okuler terlebih dahulu. Hal ini bertujuan agar bakteri yang
telah dibiakkan dan diwarna sebelumnya dapat dihitung ukuran selnya dengan teliti
dan jauh lebih tepat. Dalam menera mikrometer okuler ini, dibutuhkan bantuan
mikrometer objektif, dikarenakan mikrometer okuler tidak diketahui harga untuk
setiap skala sedangkan untuk mikrometer objektif telah diketahui harga per
skalanya. Mikrometer okuler ini diletakkan di dalam lensa okuler sedangkan
mikrometer objektif (meja) diletakkan tepat di bawah lensa objektif. Harga skala
yang dimiliki tidaklah sama, untuk itu setelah peneraan usai dilakukan, selanjutnya
untuk pengukuran sel bakteri harus tetap memakai mikrometer dan mikroskop yang
sama.
Hal di atas sesuai dengan Ratnawati (2000) yang menyatakan bahwa untuk
pengukuran yang lebih teliti terhadap benda atau mikroorganisme renik, dipakai alat
bantu pengukuran yang disebut dengan mikrometer. Mikrometer merupakan kaca
berskala yang terdiri dari dua jenis, yaitu mikrometer okuler dan mikrometer
objektif.
Pada prinsipnya, skala okuler terdiri dari 1-100 skala yang tidak diketahui harga
untuk per skalanya, sedangkan mikrometer objektif adalah kebalikannya, di mana
jarak antar skalanya memiliki nilai sebesar 0,01 mm. Sebenarnya, skala objektif
akan berubah jika pembesaran lensanya diubah, sedangkan skala okuler tidak akan
berubah. Sehingga pengkalibrasian dibutuhkan agar skala okuler memiliki nilai.
Mikrometer okuler kemudian dikalibrasi dengan standar dan dapat dipakai untuk

6
mengukur secara teliti sebuah spesimen daripada sekedar perkiraan semata
(Ratnawati, 2010).
Kemudian, mikrometer okuler dan objektif yang sudah sesuai peletakannya
diatur posisi sehingga titik nol pada masing-masing skala berada pada satu garis
lurus yang sama. Setelahnya, dicari garis skala lain yang saling lurus dan dicatat
angkanya. Pada proses peneraan ini, kami menggunakan dua perbesaran yaitu 400x
dan 1000x. Pada peneraan skala mikrometer okuler untuk perbesaran 400x
didapatkan nilai satu skala mikrometer okuler sebesar 1,25 µm. Sedangkan untuk
perbesara 1000x didapatkan hasil sebesar 0,5 µm.
Selanjutnya nilai untuk satu skala mikrometer okuler yang telah didapat akan
digunakan untuk pengukuran sel bakteri yang telah dipersiapkan.
Untuk pengukuran sel bakteri, kami menggunakan bakteri biakan yang telah
melalui proses pewarnaan gram sebelumnya, di mana diambil sampel dari dua
koloni bakteri yang berbeda. Untuk koloni A di bawah perbesaran 1000x didapatkan
bakteri gram negatif berbentuk basil dengan rata-rata panjang dan diameter sebesar
3,85 µm dan 1,35 µm. Sedangkan untuk koloni B, di bawah perbesaran 1000x
didapatkan bakteri gram negatif berbentuk basil dengan rata-rata panjang dan
diameter sebesar 3,5µm dan 1µm.
Hasil praktikum yang kami dapatkan sesuai dengan Tarigan (1988) dan Kusnadi
(2003) yang menyatakan bahwa, ukuran bakteri adalah berbeda tergantung setiap
jenisnya, bakteri yang bersifat patogen dan bukan juga memiliki ukuran yang
berbeda satu sama lain. Untuk bakteri dengan bentuk basil, ada yang berukuran
panjang 1µm hingga 4µm, dengan diameter yang bervariasi hingga dapat mencapai
20µm.
Pada Proses pewarnaan secara gram dibutuhkan alat yang bersih dan steril yang
bertujuan untuk mendapatkan pengukuran yang akurat. Kaca benda yang digunakan
harus difiksasi terlebih dahulu dengan cara dilewatkan diatas nyala api lampu
spiritus. Kaca benda diteteskan dengan larutan aquades steril, lalu diambil Kultur
bakteri tidak terlalu banyak, karena jika diambil terlalu banyak akan sulit diratakan.
Ketika sudah kering, dilakukan fiksasi lagi agar bakteri melekat pada kaca objek
sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian berulang
kali. Menurut Lay (1994) fiksasi merupakan suatu metode persiapan untuk
menyiapkan suatu sampel agar tampak realistic dengan menggunakan grulaldehid
dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur sel bakteri tersebut.
Hasil yang didapatkan kedua koloni bakteri (koloni A dan B) yang berasal dari
kantin FIP memiliki bentuk sel yang basil memiliki warna sel yang merah dan sifat
gram bakteri yang negatif. Menurut Jayanti (2010) warna merah yang muncul
menandakan bakteri gram negatif, karena hilangnya pewarna kristal violet pada saat
dekolorasi dengan larutan alkohol 95% kemudian dinding sel bakteri akan menyerap
safranin. Karena bakteri gram negatif didinsing sel mengandung peptodoglikan yang

7
lebih rendah sehingga dinding sel bakteri akan lebih mudah terdehidrasi akibat diberi
perlakuan dengan alkohol. Pemberian larutasn alkohol 95% berfungsi untuk
dekolorisasi bakteri sehingga menyebabkan zat utama dalam sel akan terlihat.
Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan daya permeabilitas dari dinding sel
berkurang sehingga zat warna ungu kristal dapat keluar dari sel kemudian sel akan
menyerap larutan safranin dan ketika sel bakteri dilihat dari mikroskop akan
berwarna merah.
J. Kesimpulan
Peneraan mikrometer okuler dilakukan untuk mengetahui nilai dari satu skala
yang dimiliki sehingga dapat digunakan untuk mengukur kuran sel atau benda
renik. Di dalam peneraan tersebut dibutuhkan bantuan mikrometer objektif
dikarenakan telah diketahui nilai per skalanya, sedangkan mikrometer okuler tidak
diketahui. Setelah peneraan dilakukan dan mendapatkan hasil, untuk pengukuran
sel bakteri tidak boleh menggunakan mikrometer maupun mikroskop yang berbeda,
dikarenakan harga skala yang dimiliki tidak akan sama satu sama lain. Ukuran
setiap bakteri berbeda-beda tergantung jenisnya mulai dari ukuran 1µm.
Pewarnaan secara gram pada bakteri merupakan metode yang digunakan untuk
membagi bakteri kedalam 2 jenis kelompok yaitu bakteri gram positif yang bewarna
ungu diakhir pewarnaan dan bakteri gram negatif yang bewarna merah diakhir
pewarnaan.
Perbedaan warna tersebut dikarenakan pada bakteri gram positif memiliki
dinding sel sebagai lapisan diatas membrane plasma yang relative tebal sehingga
akan mempertahankan warna dari Ammonium oksalat kristal violet sedangkan pada
bakteri gram negatif memiliki lipid yang lebih rendah sehingga dinding sel bakteri
akan mudah terdehidrasi dengan pemberian alkohol dan akan menyerap larutan
safranin.

8
K. Daftar Rujukan
Ansori, M. 2007. Analisa Jumlah Bakteri dan Keberadaan Esoherichis Coli pada
Pengolahan Ikan Teri Nasi Stolephosus di PT. Kelola Mina Laut Unit
Sumenep. Universitas Trunojoyo Madura
Chaeri, A., Kusbiyanto dan Susatyo, P. 2008. Penggunaan Mikroskop, Alat Bantu
Ukur, Jaringan Hewan, dan Morfologi pada Hewan Vertebrata. Biol4441.
Dari: repository.ut.ac.id
Dwidjoseputro, D. 2003. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan
Hastuti, S, U. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang: Universitas
Muhammadiyah Malang
Jayanti, M.W., Bernadetta, O., Moch, Y. 2010. Karakterisasi Bakteri Toleran
Uranium dalam Limbah Uranium Fase Organik TBP-Kerosin. Banten :
Fakultas Teknik Unversitas Sultan Ageng Tirtayasa.
Kusnadi. 2003. Common Textbook (Edisi Revisi) Mikrobiologi. Bandung:
Universitas Pendidikan Indonesia
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja Grafindo
Persada
Pramesti, T. 2000. Mikroskop dan Sel Banjarbaru. Universitas Lampung
Pratita, M.Y.E., Surya, R.P. 2012. Isolaso dan Indentifikasi Bakteri Termofilik dari
Sumber Mata Air Panas di Songgoriti Setelah Dya Hari Inkubasi. Jurnal
Teknik Pomits, Vol. 1, No.1.
Ratnawati, H. 2010. Petunjuk Praktikum Mikroteknik. Yogyakarta: FMIPA UNY
Tarigan, J. 1988. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta

9
L. Diskusi
1. Tulislah hasil perhitungan peneraan harga skala mikrometer okuler pada
pebesaran 400x dan 1000x. Mengapa perlu dilakukan peneraan pada kedua
macam perbesaran tersebut?
Jawaban: Perlu dilakukan peneraan untuk skala mikrometer okuler pada perbesaran
400x dan 1000x dikarenan agar diketahui harga satu skala mikrometer okuler,
sehingga pengukuran sel bakteri mendapatkan angka yang pasti, tidak hanya sekadar
mengira. Kemudian, digunakan perbesaran 400x dan 1000x karena pada perbesaran
tersebutlah sel bakteri lebih terlihat dengan jelas, mengingat ukuran bakteri yang
sangat renik, sehingga pengukuran sel bakteri dapat lebih mudah dilakukan.
2. Tulislah hasil pengukuran sel bakteri yang diamati dalam 3 kali ulangan,
lalu hitunglah nilai reratanya. Mengapa sel bakteri yang berbentuk basil harus
diukur panjang dan diameter selnya, sedang sel bakteri yang berbentuk kokus
hanya diukur diameter sel saja?
Jawaban: Dikarenakan, sel bakteri yang berbentuk kokus hanya memperlihatkan
ukuran dari satu dimensi saja karena bentuk dasarnya adalah bulat, sedangkan untuk
bakteri berbentuk basil memperlihatkan ukuran dari dua dimensi yaitu panjang dan
diameter karena bentuknya seperti batang.
3. Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri gram
negatif dan positif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi dalam proses
pewarnaan gram!
Jawab: zat pewarna merupakan garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,
salah satu diantaranya bewarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat
pada ion poitif dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif.
Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan
terutama oleh adanya sam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi
jika bakteri diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi
dengan ion positif zat pewarna basa, kristal violet, safranin yang merupakan zat
pewarna basa yang biasa digunakan. Hasil pewarnaan bakteri gram positif akan
menghasilkan warna ungu dikarenakan struktur dinding sel pada bakteri banyak
mengandung peptidoglikan sehingga dapat mengikat zat ammonium oksalat kristal
violet dan menghasilkan warna akhir yaitu ungu sedangkat pada bakteri gram negatif
kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinananya jauh
lebih sedikit disbanding bakteri gram positif sehingga ketika diberi alkohol dinding
sel bakteri akan mudah terdehidrasi dan akan menyerap larutan safranin dan
memiliki warna akhir yaitu warna merah.

10
M. Lampiran
Tabel Gambar Hasil Pengamatan
Gambar Keterangan Gambar
Tipe: Basil Tipe: Basil
Gram: Negatif Gram: Negatif
Panjang: 8 µm Panjang: 7 µm
Diamater: 2 µm Diamater: 2 µm

Tipe: Basil Tipe: Basil

Gram: Negatif Gram: Negatif
Panjang: 7 µm Panjang: 5 µm
Diamater: 3 µm Diamater: 2 µm

11