LAPORAN PRATIKUM BAKTERIOLOGI I

PEWARNAAN GRAM

DISUSUN OLEH

NAMA : INDAH MAULIDYA IRIANTI

NIM : B1D120100
KELAS : 2020 C
KELOMPOK : 2 (DUA)

PROGRAM STUDI D - IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

FAKULTAS ILMU TEKNOLOGI KESEHATAN
UNIVERSITAS MEGA REZKY
TAHUN 2020/2021
 LEMBAR PENGESAHAN

Judul Pratikum : Pewarnaan Gram

Nama: Indah Maulidya Irianti
Nim; B1D120100
Hari/Tanggal: Sabtu,10 Juli 2021
Kelompok: II (Dua)
Rekan Kerja: 1. Hasri Ninis
2. Dini Alvionita Rasid
3. Charles Lidang Djawa
4. Venna Melinda
5. Cindi Claudia Pangga
6. Dila Safutri
Penilaian:

Makassar, 27 Agustus 2021

Asintensi Pratikan

Habibah Gali S,tr.Kes Indah Maulidya Irianti

Nim : B1D120100

Dosen Pembimbing

Nirmawati Angria S.Si,M.Kes

NIDN: 091 8068 702
 BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sanga
kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara
0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat,
batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan
suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam
hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel
individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau
spiral(heliks). (Anisa, 2016).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-
sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan
warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. (Anisa, 2016).
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan
yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel
mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Teknik pewarnaan warna pada
bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada
bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana. (Anisa, 2016).
 Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial. Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan gram terbagi
dua golongan, yaitu: gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol
gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak
ungu tua; dan gram negatif, bila warna zat pewarna pertama  tidak
bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal:
air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Anisa,
2016).
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu gram positif dan
gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini,
berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan
ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting;
dinding sel bakteri gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang
dimiliki bakteri gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri gram
negatif lebih tinggi daripada gram positif. Kenyataannya dalam
eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol
mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding
sel meningkat. (Anisa, 2016)
Dengan demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat
disari keluar dan bakteri gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang
hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara
kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri gram negatif kandungan
peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih
sedikit daripada baktri gram posiif. (Anisa, 2016).
Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri gram negatif tetap masih
cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan
lugol. Selautnya, bila sel-sel gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk
menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas
atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian
violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan
 ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri gram positif itu yag
menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian
violet. (Anisa, 2016).
B. Tujuan pratikum
Tujuan dari pratikum ini untuk mnegetahui bentuk dan morfologi

dari bakteri gram positif dan gram negatif serta dapat melakukan prosedur

pembuatan gram.
 BAB II

TINJAU PUSTAKA

Bakteri (dari kata Latin bacterium; jamak: bacteria) adalah kelompok

organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke

dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta

memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri

dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya

dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri. Struktur

sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-

organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi dasar

perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks. (Adelia,

dkk. 2016).

Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat: di tanah, air, udara,

dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen),

bahkan dalam tubuh manusia. Pada umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 μm, tetapi

ada bakteri tertentu yang dapat berdiameter hingga 700 μm, yaitu Thiomargarita.

Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi

dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan). Beberapa jenis bakteri

bersifat motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel.

(Adelia, dkk. 2016).

 Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan

gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.Metode ini

diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram

(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pewarnaan

gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan

bentuknya. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)

ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif

menjadi berwarna merah atau merah muda.

Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini

berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. (Rina, 2019).

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1. Zat warna utama (violet kristal)

2. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk

mengintensifkan Mwarna utama.

3. Pencuci atau peluntur zat warna (alcohol atau aseton) yaitu solven organic

yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

4. Zat warna kedua atau cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai

Kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga

alcohol.

a. Bakteri Gram Negatif

 Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara

bakteri gram negative tidak. Rina, 2019)

Menurut Lestari Rina (2019) ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau

multilayer.

2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),

peptidoglikan terdapat didalam

3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat

kering, tidak mengandung asam tekoat. Pewarnaan Bakteri 10

4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya

kristal violet.

6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

9. Peka terhadap streptomisin

10. Toksin yang dibentuk Endotoksin

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil

ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru

atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan

 berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini

terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. (Rina.2019).

Menurut Rina (2019) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau

monolayer.

2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan

ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari

50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

8. Tidak peka terhadap streptomisin

9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu

lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat

diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki

selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan

kristal violet, pori- pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol

sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin
akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram

negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. (Rina, 2019).

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan

paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan

pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak

sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan

pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri

gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan

bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis

membran sel. (Rina, 2019).

Prinsip pewarnaan gram yaitu dinding sel bakteri gram positif terdiri dari

pepttidoglikan yang tebal , sedangkan dinding sel bakteri gram negative

mempunyai kandungan lipid yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram

postif. Pada bakteri gram positif akan terbentuk persenyawaan kompleks Kristal

violet yang tidak larut dalam pemucat. Pada gram negatif memiliki kandungan

Lipid yang tebal, lipid ini akan larut dalam alkohol dan aseton yang digunakan

sebagai larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan

meningkatkan daya larut kompleks Kristal violet pada dinding sel bakteri gram

negative. Sehingga penambahan zat warna terakhir menyebabkan sel bakteri

warna merah, karena persenyawaan kompleks Kristal violet larut dan dinding sel

kemudian mengikat zat warna terakhir. (Rina, 2019).

 BAB III

METODE PRATIKUM

A. Waktu Pratikum

1. Waktu

Adapun waktu yang digunakan dalam pratikum pewarnaan Basil Tahan

Asam (BTA) kali ini adalah:

Hari : Sabtu

Tangal : 10 Juli 2021

Jam : 13.00-16.00 WITA

2. Tempat

Adapun dilakukan pratikum Bakteriologi 1 yaitu di laboratorium

Mikrobiologi D-IV Teknologi Laboratorium lantai 1 gedung D Universitas

Mega rezky.

B. Alat dan Bahan

1. Alat-alat

a. Objek glass

b. Ose/nald
 c. Rak Pewarnaan

d. Gegep Kayu

e. Bunsen

f. Mikroskop

2. Bahan-bahan

a. Aquadest

b. Zat warna kristal gentian violet

c. lugol, alkohol 96 %,

d. air fuchsin

e. Media (Biakan )

C. Prinsip Kerja

Dinding sel bakteri gram positif terdiri dari pepttidoglikan yang

tebal , sedangkan dinding sel bakteri gram negative mempunyai

kandungan lipid yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram postif.

Pada bakteri gram positif akan terbentuk persenyawaan kompleks Kristal

violet yang tidak larut dalam pemucat. Pada gram negative memiliki

kandungan Lipid yang tebal, lipid ini akan larut dalam alkohol dan aseton

yang digunakan sebagai larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding sel

membesar dan meningkatkan daya larut kompleks Kristal violet pada

dinding sel bakteri gram negative. Sehingga penambahan zat warna

terakhir menyebabkan sel bakteri warna merah, karena persenyawaan

kompleks Kristal violet larut dan dinding sel kemudian mengikat zat

warna terakhir
D. Cara Kerja

1. Dibuat preparat ulas dengan mengulaskan 1-2 ose biakan bakteri di atas

objek glass dan difikasasi dengan melewatkannya diatas api.

2. Diteteskan kristal violet sebagai pewarna utama pada kedua

preparat ,usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama ± 1 menit.

Cuci dengan air mengalir

3. Diteteskan 2-3 tetes larutan mordant (lugol,s iodine) lalu tunggu ± 1

menit.

4. Diberi larutan pemucat (alkohol 96%/) setetes demi setetes hingga etanol

yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak

(overdecolorize). Cuci dengan air mengalir.

5. Diteteskan air fuchsin dan tunggu selama ± 1 menit. Cuci dengan air

mengalir.

6. Dikeringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan

(jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara.

7. Diamati dengan mikroskop perbesaran 40 x dan 100 x (menggunakan oil

emersi)
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Tabel Pengamatan

NO Preparat Interprestasi

B. 1 Morfologi Bakteri Basil (batang)

Gambar
2 Warna1.1 Bakteri Biru Keterangan

3 Zat Warna Hasil violet,

Kristal yang ditemukan olehfucshin
lugol, carbon pratikan bakteri
Alkohol

berbentuk
96% dan NACLbasil dengan pembesaran 100x
0,9%.

menggunakan oil imersi

Gambar Pengamatan

C. Pembahasan

Pada pratikum pewarnann gram positif yang dilakukan pada hari Kamis

tanggal 10 Juli 2021 yang dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi

Universitas Mega Rezky Makassar di lantai 1.

Bakteri (dari kata Latin bacterium; jamak: bacteria) adalah kelompok organisme

yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain

prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar

dalam kehidupan di bumi (Anisa, 2019).

Fungsi-fungsi Zat warna pada Pewarnaan gram :

a. Kristal violet

Memberikan warna ungu pada bakteri gram positif karena disebab

kan kompleks zat warna Kristal violet dengan dinding sel bakteri.

b. Larutan lugol

1. Meningkatkan afinitas pengikatan zat warna Kristal violet oleh bakteri

sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat.

2. Setelah penambahan lugol, zat warna Kristal violet lebih jelas terlihat.

3. Setelah penambahan lugol zat warna Kristal violet lebih sulit dilarutkan

4. Tanpa penambahan lugol, zat warna Kristal violet akan larut sewaktu

penambahan larutan pemucat, sehingga bakteri gram positif tidak akan

berwarna ungu.

c. Larutan Pemucat

Bakteri gram positif tetap berwarna ungu karena kompleks

persenyawaan Kristal violet-lugol tetap terikat pada dinding sel. Bakteri

gram negative berwarna pucat atau tidak berwarna karena larutan

pemucat melarutan lipida dan menyebabkan pori-pori dinding sel

membesar, sehingga meningatkan daya larut persenyawaan Kristal

violet-lugol.
 d. Air fuchsin

Pada bakteri gram negative , penambahan air fuchsin menyebabkan sel

bakteri berwarna merah , karena persenyawaan kompleks Kristal violet –lugol

larut dan dinding sel kemudian mengikat zat warna kedua.Pewarnaan Gram atau

metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri

menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan

sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.Metode ini diberi nama berdasarkan

penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang

mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara

pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. (Rina, 2019).

Adapun hal pertama yang dilakukan pada saat melakukan pewarnaan gram

adalah sterilisasi kaca objek dengan cara di bersihkan menggunakan alkohol 70%.

Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua

mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan

digunakan.

Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada

kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi diatas api pada pembakar spiritus

yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak

tercampur dengan bakteri yang akan di uji. Sebelum melakukan pengolesan

bakteri kaca objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk

melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi.(Iman, 2019).

 Kemudian ambil biakan pada media sampel, lalu oleskan pada kaca objek

setelah itu teteskam cristal violet hingga menutupi olesan. Diamkan Selama 1

menit kemudian cuci menggunakan air mengalir. Lalu teteskan 1-2 tetes lugol

selamat 1 menit. Setelah itu teteskan Kembali akkohol 96% hingga memucat

jangan terlalu banyak.

Kemudian cuci menggunakan air mengalir. Dan tetaskan zat pewarna

terakhir yairtu carbon fucshin selamat 1 menit kemudian, bilas menggunakan air

mengalir dan keringkan. Lalu amati dibaw mikroskop menggunkan pembesaran

10x,40x dan 100x menggunnakan oil imersi

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu

pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah

24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang

dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion

tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang

bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka

zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna

adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif..(Iman, 2015).
 BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dalam pratikum yang telah dilakunkan dapat diketahui prosedur

pembuatan pewarnaan gram, bentuk bakterik dan susunan dari bakteri

tersebut. Juga dapat disimpulkan hasil pengamatan didapat bakteri

berbentuk basil dengan mengikat zat pewarna cristal violet.

 DAFTAR PUSTAKA

Zukhurf Adelia, dkk. 2016.”Laporan Pewarnaan gram positif dan

negatif”. Jawa Timur:SMA Negeri 3 Malang.

Anisa wulansari.2016.” Laporan pratikum Mikrobiologi dasar”.

Universitas Purwokerto:Jendral Soedirman.

Firmansyah Iman. 2015.” Laporan Pratikum Mikrobiologi Farmasi

pewarnaan sederhana.” Universitas padjajaran : Bandung

Lestari Rina.2019’’. Makalah Pewarnaan sederhana negatif,kapsul dan

gram’’. Yogyakarta: Sekolah ilmu Kesehatan

Wenny Surya. 2018. ” Modul Mikrobiologi”. Sumatra barat : Univesitas Andalas.