MAKALAH BIOTEKNOLOGI

PRINSIP DAN METODE TEKNIK WESTERN BLOT

Disusun Oleh :

1. Alfin Asiatul Hurriyah (152210101141)

2. Annisa Shalihah (162210101065)
3. Ajeng Putri Devinta (162210101135)

KELOMPOK 12

LABORATORIUM BIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2018
 KATA PENGANTAR
Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha Panyayang, kami panjatkan
puja dan puji syukur atas kehadirat-Nya, yang telah melimpahkan rahmat, hidayah, dan inayah-Nya
kepada kami, sehingga kami dapat menyelesaikan makalah Bioteknologi Famrasi mengenai Western
Blot.

Adapun makalah ini telah kami usahakan semaksimal mungkin dan tentunya dengan bantuan
berbagai pihak, sehingga dapat memperlancar pembuatan makalah ini. Untuk itu kami tidak lupa
menyampaikan banyak terima kasih kepada pihak yang telah membantu kami dalam pembuatan
makalah ini. Namun tidak lepas dari semua itu, kami menyadari sepenuhnya bahwa ada kekurangan
baik dari segi penyusun bahasanya maupun segi lainnya. Oleh karena itu, bagi pembaca yang ingin
memberi saran dan kritik kepada kami sehingga kami dapat memperbaiki makalah Bioteknologi
Farmasi ini.

Akhirnya penyusun mengharapkan semoga dari makalah ini kita dapat mengambil hikmah dan
manfaatnya sehingga dapat memberikan inspirasi terhadap pembaca.

Penulis

i|Page
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR...................................................................................................................................i
DAFTAR ISI..............................................................................................................................................ii
DAFTAR GAMBAR..................................................................................................................................iii
BAB I.......................................................................................................................................................1
PENDAHULUAN......................................................................................................................................1
BAB II......................................................................................................................................................2
PEMBAHASAN........................................................................................................................................2
2.1 Sejarah Dan Pengertian..........................................................................................................2
2.2 Tujuan & Aplikasi Teknik Western Blot...................................................................................2
2.3 Prinsip Kerja Western Blot......................................................................................................3
2.4 Langkah Kerja Western Blot...................................................................................................3
1. Preparasi Sampel....................................................................................................................4
2. Elektroforesis..........................................................................................................................4
3. Elektrotransfer........................................................................................................................5
4. Deteksi....................................................................................................................................6
5. Analisis....................................................................................................................................7
2.5 Aplikasi Western Blot.............................................................................................................7
2.6 Kelebihan Western Blot..........................................................................................................8
2.7 Kekurangan Western Blot.......................................................................................................9
BAB IV...................................................................................................................................................10
PENUTUP..............................................................................................................................................10
KESIMPULAN............................................................................................................................10
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................................................11

ii | P a g e
 DAFTAR GAMBAR
Gambar 2. 1 Langkah Kerja Western Blot...............................................................................................7
Gambar 2. 2 Elektroforesis.....................................................................................................................8
Gambar 2. 3 hasil deteksi Western Blot...............................................................................................10

iii | P a g e
 BAB I

PENDAHULUAN

1|Page
 BAB II

PEMBAHASAN

1. Sejarah Dan Pengertian

Western blotting (WB) atau protein immunoblotting adalah teknik laboratorium yang populer
untuk mendeteksi protein tertentu dari sampel sel atau jaringan. Teknik awalnya dijelaskan oleh
Towbin dkk. pada tahun 1979 dan namanya diciptakan oleh Burnette pada tahun 1981 untuk
mencocokkan teknik serupa yang digunakan untuk mendeteksi DNA, (seperti Southern blotting, dan
RNA, Northern blotting). WB membutuhkan protein yang terpisah sesuai dengan ukurannya dengan
elektroforesis gel. Kemudian diikuti oleh electrotransfer protein ke membran yang diperiksa dengan
antibodi protein yang diminati. Teknik ini sangat ampuh untuk mendeteksi keberadaannya dari
protein tertentu dalam sampel, untuk menilai modifikasi posttranslasional seperti itu sebagai
fosforilasi dan untuk mengkarakterisasi kompleks protein.

Umumnya, definisi Western Blotting (WB) adalah teknik yang paling umum digunakan untuk
mendeteksi protein spesifik dalam sampel biologis. Ini menggunakan prinsip sederhana untuk
memisahkan protein sesuai ukurannya dan mengikatnya ke pendukung yang memungkinkan
pendeteksiannya dengan antibodi spesifik.

2. Tujuan & Aplikasi Teknik Western Blot

Aplikasi penelitian utama uji WB adalah mendeteksi keberadaan protein dalam berbagai sistem.

Bisa digunakan untuk menentukan ekspresi dari protein tertentu dalam organel, sel, jaringan,
atau embrio / organisme utuh.

Penerapan lain WB adalah penilaian modifikasi posttranslasional protein target seperti fosforilasi
(dengan antibodi spesifik fosfat).

Ekspresi protein tertentu atau dalam cairan tubuh dapat digunakan untuk diagnosis suatu
penyakit. Misalnya, WB digunakan untuk mendeteksi protein prion yang menyebabkan bovine
spongiform encephalopathy, bovine spongiform ensefalopati (BSE) pada sapi .

Dalam kedokteran, sering digunakan sebagai konfirmasi uji [biasanya dalam kombinasi dengan
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)] dalam diagnosis beberapa penyakit seperti penyakit
lyme atau HIV.

Teknik ini memiliki beberapa keuntungan seperti :

1. Teknik ini mampu mendeteksi protein dengan sensitivitas tinggi karena protein dipekatkan
dalam volume kecil.
2. Waktu yang dibutuhkan efisien.
3. Reagens yang digunakan lebih ekonomis.
2|Page
 3. Prinsip Kerja Western Blot

Western Blot juga dikenal sebagai protein immunoblotting karena antibodi digunakan untuk
mendeteksi antigennya secara spesifik dengan cara memisahkan dan mendeteksi protein spesifik
dalam campuran kompleks yang diambil dari sel atau jaringan. Dalam teknik ini campuran protein
dipisahkan berdasarkan berat molekul melalui gel elektroforesis.

Prinsip kerja Western Blot yaitu ikatan antigen-antibodi kompleks dimana mendeteksi protein
spesifik pada sampel jaringan yang homogen maupun dari sampel ekstraksi antibodi dapat mengikat
protein tertentu (antigen) pada protein yang diimobilisasi pada membran sehingga dapat dideteksi.
Sebelum berikatan dengan antibodi maka terlebih dahulu memisahkan antigen (protein) berdasarkan
berat molekul menggunakan gel elektroforesis. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah
membran yaitu berupa nitroselulosa atau PVDF. Setelah itu, mereka akan dilacak dengan
menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target (antigen). Agar dapat terlihat ikatan
antara antigen-antibodi komplek maka perlu diberi warna pada antigen-antibodi tersebut.

Pada metode pemberian warna dapat digolongkan menjadi dua, yaitu direct dan indirect. Direct
berarti antibodi primer yang dapat berikatan secara spesifik dengan antigen telah ditempeli substrat
yang mengandung warna. Sedangkan pada indirect perlu adanya selanjutnya antibodi sekunder akan
berikatan dengan substrat berwarna, sehingga dapat dideteksi.

4. Langkah Kerja Western Blot

Western Blot dapat dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu :

Gambar 2. 1 Langkah Kerja Western Blot

3|Page
 5. Preparasi Sampel
Sebelum protein kompleks dipisahkan dengan gel elektroforesis maka perlu dilakukan preparasi
sampel. Sampel terdiri dari protein kompleks campuran sel atau ekstrak dari jaringan atau dapat
menggunakan sampel protein yang telah dimurnikan.

Antibodi yang digunakan dapat berupa antibodi monoklonal maupun poliklonal, namun antibodi
monoklonal lebih baik digunakan karena dapat menghantarkan sinyal dengan baik, memiliki
spesifisitas yang lebih tinggi, dan hasil yang didapat lebih jernih pada proses pembuatan film western
blot. Sedangkan kelebihan pada antibodi poliklonal dapat mengenali lebih banyak epitop.

Untuk mendapatkan protein yang diinginkan perlu adanya pelisisan sel. Jika yang kita inginkan
protein yang terfosforilasi, maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada
protein tidak ikut terbuang. Cara melisisnya yaitu dengan mensentrifuga lalu dijaga agar tetap dingin
dengan diletakkan didalam kotak es yang telah ditambahkan buffer lisis.

6. Elektroforesis

Gambar 2. 2 Elektroforesis

Pada tahap elektroforesis, protein yang diinginkan (antigen) dipisahkan dari sampel (protein
kompleks) dengan menggunakan gel elektroforesis berdasarkan berat molekul, panjang polipeptida,
atau struktur 3D-nya . Elektroforesis merupakan metode pemisahan protein berdasarkan pergerakan
molekul pada lingkungan yang bermuatan listrik. Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang
mengandung protein akan dicampur dengan SDS dimana SDS (sodium dodecyl sulfate) merupakan
detergent yang memilki muatan negatif. Muatan negatif pada SDS dapat mengganggu kestabilan
pada protein, hal ini menyebabkan protein mengalami denaturasi. Adanya interaksi ionik, ikatan
hidrogen, dan jembatan disulfida yang menyebabkan suatu protein mengalami folding (saling
berlipatan) untuk menjaga kestabilannya menjadi terganggu karena adanya SDS. Maka sampel
protein akan membentuk suatu rantai polipeptida lurus karena protein multimer dalam sampel akan
terurai menjadi monomer-monomer penyusunnya. Maka dapat disimpulkan bahwa semakin besar
berat molekul suatu protein, maka rantai polipeptida akan semakin panjang.

4|Page
 Setelah itu, sampel yang merupakan rantai polipeptida lurus dimasukkan dalam membran
poliakrilamid yang telah dialiri arus listrik. Selanjutnya, protein tersebut akan bergerak dari kutub
negatif menuju kutub positif karena protein tersebut telah bermuatan negatif. Pada protein yang
memiliki ukuran besar laju pergerakannya dalam membran poliakrilamid menjadi lebih lambat
dibandingkan dengan protein yang memiliki ukuran kecil karena adanya perbedaan daya hambat
antara protein dan membran, dimana protein yang berukuran lebih besar memiliki daya hambat yang
besar. Saat setelah dialiri arus listrik selang beberapa jam, masing-masing protein tersebut akan
terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Dalam gel poliakrilamid akan terbentuk pita-pita protein
yang terpisah berdasarkan berat molekulnya, jika protein yang lebih besar akan bergerak lebih
lambat dibandingkan dengan protein yang lebih kecil dimana protein yang lebih kecil akan bergerak
lebih jauh.

7. Elektrotransfer
Tahap ketiga pada Western Blot yaitu Elektrotransfer. Elektrotransfer adalah pemindahan
protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer yang menggunakan arus listrik sebagai faktor
pendorong pada transfer protein. Elektrotransfer bisa dilakukan dengan dua metode, yaitu :

a. Blotting semikering

Pada transfer blotting semikering ini dilakukan kurang lebih 30 menit yang dialiri arus
listrik tertentu. Blotting semikering ini bahan yang digunakan berupa kertas saring yang
telah dibasahi dengan buffer transfer. Lalu kertas saring tersebut diletakkan diantara gel
transfer dan gel poliakrilamid.

b. Blotting Basah

Pada blotting basah tidak menggunakan kertas saring seperti pada blotting
semikering, melainkan kedua gel tersebut dihimpitkan dan direndam dalam buffer
transfer. Transfer pada blotting basah dapat dilakuka dalam waktu 45 menit sampai 1 jam.
Metode ini banyak dilakukan karena lebih fleksibel dibandingkan blotting semikering.

Gel transfer yang banyak digunakan pada Western Blot yaitu nilon dan nitroselulosa. Namun
sebagian besar, nitroselulosa lebih banyak digunakan karena relatif murah, cepat dilakukan, dan
bloking mudah. Nilon juga digunakan dalam keadaan tertentu, pertama karena kapasitas pengikatan
pada nilon dengan protein jauh lebih besar daripada kapasitas pengikatan nitroselulosa dengan
protein, kedua ikatan antara nitroselulosa dengan protein sangat lemah, dan ketiga penggunaan
nilon dapat mengurangi tekanan mekanik yang timbul.

Faktor-faktor yang harus diperhatikan pada saat transfer protein dari gel poliakrilamid menuju
gel transfer :

1) Arus listrik yang dialiri harus dalam keadaan yang sesuai, karena arus listrik yang terlalu
tinggi dapat menghasilkan panas selama transfer, sehingga menyebabkan adanya
kerusakan pada protein yang ditransfer.

2) Arus listrik yang dapat digunakamn yaitu 200 mA selama kurang lebih 2 jam
5|Page
 3) Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, maka penggunaan gel harus
dengan konsentrasi poliakrilamid yang rendah.

4) Kekuatan ion yang rendah pada buffer transfer dapat digunakan pada tegangan listrik
yang tinggi karena tidak akan bisa menghasilkan panas yang tinggi.

8. Deteksi

Gambar 2. 3 hasil deteksi Western Blot

Tahap keempat yaitu tahap deteksi protein yang telah ditransfer ke membran transfer. Pada
deteksi protein memanfaatkan interaksi antara antigen dengan antibodi yang spesifik. Metode-
metode yang digunakan bervariasi yang terletak pada penggunaan antibodi primer dan sekunder,

6|Page
serta pada penggunaan molekul penanda. Berdasarkan pada penggunaan antibodi primer dan
sekunder, dibedakan menjadi dua metode, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada
metode langsung hanya digunakan antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker.
Sedangkan untuk metode tidak langsung menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Antibodi primer sendiri berfungsi untuk berikatan dengan protein target, sedangkan antibodi
sekunder berguna untuk mengikat antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul penanda.
Molekul penanda yang digunakan juga bermacam-macam. Molekul penanda yang umumnya banyak
digunakan yaitu enzim alkalin fosfatase(AP), enzim horsedish peroksidase (HRP), dan immunogold.
Masing-masing molekul penanda tersebut memiliki kekurangan dan kelebihan, misalnya pada
molekul penanda immunogold memilki sensitifitas paling tinggi yaitu antara (1-25 pg) dibandingkan
dengan penanda yang lain. Sedangkan untuk enzim HRP dan AP memiliki sensitivitas rendah yaitu 10-
20 pg dan 10-50 pg.

9. Analisis
Tahap yang terakhir yaitu tahap analisis. Pada tahap ini dapat digunakan berbagai macam cara
dalam menganalisis, yaitu :

a. Colorimetric detection

Metode ini akan digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan enzim sehingga dapat
mewarnai membran nitorselulosa dan dapat dideteksi.

b. Chemiluminescent
Metode ini akan digunakan jika substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan
antibodi sekunder atau dengan enzime akan tereleminasi. Dan hasilnya diukur dengan
densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik yang paling banyak
digunakan sekarang yaitu dengan menggunakan Enhanced Cheiluminescent (ECL) karena
dinilai paling canggih.

c. Radioactive detection

Metode ini menggunakan sinar X dan akan menimbulkan daerah gelap pada label. Namun
metode analisis dengan ini sangat mahal dan beresiko tinggi terhadap kesehatan.

d. Fluorescent detection

Pelacak dapat digunakan untuk label yang dapat mengalami fluorosensi yang kemudian
dideteksi oleh fotosensor seperti kamera CCD yang dapat menangkap image digital dari
Western Blot. Hasil kemudia dapat dianalisi secar kuantitatif maupun kualitatif. Metode ini
paling banyak digunakan karena bersifat lebih sensitif.

10. Aplikasi Western Blot

Western Blot dalam bidang penelitian dapat digunakan untuk mendeteksi suatu protein tertentu
atau yang diinginkan.

7|Page
 Western Blot dalam bidang kesehatan dapat digunakan untuk diagnosa suatu penyakit salah
satunya yaitu HIV/AIDS. Tes dengan teknik Western Blot dilakukan dengan pengambilan darah yang
dapat digunakan untuk mendeteksi adanya protein tertentu yang dihasilkan oelh sistem kekebalan
tubuh sebagai respon terhadap virus. Namun saat ini tes dengan Western Blot sudah jarang
digunakan untuk mendiagnosa HIV dan sekarang lebih banyak yang menggunakan tes ELISA untuk
mendiagnosa HIV. Karena tes dengan Western Blot lebih rumit untuk dilakukan, dimana masih harus
dilakukan pemisahan pada sampel darah dengan arus listrik dan dipindahkan ke selembar kertas
blotting. Lalu ditambahkan enzim untuk menyebabkan perubahan warna yang mengindikasikan
adanya antibodi HIV.

Tes ELISA lebih banyak digunakan karena bersifat lebih sensitif dibandingkan dengan tes Western
Blot. Namun terkadang tes ELISA dapat menimbulkan adanya positif palsu, karena tes dengan ELISA
dinilai sangat sensitif. Infeksi lain seperti lupus, penyakit Lyme, dan PMS lainnya dapat menyebabkan
positif HIV palsu pada tes ELISA. Karena itu, hasil tes ELISA yang positif perlu dikonfirmasi melalui tes
lain, salah satunya dengan Western Blot. Namun jika dengan tes ELISA dan Western Blot
menunjukkan HIV maka dapat dipastikan bahwa seseorang tersebut positif terkena infeksi HIV.

Bahkan jika dengan tes ELISA maupun Western Blot menunjukkan hasil yang negatif, maka tidak
aman jika kita berasumsi bahwa orang tersebut tidak mengidap HIV jika potensi virus tersebut terjadi
dalam waktu 3 bulan setelah tes. Karena dalam mendeteksi adanya HIV atau tidak, perlu dibutuhkan
waktu yang lama agar dapat terdeteksi. Dalam kasus ini seseorang harus mengulangi pengujian
dalam 3 bulan dan melakukan tindakan pencegahan yang tepat untuk mencegah penyebaran infeksi
potensial. Dan jika setelah melakukan pengujian secara berturut-turut dan menunjukkan hasil yang
negatif maka dokter tidak akan merekomendasikan untuk pengujian lebih lanjut.

11. Kelebihan Western Blot

1) Sensitivitas

Western Blot memiliki kepekaan yang tinggi yaitu kemampuannya dalam mendeteksi
kurang lebih 0,01 gram dalam sampel, teknik ini sangat berfungsi sebagai diagnostik dini yang
efektif, karena dapat merasakan respon imunogenik sekecil apapun dari virus atau bakteri
pada sampel dari pasien. Western Blot memiliki kepekaan tinggi karena didasarkan pada
kemampuan antibodi sekunder dalam memperkuat sinyal. Sensitivitas yang lebih besar berarti
berarti lebih sedikit antibodi yang dibutuhkan untuk pengjian sehingga dapat mengurangi
biaya laboratorium secara signifikan.

1) Spesifisitas
Teknik Western Blot memiliki kekhususan yang tinggi. Pertama, gel elektroforesis dapat
memilah sampel mejadi protein dengan ukuran, muatan, dan konformasi yang berbeda.
Adanya kekhususan membuat tes dengan western blot mudah untuk dideteksi karena
sifatnya yang spesifik, karena pada hasil akhir telah menunjukkan ukuran protein dan
polipeptida yang diminati. Dan spesfisitas interaksi antigen-antibodi membuat dapat
dideteksi. karena antibodi spesifik menunjukkan afinitas untuk protein tertentu, dimana
proses tersebut dapat secara selektif mendeteksi protein targer bahkan dalam campuran
300.000 protein yang berbeda.

8|Page
 12. Kekurangan Western Blot

1) Sering Terjadi Kesalahan pada Hasil

Western Blot dapat menghasilkan positif palsu saat antibodi bereaksi dengan protein
yang tidak diinginkan. Kesalahan yang sering terjadi yaitu ketika seseorang melakukan
pelaksanaan tes HIV dan menunjukkan hasil yang positif palsu. Hal ini sering terjadi pada
pasien pengidap lupus, penyakit Lyme,TBC dan PMS yang akan menunjukkan hasil postif
palsu. Negatif palsu juga dapat terjadi jika protein yang memiliki ukuran molekul yang besar
sehingga tidak dapat ditransfer ke membran.
Adanya kesalahan pada teknisi pada pemrosesan sehingga dihasilkan gambaran yang
tidak jelas.
2) Biaya yang Mahal
Proses yang dibutuhkan pada Western Blot rumit dan membutuhkan ketepatan dalam
setiap langkah untuk identifikasi yang tepat dari unsur penyusun sampel. Adanya kesalahan
kecil pada konsentrasi reagen atau pada masa inkubasi merupakan kegagalan dari
keseluruhan proses. Maka hal ini membuat semua biaya yang dikeluarkan akan sia-sia.

Ditambah lagi alat laboratorium yang digunakan cukup banyak dan mahal seperti neon,
radioaktif, Colorimetric detection, Chemiluminescent, Fluorescent, dan lain-lain

9|Page
 BAB IV

PENUTUP
KESIMPULAN

Western Blotting (WB) adalah teknik yang paling umum digunakan untuk mendeteksi protein
spesifik dalam sampel biologis. Ini menggunakan prinsip sederhana untuk memisahkan protein sesuai
ukurannya dan mengikatnya ke pendukung yang memungkinkan pendeteksiannya dengan antibodi
spesifik.

Aplikasi penelitian utama uji WB adalah mendeteksi keberadaan protein dalam berbagai sistem.

Prinsip kerja Western Blot yaitu ikatan antigen-antibodi kompleks dimana mendeteksi protein
spesifik pada sampel jaringan yang homogen maupun dari sampel ekstraksi antibodi dapat mengikat
protein tertentu (antigen) pada protein yang diimobilisasi pada membran sehingga dapat dideteksi.
Sebelum berikatan dengan antibodi maka terlebih dahulu memisahkan antigen (protein) berdasarkan
berat molekul menggunakan gel elektroforesis.

Western Blot dapat dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu Preparasi Sampel, Elektroforesis,
Elektrotransfer, Deteksi, dan Analsis.

Aplikasi Western Blot dalam bidang penelitian dapat digunakan untuk mendeteksi suatu protein
tertentu atau yang diinginkan. Sedangkan dalam bidang kesehatan dapat digunakan untuk diagnosa
suatu penyakit salah satunya yaitu HIV/AIDS. Namun tes dengan Western Blot jarang digunakan
karena pengujiannya lebih rumit dan kurang sensitif dibandingkan dengan ELISA.

Kelebihan Western Blot adalah memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi. Sedangkan
kekurangannya sering terjadi kesalahan pada hasil seperti positif palsu dan negatif palsu dan biaya
yang dikeluarkan mahal.

10 | P a g e
 DAFTAR PUSTAKA
Andrews, N. (2017, April 24). Advantages and Disadvantages of Western Blot. Dipetik Maret 6, 2018,
dari SCIENCING: https://sciencing.com/advantages-disadvantages-western-blot-
8670663.html

D.M. Bollag, M. R. (1996). Protein Method. Wiley Liss Inc.

Davidson. (2000). Dipetik Maret 6, 2018, dari Western Blot Procedure:

http://www.bio.davidson.edu/course/genomics/method/westernblot.html

Fatchiyah, d. (2011). Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.

Fletcher, J. (2017, Maret 7). Medical News Today. Dipetik Maret 2018, 6, dari Western blot and ELISA
tests for HIV: What to expect: https://www.medicalnewstoday.com/articles/316230.php

Jalali, M. (2017). Basic Science Method for Clinical Researches.

Roehm, J. K. (t.thn.). Color Atlas of Biochemistry. Dalam second edition. Thieme: revised and enlarged
.

T.J. Kindt, R. B. (2007). Kuby Immunology. New York: W.H. Freeman.

Yang, T. M.-C. (2012, September 4). NCBI. Dipetik Maret 6, 2018, dari Western Blot: Technique,
Theory, and Trouble Shooting: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/?
report=classic

11 | P a g e