SNI 7662-3-2021 IMNV - Komtek

“Hak cipta Badan Standardisasi Nasional, copy standar ini dibuat untuk Komite Teknis 65-07 Perikanan Budidaya,
dan tidak untuk dikomersialkan”

SNI 7662-3:2021
Standar Nasional Indonesia
Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) -

Bagian 3: Metode quantitative real-time Reverse
Transcription - Polymerase Chain Reaction
(qRT- PCR) menggunakan hydrolysis probe
ICS 65.150
“Hak cipta Badan Standardisasi Nasional, copy standar ini dibuat untuk Komite Teknis 65-07 Perikanan Budidaya, dan tidak untuk dikomersialkan”
SNI 7662-3:2021
Daftar Isi
Daftar Isi .................................................................................................................................... i

Prakata ..................................................................................................................................... ii
Pendahuluan............................................................................................................................ iii
1 Ruang lingkup .................................................................................................................... 1
2 Acuan normatif................................................................................................................... 1
3 Istilah dan definisi .............................................................................................................. 1
4 Prinsip umum ..................................................................................................................... 3
5 Peralatan ........................................................................................................................... 3
6 Bahan ................................................................................................................................ 4
7 Prosedur ............................................................................................................................ 5
8 Interpretasi hasil ................................................................................................................ 7
9 Jaminan mutu pengujian.................................................................................................... 7
10 Pelaporan hasil ................................................................................................................ 7
Lampiran A (informatif) Pembuatan larutan standar positif ..................................................... 8
Lampiran B (informatif) Contoh gambar kurva dan tabel jumlah salinan (copy) RNA ............. 9
Lampiran C (informatif) Ekstraksi RNA dengan metode spin column .................................... 12
Bibliografi ............................................................................................................................... 13
Tabel 1 - Jenis, organ target dan volume contoh uji ................................................................ 5

Tabel 2 - Komposisi qRT-PCR master mix IMNV .................................................................... 6
Tabel 3 - Pengaturan suhu, waktu dan siklus amplifikasi ........................................................ 6
Tabel B.1 - Contoh laporan hasil kuantifikasi salinan (copy) RNA ........................................ 11
Gambar A.1 - Skema pengenceran ......................................................................................... 8

Gambar B.1 - Kurva standar IMNV dan contoh dengan nilai threshold .................................. 9
Gambar B.2 - Kurva pengujian contoh uji dengan konsentrasi (copy) RNA dan nilai Ct ....... 10
©BSN 2021 i
SNI 7662-3:2021
Prakata
SNI 7662-3:2021 Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) - Bagian 3: Metode

quantitative real-time Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (qRT- PCR)
menggunakan hydrolysis probe, yang dalam Bahasa Inggris berjudul Detection of Infectious
Myonecrosis Virus (IMNV) – Part 3: Real- time quantitative Reverse Transcription -
Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) method using hydrolysis probe, merupakan
standar revisi dari SNI 7916:2013 Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) – Metode
Quantitative (Real-Time) Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT- qPCR)
menggunakan Hydrolysis Probe. Standar ini disusun dengan metode pengembangan sendiri
dan ditetapkan oleh BSN Tahun 2021.
Perubahan dalam standar ini meliputi:

1. Perubahan ruang lingkup, yaitu menjadi khusus deteksi IMNV pada krustasea.
2. Penambahan istilah dan definisi, yaitu alikuot, DNA, RNA, biological safety cabinet level
II, ekstraksi, IMNV, master mix, media pembawa, PCR chamber yang dilengkapi UV,
salinan/copy, template RNA.
3. Perubahan pada pasal persiapan contoh uji terkait jenis, organ target dan volume contoh
uji.
4. Penambahan peralatan yang digunakan, yaitu safety cabinet biological II dan PCR
chamber yang dilengkapi UV;
5. Perubahan metode uji dari dua langkah (two step) menjadi satu langkah (one step).
Pada revisi ini, proses sintesa cDNA dijadikan satu pada saat proses amplifikasi.
Standar ini merupakan bagian dari seri SNI deteksi IMNV yaitu:
- SNI 7662.1 Deteksi infectious myonecrosis virus (IMNV) pada udang penaeid-
Bagian 1: Metode reverse transcriptase - polymerase chain reaction
(RT - PCR)
- SNI 7662.2 Deteksi infectious myonecrosis virus (IMNV) pada udang penaeid -
Bagian 2: Metode histopatologi
- SNI 7662-3:2021 Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) - Bagian 3: Metode
quantitative real-time Reverse Transcription – Polymerase Chain
Reaction (qRT- PCR) menggunakan hydrolysis probe
Standar ini disusun oleh Komite Teknis 65-07 Perikanan Budidaya. Standar ini telah dibahas
dan disepakati dalam rapat konsensus yang dilaksanakan secara virtual pada tanggal 12
Oktober 2020, dengan dihadiri oleh pemangku kepentingan (stakeholders) terkait, yaitu
perwakilan dari pemerintah, pelaku usaha, konsumen, dan pakar. Standar ini telah melalui
tahap jajak pendapat pada tanggal 25 November 2020 sampai dengan 24 Januari 2021
dengan hasil akhir disetujui menjadi SNI.
Untuk menghindari kesalahan dalam penggunaan dokumen dimaksud, disarankan bagi

pengguna standar untuk menggunakan dokumen SNI yang dicetak dengan tinta berwarna.
Perlu diperhatikan bahwa kemungkinan beberapa unsur dari dokumen Standar ini dapat
berupa hak paten. Badan Standardisasi Nasional tidak bertanggung jawab untuk
pengidentifikasian salah satu atau seluruh hak paten yang ada
©BSN 2021 ii
SNI 7662-3:2021
Pendahuluan

SNI ini disusun dalam upaya pencegahan penyebaran Hama dan Penyakit Ikan (HPI)/Hama
dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) dengan cara mendeteksi virus patogen pada krustasea
dengan cepat, tepat dan akurat. Menurut World Organisation for Animal Health (OIE) Manual
of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, inang IMNV adalah dari jenis krustasea.
Standar ini disusun dengan memperhatikan peraturan sebagai berikut:
1. Undang-undang No.16 Tahun 1992 tentang Karantina Hewan, Ikan dan Tumbuhan.

2. Undang-undang No. 31 Tahun 2004 tentang Perikanan Sebagaimana diubah Undang-
undang No.45 Tahun 2009.

3. Peraturan Pemerintah No.15 Tahun 2002 tentang Karantina Ikan.

4. Peraturan Pemerintah No. 57 Tahun 2015 tentang Sistem Jaminan Mutu dan Keamanan
Hasil Perikanan serta Peningkatan Nilai Tambah Produk Hasil Perikanan.

5. Peraturan Pemerintah No. 28 Tahun 2017 tentang Pembudidayaan Ikan.

6. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No. PER.05/MEN/2005 tentang Tindakan
Karantina Ikan untuk Pengeluaran Media Pembawa Hama dan Penyakit Ikan Karantina.

7. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No. PER.19/MEN/2010 tentang
Pengendalian Sistem Jaminan Mutu dan Keamanan Hasil Pangan.

8. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No. 57/PERMEN-KP/2018 tentang
Laboratorium Kesehatan Ikan dan Lingkungan.

Instalasi Karantina Ikan.

Pemasukan Media Pembawa dan/atau Hasil Perikanan.

Pengendalian Hama dan Penyakit Ikan.

12. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No 6/PERMEN-KP/2020 tentang
Penyelenggaraan Kesejahteraan Ikan Pada Ikan Budidaya.
13. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No. Kep.52A/MEN/2013 tentang

Persyaratan Jaminan Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan pada Proses Produksi,
Pengolahan dan Distribusi.

14. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No. Kep.91/MEN/2018 tentang
Penetapan Jenis-Jenis Ikan Karantina, Golongan dan Media Pembawa.
©BSN 2021 iii

SNI 7662-3:2021
Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) - Bagian 3: Metode quantitative Real-Time
Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (qRT- PCR) menggunakan
hydrolysis probe
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan deteksi infectious myonecrosis virus (IMNV) pada krustasea dengan
metode quantitative real-time reverse transcription – polymerase chain reaction (qRT-PCR)
menggunakan hydrolysis probe.
2 Acuan normatif
Tidak ada.
3 Istilah dan definisi
Untuk tujuan penggunaan dokumen ini, istilah dan definisi berikut ini berlaku.
3.1
alikuot
pembagian menjadi beberapa ukuran yang lebih kecil agar memudahkan pemakaian dan
mencegah dari kemungkinan kontaminasi
3.2
amplifikasi
pelipatgandaan bagian tertentu dari asam deoksiribonukleat (DNA) virus dengan bantuan
reaksi enzim polimerase
3.3
annealing
proses penempelan primer pada DNA untai tunggal yang komplementer

3.4
asam deoksiribonukleat/deoxyribonucleic acid (DNA)
bagian dari sel yang membawa informasi genetik kepada keturunannya yang tersusun dari
gula ribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen (guanin, adenin, sitosin, urasil)
3.5
asam ribonukleat/ribonucleic acid (RNA)
materi genetik yang tersusun atas nukleotida dengan gula ribosa, gugus fosfat, dan basa
nitrogen (guanin, urasil, sitosin, timin)
3.6
biological safety cabinet level II
area kerja laboratorium dengan ventilasi udara yang telah direkayasa untuk mengamankan
pekerja yang bekerja dengan sampel material, lingkungan dan sampel material dari
kemungkinan bahaya kontaminasi atau menimbulkan bakteri/virus
©BSN 2021 1 dari 13

SNI 7662-3:2021
3.7
denaturasi
proses pemisahan DNA untai ganda menjadi untai tunggal
3.8
ekstensi
proses pemanjangan primer dengan bantuan enzim DNA polymerase, sehingga akan
terbentuk DNA untai ganda
3.9
ekstraksi
proses pemisahan materi genetik jaringan contoh uji
3.10
hydrolysis probe
oligonukleotida dengan urutan basa spesifik yang dilabel dengan sebuah fluorophore secara
kovalen pada ujung 5’ dan sebuah quencher pada ujung 3’ yang akan berpendar ketika
terjadi proses amplifikasi
3.11
Infectious Myonecrosis Virus (IMNV)
merupakan virus RNA dari jenis totivirus dan famili Totiviridae, berbentuk ikosahedral dengan
diameter 40 nm
3.12
kontrol negatif amplifikasi/Negative Amplification Control (NAC)/No Template Control
(NTC)
kendali hasil reaksi PCR dengan menggunakan template berupa nuclease-free water atau
ddH2O yang diperlakukan sama dengan hasil ekstraksi contoh uji untuk mengetahui
terjadinya suatu kontaminasi dari dalam pada pelaksanaan real time PCR
3.13
kontrol negatif ekstraksi/Negative Extraction Control (NEC)
hasil ekstraksi yang berasal dari double destilated water (ddH2O) sebagai pengganti contoh
uji
3.14
kontrol positif amplifikasi/Positive Amplification Control (PAC)
hasil transkripsi in vitro plasmid rekombinan yang mengandung fragmen gen virus
3.15
kontrol positif ekstraksi/Positive Extraction Control (PEC)
hasil ekstraksi yang berasal dari organ yang terinfeksi atau organ yang dikontaminasi oleh
standar positif
3.16
limit deteksi/limit of detection (LoD)
jumlah copy atau molekul target terendah yang masih dapat dideteksi pada tingkat
kepercayaan 95 %

3.17
master mix
campuran yang berisi reagensia PCR sejumlah reaksi uji
©BSN 2021 2 dari 13

SNI 7662-3:2021
3.18
media pembawa
ikan dan/atau benda lain yang dapat membawa hama dan penyakit ikan
3.19
PCR chamber yang dilengkapi UV
area kerja laboratorium yang dilengkapi dengan UV untuk mengamankan master mix yang
dipreparasi dari kontaminasi
3.20
primer
oligonukleotida dengan urutan basa spesifik yang digunakan sebagai awal sintesis DNA
secara in vitro
3.21
quantification cycle (Cq)/cycle threshold (Ct)
titik perpotongan antara kurva amplifikasi kontrol positif dengan garis cut-off
3.22
real-time PCR
suatu teknik PCR dengan metode analisa yang secara simultan dapat diamati hasil
amplifikasinya secara kuantitatif
3.23
salinan/copy
sejumlah fragmen yang dihasilkan dari proses amplifikasi PCR
3.24
standar positif
fragmen DNA sintetik/plasmid yang mengandung sekuens DNA target yang diketahui jumlah
copy
3.25
template RNA
RNA hasil ekstraksi yang digunakan sebagai cetakan untuk proses amplifikasi setelah
ditranskripsi balik menjadi cDNA
3.26
transkripsi balik/Reverse Transcription (RT)
proses sintesis cDNA dari template RNA dengan menggunakan enzim reverse
transcriptase
4 Prinsip umum
Prinsip dari metode ini adalah mengisolasi dan memurnikan RNA dari organ target/jaringan
yang diduga terinfeksi IMNV, dilanjutkan dengan transkripsi balik menjadi cDNA dan
diamplifikasi secara real-time.
5 Peralatan
a) alat pengukur konsentrasi asam nukleat (spektrofotometer);

b) biological safety cabinet level II;
c) disposible pestle;
©BSN 2021 3 dari 13
SNI 7662-3:2021
d) freezer (suhu -20 °C sampai dengan -80 °C);
e) heating block;
f) hot plate stirrer dan stirrer bar;
g) inkubator;
h) mesin real-time PCR;
i) microcentrifuge (refrigerated 14.000 x g);
j) mikropipet berbagai ukuran (0,1 µL – 1000 µL);
k) minimixer;
l) PCR chamber yang dilengkapi UV;
m) penangas air;
n) peralatan bedah (gunting, pinset, pisau scalpel);
o) peralatan gelas (tabung reaksi, botol Schott, gelas ukur, erlenmeyer, gelas beaker,
cawan petri);
p) rak pendingin tabung mikro;
q) spin down centrifuge;
r) timbangan analitik.
6 Bahan
a) diethylpyrocarbonate (DEPC) - treated water atau RNase / nuclease-free water;

b) etanol p.a;
c) kit ekstraksi RNA komersial;
d) larutan ekstraksi RNA komersial;
e) isopropanol (2-propanol);
f) kloroform;
g) kit real-time PCR komersial berbasis hydrolysis probe;
h) plasmid kontrol positif IMNV yang terkuantifikasi (sesuai dengan Lampiran B);
i) RNase inhibitor;
j) larutan preservatif RNA;
k) tabung atau microplate PCR optikal ukuran 0,1 mL - 0,2 mL atau tabung kapiler ukuran
20 µL - 100 µL;
l) tabung mikro ukuran 0,2 mL; 1,5 mL – 2 mL;
m) pellet pestle/penggerus jaringan;
n) filtered microtip berbagai ukuran 10 µL– 1.000 µL;
o) sarung tangan (powder-free);
p) masker;
q) TN buffer (20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl pH 7,4);
r) Tris EDTA (TE) buffer (konsentrasi 10 mM Tris HCl 1 mM EDTA pH 7,5 );
s) β-mercaptoethanol;
t) 1 set primer dan probe sesuai dengan Lampiran A:
IMNV 412F : 5’-GGA CCT ATC ATA CAT AGC GTT TGC A-3’.
IMNV 545R : 5’-AAC CCA TAT CTA TTG TCG CTG GAT-3’.
IMNVp1 : 5’-6FAM-CCA CCT TTA CTT TCA ATA CTA CAT CAT CCC CGG-TAMRA-3’.
CATATAN 1 Bahan disesuaikan dengan metode standar yang digunakan.

CATATAN 2 Bisa menggunakan primer dan kit komersial lainnya yang sudah tervalidasi dan
sudah diverifikasi.
©BSN 2021 4 dari 13

SNI 7662-3:2021
7 Prosedur
7.1 Persiapan contoh uji
Contoh uji yang dapat digunakan untuk mendeteksi IMNV sesuai Tabel 1.
Tabel 1 - Jenis, organ target dan volume contoh uji
No Jenis contoh uji Organ target Volume contoh uji

1 Udang Hemolimp, otot perut (stomach) 50 mg - 100 mg
atau insang
2 Naupli, larva dan Seluruh tubuh 50 mg - 100 mg
pasca larva
3 Inang perantara Insang, abdomen 50 mg - 100 mg
CATATAN 1 Sampel bisa dalam keadaan segar atau dalam larutan fiksatif (etanol minimal 70%).
CATATAN 2 Volume contoh uji bukan merupakan representasi pengambilan jumlah contoh uji.
7.2 Ekstraksi DNA
7.2.1 Metode presipitasi
a) masukkan contoh uji sebanyak 20 mg ke dalam tabung mikro ukuran 1,5 mL;
b) tambahkan 500 µL RNA extraction solution ke dalam tabung mikro kemudian gerus
sampai halus lalu diamkan pada 25 °C – 30 °C selama 5 menit;
c) tambahkan 100 µL kloroform kemudian homogenkan selama 20 detik dan diamkan pada
25 °C – 30 °C selama 3 menit;
d) sentrifugasi pada 14.000 x g selama 15 menit;
e) pindahkan 200 µL supernatan ke dalam tabung mikro baru ukuran 1,5 mL dan
tambahkan 200 µL isopropanol;
f) homogenkan kemudian sentrifugasi pada 14.000 x g selama 10 menit;
g) buang supernatan dan cuci pellet dengan 500 µL etanol 75 % lalu sentrifugasi pada
12.000 x g selama 5 menit;
h) buang etanol lalu keringkan pellet;
i) larutkan pellet dengan 200 µL nuclease free water atau buffer TE.
j) simpan larutan RNA pada (-20°C) apabila segera digunakan dan untuk penyimpanan
lebih lama pada freezer dengan suhu yang lebih rendah dalam bentuk alikuot.
CATATAN Prosedur ekstraksi RNA disesuaikan dengan kit komersial yang digunakan.
7.2.2 Metode spin column
Ekstraksi RNA dapat menggunakan metode spin column sesuai Lampiran C.
7.3 Pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA
a) ukur kuantitas RNA berdasarkan hasil pengukuran absorbansinya dengan UV

spectrofotometer pada panjang gelombang 260 nm.
hitung konsentrasi RNA dengan menggunakan rumus:
Konsentrasi RNA = Å260 x 40 x fp (1)

Keterangan:
Å260 adalah nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm.
fp adalah faktor pengenceran.
©BSN 2021 5 dari 13

SNI 7662-3:2021
b) lakukan pengenceran apabila konsentrasi yang diperoleh lebih tinggi dari yang
diperlukan;
c) ukur kemurnian RNA dengan menghitung perbandingan absorbansi panjang gelombang
260 nm dan 280 nm (Å 260 /Å 280);
d) lanjutkan proses berikutnya atau simpan larutan RNA pada maksimum -20 ⁰C.
7.4 Amplifikasi
Pada tahap amplifikasi, seluruh proses preparasi reagen pada a) sampai f) dilakukan pada
kondisi dingin, sebagai berikut:
a) buat larutan standar dengan pengenceran berseri sesuai Lampiran B;
b) cairkan template RNA, primer IMNV412F, primer IMNV545R, probe IMNVp1, nuclease-
free water (NFW) dan kit real-time PCR berbasis hidrolisis dengan meletakkan di rak
pendingin tabung mikro;
c) buat qRT-PCR master mix sesuai dengan Tabel 2. qRT-PCR master mix dihitung sesuai
jumlah contoh uji, ditambah dengan minimal 4 standar positif secara desimal (104
copy/µL, 103 copy/µL, 102 copy/µL, 101 copy/µL), dan kontrol negatif amplifikasi (non
template control = NTC);
d) homogenkan semua bahan qRT-PCR master mix dan distribusikan sebanyak 9 µL ke
masing-masing tabung 0,2 mL;
e) masing-masing tabung berisi 9 μL qRT-PCR master mix, ditambahkan 1 μL template
RNA, 1 μL NFW untuk kontrol negatif amplifikasi (NAC), hingga total volume tabung
masing-masing 10 μL;
f) template standar positif dengan 4 konsentrasi yang berbeda masing masing dimasukkan
sebanyak 1 µL ke dalam 9 µL larutan master mix;
g) lakukan amplifikasi di mesin real time PCR sesuai siklus pada Tabel 3.
Tabel 2 - Komposisi qRT-PCR master mix IMNV
Volume Konsentrasi
No Nama Bahan
(µL) Akhir
1 nuclease-free water 5 -
2 kit real-time PCR berbasis hidrolisis 2,5 1x
3 primer IMNV412F/Primer IMNV545R (5 μM tiap 1 0,5 μM (tiap
primer) primer)
4 probe IMNVp1 (2 µM) 0,5 0,1 μM
5 RNA template 1 1 ng - 50 ng RNA
Total 10
CATATAN Komposisi qRT-PCR master mix disesuaikan dengan manual kit dan mesin PCR
yang digunakan.
Tabel 3 - Pengaturan suhu, waktu dan siklus amplifikasi
Proses Tahap Suhu (°C) Waktu Siklus

Reverse transcription (RT) 1 48 5 menit 1
Denaturasi awal 2 95 20 detik 1
95 1 detik
Amplifikasi 3 40
60 20 detik
CATATAN Pengaturan suhu, waktu dan siklus amplifikasi disesuaikan dengan manual kit dan
mesin real-time PCR yang digunakan.
©BSN 2021 6 dari 13

SNI 7662-3:2021
8 Interpretasi hasil
a) analisis data sesuai dengan software mesin real-time PCR yang digunakan;
b) interpretasi kurva amplifikasi adalah sebagai berikut:
‐ nilai cut off adalah batas terendah nilai Ct yang tidak memotong threshold dan
diperoleh dari nilai LoD atau kurva standar;
‐ contoh uji dinyatakan positif apabila terlihat naiknya kurva di atas garis threshold dan
nilai Ct lebih kecil dari nilai cut off;
‐ contoh uji dinyatakan negatif apabila berada di bawah garis threshold;
‐ apabila diperoleh konsentrasi copy/Ct lebih rendah dari nilai LoD, maka contoh uji
dinyatakan suspect dan harus dikonfirmasi ulang.
c) kuantifikasi salinan (copy) fragmen diproses oleh perangkat lunak komputer yang
terhubung dengan mesin real-time PCR yang digunakan.
9 Jaminan mutu pengujian
a) seluruh tahapan pengerjaan diawali dengan membersihkan meja kerja dan alat
menggunakan larutan pembersih RNase;
b) hasil ekstraksi DNA mempunyai rasio Å260/Å280 berkisar 1,8 – 2,1;
c) amplifikasi dinyatakan baik apabila nilai slope (M) - 3,10 sampai dengan - 3,60 (setara
dengan efisiensi amplifikasi 90 % – 110 %);
d) proses real-time PCR valid bila dilihat dari kurva standar dengan nilai koefisien
determinasi (R2) > 0,985;
e) keterulangan (repeatability) untuk pengujian duplo harus mempunyai nilai Standar
Deviasi (SD) Ct < 0,32.
10 Pelaporan hasil
a) hasil pengujian IMNV dinyatakan dalam jumlah salinan (copy) fragmen/Ct. Contoh positif
ditunjukkan dengan nilai konsentrasi salinan (copy) fragmen/Ct pada angka tertentu;
b) penulisan laporan menyertakan gambar standar kurva dan tabel nilai konsentrasi salinan
(copy) fragmen/Ct;
c) contoh gambar kurva dan tabel jumlah salinan (copy) fragmen/Ct standar positif, sampel
uji, dan Negative Amplification Control (NAC) dapat dilihat pada Lampiran B.
©BSN 2021 7 dari 13

SNI 7662-3:2021
Lampiran A
(informatif)
Pembuatan larutan standar positif
a) encerkan larutan standar stok berupa plasmid kontrol positif IMNV konsentrasi 106
copy/µL dalam larutan buffer TE dengan perbandingan 1:9;
b) masukkan 2 µL standar stok positif ditambah dengan 18 µL larutan buffer TE,
homogenkan untuk mendapatkan konsentrasi 105 copy/µL;
c) lakukan pengenceran secara berseri seperti pada Gambar B.1;
d) larutan standar positif siap untuk digunakan sebagai template pada pengujian IMNV
dengan qRT- PCR.
Gambar A.1 - Skema pengenceran
©BSN 2021 8 dari 13

SNI 7662-3:2021
Lampiran B
(informatif)
Contoh gambar kurva dan tabel jumlah salinan (copy) RNA
Kurva hasil pengujian IMNV dengan real time PCR disajikan pada Gambar B.1.
Lakukan analisis data sesuai dengan software mesin real-time PCR yang digunakan.
a) Pengamatan selama proses amplifikasi :
(
b (
1 a 1 (
1 1 1 1 1
0 c
0 0 0 0 0 0
Gambar B.1 - Kurva standar IMNV dan contoh dengan nilai threshold
©BSN 2021 9 dari 13

Gambar B.2 - Kurva pengujian contoh uji dengan konsentrasi (copy) RNA dan nilai Ct
10 dari 13
SNI 7662-3:2021
©BSN 2021
SNI 7662-3:2021
Tabel B.1 - Contoh laporan hasil kuantifikasi salinan (copy) RNA
No Nama Tipe Ct Standar Konsentrasi Intepretasi

(copy/µL) (copy/µL) Hasil
Kontrol negatif
1 NTC Undetermined - Negatif
amplifikasi
Kontrol negatif
2 NTC Undetermined - Negatif
amplifikasi
Kontrol negatif
3 NTC Undertemined - Negatif
ekstraksi
Kontrol negatif
4 NTC Undetemined - Negatif
ekstraksi
Kontrol positif
5 Unknown 29,88 2 889,67 Positif
ekstraksi (a)
Kontrol positif
6 Unknown 29,24 4 474,42 Positif
ekstraksi (a)
7 Contoh uji 1 Unknown Undeteminded - Negatif
8 Contoh uji 1 Unknown Undetermined - Negatif
11 Contoh uji 4 (b) Unknown 19,97 2 392 833 Positif
12 Contoh uji 4 (b) Unknown 19,34 3 654 956 Positif
13 Contoh uji 5 (c) Unknown 34,07 170,14 Positif
14 Contoh uji 5 (c) Unknown 33,67 222,18 Positif
15 Standar IMNV 102 Standard 33,28 100 100 Positif
16 Standar IMNV 102 Standard 33,63 100 100 Positif
17 Standar IMNV 103 Standard 29,21 1 000 1 000 Positif
23 Standar IMNV 106 Standard 19,96 1 000 000 1 000 000 Positif
CATATAN Undetermined: tidak terdeteksi
©BSN 2021 11 dari 13

SNI 7662-3:2021
Lampiran C
(informatif)
Ekstraksi RNA dengan metode spin column
a) masukkan 20 mg contoh uji ke dalam tabung mikro 1,5 mL;

b) tambahkan 400 µL lysis/binding buffer dan homogenkan;
c) sentrifugasi pada kecepatan maksimal (13.000 x g) selama 2 menit dan ambil supernatan
dan masukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL untuk proses selanjutnya;
d) tambahkan 200 µL (0,5 volume) etanol absolut p.a dan campurkan;
e) pasangkan spin column dengan collection tube dan masukkan seluruh campuran di atas
(maksimal 700 µL) ke dalamnya;
f) sentrifugasi pada kecepatan maksimal (13.000 x g) selama 30 detik;
g) buang larutan hasil sentrifugasi dan pasangkan kembali spin column pada “collection
tube”;
h) masukkan campuran 90 µl DNase Incubation Buffer (white cap) dan 10 µl larutan DNase
I ke dalam spin column;
i) inkubasikan selama 15 menit pada 15 oC - 25 oC;
j) tambahkan 500 µL wash buffer I (black cap) ke dalam bagian atas spin column;
k) sentrifugasi pada 8.000 x g selama 15 detik;
l) buang larutan hasil sentrifugasi dan pasangkan kembali spin column pada “collection
tube”;
m) ulangi langkah ke j - l menggunakan wash buffer II (blue cap);
n) tambahkan 300 µl wash buffer II (blue cap) ke dalam spin column;
o) sentrifugasi pada kecepatan maksimal selama 2 menit atau kurang lebih 13.000 x g;
p) pisahkan secara hati-hati spin column dari “collection tube”;
q) pasangkan spin column dengan tabung mikro steril 1,5 mL (nuclease free);
r) tambahkan 100 µl elution buffer ke dalam spin column;
s) sentrifugasi pada 8.000 x g selama 1 menit;
t) ukur konsentrasi dan kemurnian RNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
(Å260/ Å280);
u) simpan larutan RNA pada -20 °C apabila segera digunakan dan untuk penyimpanan
lebih lama pada -80 °C dalam bentuk alikuot.
©BSN 2021 12 dari 13

SNI 7662-3:2021
Bibliografi
[1] Andrade TPD, SrisUVan T, Tang KFJ, Lightner DV. 2007. Real-time reverse
transcription polymerase chain reaction assay using TaqMan probe for detection and
quantification of Infectious myonecrosis virus. Aquaculture 264 (2007) 9-15.
[2] OIE. 2019. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Chapter 2.2.5.
©BSN 2021 13 dari 13

Informasi perumus SNI 7662-3:2021
[1] Komite Teknis Perumusan SNI

Komite Teknis 65-07 Perikanan Budidaya
[2] Susunan keanggotaan Komite Teknis Perumusan SNI
Ketua : Tinggal Hermawan Pemerintah

Wakil Ketua : Maskur Pemerintah
Sekretaris : Nana S.S. Udi Putra Pemerintah
Anggota : Alfida Ahda Pemerintah
Anggota : Alimuddin Pakar
Anggota : Tatag Budiardi Pakar
Anggota : Irzal Effendi Pakar
Anggota : Azam B. Zaidy Produsen
Anggota : Denny D. Indradjaja Produsen
Anggota : Miftakhul Munir Produsen
Anggota : Heny Budi Utari Konsumen
Anggota : Deni Rusmawan Konsumen
Anggota : Iskandar Ismanadji Konsumen
[3] Konseptor Rancangan SNI

Bambang Hanggono – Balai Perikanan Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, KKP
[4] Sekretariat Pengelola Komite Teknis Perumusan SNI

Direktorat Kawasan dan Kesehatan Ikan, Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya,
Kementerian Kelautan dan Perikanan

SNI 7662-3-2021 IMNV - Komtek

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

SNI 7662-3-2021 IMNV - Komtek

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

“Hak cipta Badan Standardisasi Nasional, copy standar ini dibuat untuk Komite Teknis 65-07 Perikanan Budidaya,

dan tidak untuk dikomersialkan”

Standar Nasional Indonesia

Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) -

Daftar Isi .................................................................................................................................... i

Tabel 1 - Jenis, organ target dan volume contoh uji ................................................................ 5

Gambar A.1 - Skema pengenceran ......................................................................................... 8

SNI 7662-3:2021 Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) - Bagian 3: Metode

Perubahan dalam standar ini meliputi:

Untuk menghindari kesalahan dalam penggunaan dokumen dimaksud, disarankan bagi

Standar ini disusun dengan memperhatikan peraturan sebagai berikut:

13. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI No. Kep.52A/MEN/2013 tentang

©BSN 2021 iii

3 Istilah dan definisi

©BSN 2021 1 dari 13

©BSN 2021 2 dari 13

a) alat pengukur konsentrasi asam nukleat (spektrofotometer);

a) diethylpyrocarbonate (DEPC) - treated water atau RNase / nuclease-free water;

CATATAN 1 Bahan disesuaikan dengan metode standar yang digunakan.

©BSN 2021 4 dari 13

7.1 Persiapan contoh uji

Tabel 1 - Jenis, organ target dan volume contoh uji

No Jenis contoh uji Organ target Volume contoh uji

7.2 Ekstraksi DNA

7.2.1 Metode presipitasi

7.2.2 Metode spin column

Ekstraksi RNA dapat menggunakan metode spin column sesuai Lampiran C.

7.3 Pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA

a) ukur kuantitas RNA berdasarkan hasil pengukuran absorbansinya dengan UV

Konsentrasi RNA = Å260 x 40 x fp (1)

©BSN 2021 5 dari 13

Tabel 2 - Komposisi qRT-PCR master mix IMNV

Tabel 3 - Pengaturan suhu, waktu dan siklus amplifikasi

Proses Tahap Suhu (°C) Waktu Siklus

©BSN 2021 6 dari 13

9 Jaminan mutu pengujian

©BSN 2021 7 dari 13

Gambar A.1 - Skema pengenceran

©BSN 2021 8 dari 13

a) Pengamatan selama proses amplifikasi :

©BSN 2021 9 dari 13

No Nama Tipe Ct Standar Konsentrasi Intepretasi

CATATAN Undetermined: tidak terdeteksi

©BSN 2021 11 dari 13

a) masukkan 20 mg contoh uji ke dalam tabung mikro 1,5 mL;

©BSN 2021 12 dari 13

©BSN 2021 13 dari 13

[1] Komite Teknis Perumusan SNI

[2] Susunan keanggotaan Komite Teknis Perumusan SNI

Ketua : Tinggal Hermawan Pemerintah

[3] Konseptor Rancangan SNI

[4] Sekretariat Pengelola Komite Teknis Perumusan SNI

Anda mungkin juga menyukai