Pewarnaan Gram - Prinsip dan Prosedur

Pewarnaan
By MicrobeHolic 31/08/2020 Add Comment

Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan sel bakteri menggunakan zat
kimia tertentu. Teknik perwanaan ini ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh
seorang ahli mikrobiologi asal Denmark bernama Hans Christian Gram saat
meneliti bakteri Pneumococcus dan Klebsiella pneumoniae sebagai bakteri penyebab
penyakit saluran pernafasan.
Daftar isi
A. Prinsip Pewarnaan Gram
Prinsip pewarnaan Gram adalah untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan
komposisi kimiawi dinding sel yang berupa peptidoglikan. Perbedaan konsentrasi
peptidoglikan pada dinding masing-masing sel bakteri akan memberikan perbedaan
warna, sehingga akan mengklasifikasikan / mengelompkkan bakteri menjadi 2
kelompok utama, yaitu kelompok bakteri Gram positif (+) dan Gram negatif (-).
Konsentrasi peptidoglikan yang tinggi (tebal) dimiliki oleh kelompok bakteri Gram
positif, sedangkan konsentrasi peptidoglikan yang rendah (tipis) dimiliki oleh
kelompok bakteri Gram negatif.

Zat kimia yang digunakan dalam pewarna Gram adalah Kristal Violet dan Safranin
sebagai pewarna utama yang mewarnai struktur peptidoglikan dinding sel. Kristal
Violet akan memberi warna ungu sedangkan safranin akan memberi warna merah
pada dinding sel bakteri. Lugols Iodine sebagai mordant penguat ikatan warna.
Alkohol sebagi agen penjernih warna (dekolorizer) yang menghilangkan ikatan zat
pewarna dengan peptidoglikan.

1. Bakteri Gram Positif Berwarna Ungu

 Dinding sel bakteri Gram positif mengandung ikatan lapisan
peptidoglikan yang tebal sehingga kuat mengikat pewarna primer berupa
Kristal Violet, setelah diikuti penambahan larutan mordant berupa lugols
Iodine.
 Kristal Violet dan Lugols Iodine akan membentuk ikatan komplek
dengan peptidoglikan.
 Ketika sudah terbentuk ikatan komplek antara Kristal Violet dan Lugols
Iodine, pewarna akan sulit diluruhkan dengan larutan dokolirizer seperti
alkohol asam. Peptidoglikan akan tetap mengikat warna kristal violet dan
meninggalkan warna biru tua atau ungu.
 Ketika ditambah warna pembanding seperti Safranin, peptidoglikan
masih mempertahankan warna primer.

2. Bakteri Gram Negatif Berwarna Merah

  Dinding sel bakteri Gram negatif tidak mengandung ikatan lapisan
peptidoglikan yang tebal (tipis).
 Saat diaplikasikannya pewarna Crystal Violet dan Lugols Iodine tidak
dapat membentuk ikatan kuat dengan peptidoglikan.
 Ikatan yang terbentuk antara pewarna dengan peptidoglikan secara
mudah diluruhkan atau terbilas oleh larutan dekolorizer
 Alkohol asam akan mendehidrasi dinding sel dan membentuk sebuah
pori-pori atau lubang pada membran sel, sehingga akan menghilangkan
pewarna primer.
 Pewarna pembanding berupa Safranin mewarnai ulang peptidoglikan
yang tidak mengikat lagi pewarna Kristal Violet, sehingga bakteri akan
tampak berwarna merah.

B. Komposisi Reagen Pewarna Gram

Reagen Gram Komposisi
Pewarna Primer Kristal Violet 2 g, Etil Alkohol (95%) 20 ml, Amonium Oksalat 0,8 g,
(Kristal violet) Akuades Steril 100 ml
Larutan Mordant Potasium Iodid 2 g, Kristal Iodin 1 g, Akuades Steril 100 ml
(Lugols iodine)
Larutan Etanol 50 ml, Aseton 20 ml
Dekolorizer
(Etil Alkohol)
Pewarna Safranin 4 g, Etanol (95%) 200 ml, Akuades steril 800 ml
Sekunder
(Safranin)

C. Prosedur Pewarnaan Gram

1. Siapkan kultur murni bakteri yang akan diwarnai.
2. Secara aseptis ambil 1 ulasan jarum ose kultur bakteri pada permukaan
kaca preparat.
3. Ratakan degan menggunakan akuades steril menggunakan jarum ose.
4. Fiksasi panas dengan cara melewatkan kaca preparat diatas api bunsen
sebanyak 3 kali. Fiksasi digunakan untuk mematikan bakteri namun
tetap mempertahankan bentuk dan komponen sel.
5. Teteskan peawarna primer (Kristal Violet) secara merata pada ulasan
bakteri, dan tunggu selama 20 detik.
6. Bilas pewarna primer menggunakan akuades steril dan tunggu hingga
cukup kering.
7. Teteskan larutan mordant (Lugols Iodine) pada permukaan ulasan
bakteri, dan tunggu selama 60 detik.
8. Bilas larutan mordant menggunakan akuades steril dan tunggu hingga
cukup kering.
9. Teteskan larutan dekolorizer (etanol) secara merata pada ulasan bakteri
hingga permukaan ulasan tampak jernih.
10.Bilas larutan dekolorizer menggunakan akuades steril dan tunggu hingga
cukup kering.
11.Teteskan pewarna sekunder (Safranin) secara merata pada ulasan
bakteri, dan tunggu selama 20 detik.
12.Bilas pewarna sekunder menggunakan akuades steril dan tunggu hingga
cukup kering.
13.Setelah kering, tutup permukaan ulasan dengan penutup kaca dan sampel
siap diamati dibawah mikroskop.
D. Interpretasi Hasil Pewarnaan Gram
Interpretasi hasil pewarnaan Gram pada beberapa jenis bakteri adalah sebagai berikut:

Spesies Bakteri Hasil Pewarnaan Gram Jenis Gram

Staphylococcus Ungu atau biru tua Gram Positif
aureus
Escherichia coli Merah atau merah jambu Gram Negatif

E. Sumber & Referensi

 Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
 Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H and Stahl,
D.A. 2015. Brock Biology of Microorganism 14 th edition. Pearson
Education, US.
 Pelczar, M.J dan Chan, E.C.S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI
Press: Jakarta.