Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
J Nat Med (2007) 61:138–145 DOI
10.1007/s11418-006-0107-6
KERTAS ASLI
Linckosides M – Q: glikosida steroid neuritogenik
dari bintang laut OkinawaLinckia laevigata
Chunguang HanÆJianhuaqiÆMakoto Ojika
Diterima: 7 Agustus 2006 / Diterima: 25 September 2006 / Diterbitkan online: 6 Desember 2006
- Masyarakat Farmakognosi dan Springer Jepang 2006
AbstrakLima glikosida steroid baru, linckosida M–Q (
1–5),dan dua metabolit terkait yang diketahui, meniru
dan/atau meningkatkan aktivitas neuritogenik faktor
pertumbuhan saraf (NGF), telah diisolasi dari bintang
laut biru Okinawa.Linckia laevigata. Strukturnya,
termasuk stereokimia, dijelaskan dengan metode
spektroskopi dan derivatisasi kimia. Metabolit
linckoside P yang paling aktif (4)menginduksi
pertumbuhan neurit pada 55% sel PC12 6 hari setelah
pengobatan. Linkkosida M–O (1–3) kurang aktif,
berkisar 21 hingga 32%. Monoglikosida, linckoside Q (
5)dan dua metabolit yang diketahui,6Dan7,kurang
aktif dibandingkan bisglikosida. Semua metabolit
meningkatkan aktivitas neuritogenik sejumlah NGF,
dari 11% menjadi 60-99% tiga hari setelah
pengobatan. Hubungan struktur-aktivitas ini
menunjukkan pentingnya xilosa pada rantai samping,
terutama pada cabang karbon C-24 dibandingkan
pada terminal C-26, untuk aktivitas meniru NGF.
Kata kunciLinkkosida - Glikosida steroid - Linckia
laevigata -Bintang Laut - Produk alami laut -
Neuritogenesis
C.Han - J.Qi - M.Ojika (&) Sekolah
Pascasarjana Ilmu Biopertanian, Universitas
Nagoya, Chikusa-ku,
Nagoya 464-8601, Jepang
email: ojika@agr.nagoya-u.ac.jp
123
Perkenalan
Linkkosida adalah kelas baru glikosida steroid yang
ditemukan di bintang laut OkinawaLinckia laevigata [1–3].
Di antara senyawa-senyawa ini, linckosida A–E dan K dapat
diklasifikasikan memiliki struktur dasar yang ditunjukkan
pada Gambar.1, yang memiliki cabang karbon (C1-C3) yang
terglikosilasi dengan pentosa lain (xilosa atau arabinosa)
pada C-24 rantai samping. Jenis steroid glikosida ini cukup
langka; hanya satu contoh (echinasteroside F) yang
diketahui [4] sampai linckosida ditemukan oleh kami. Selain
fitur struktural ini, linckosida dapat menginduksi
pertumbuhan neurit pada sel PC12 dengan cara yang sama
seperti faktor pertumbuhan saraf (NGF). Aktivitas
neuritogenik yang meniru NGF ini sangat bergantung pada
perbedaan kecil di antara struktur linkkosida; struktur yang
menghasilkan aktivitas lebih besar adalah:
1 sebuah 2¢-HAI-metil eter dariB-xilosa di
2 C-3; cabang karbon di rantai samping; Dan
3 gugus pentosa kedua pada cabang karbon [3].
Sebaliknya, sebagian besar linkkosida, termasuk
monoglikosida, meningkatkan aktivitas neuritogenik
sejumlah kecil NGF.1,3].
Bintang laut biru mengandung beberapa glikosida steroid yang
belum teridentifikasi, sehingga memberi kita perpustakaan alami
untuk senyawa semacam ini. Oleh karena itu, layak untuk mencari
anggota tambahan dari linkkosida tidak hanya untuk menemukan
congener yang lebih kuat tetapi juga untuk menemukan hubungan
struktur-aktivitas lebih jauh. Dalam pencarian berkelanjutan kami
untuk glikosida steroid neuritogenik, kami telah mengisolasi lima
linkkosida baru, M (1),N (2),HAI (3),P (4), dan Q (5),dan dua metabolit
yang diketahui,6Dan7 (Ara.2).
J Nat Med (2007) 61:138–145
Dalam makalah ini, kami melaporkan isolasi, penjelasan
struktur, dan aktivitas neuritogenik senyawa ini.
hasil dan Diskusi
Bintang lautL.laevigata (7,7 kg, berat basah)
dikumpulkan di Okinawa, Jepang, dikeringkan beku
dan diekstraksi dengan MeOH. Ekstrak MeOH
dipartisi antara EtOAc dan air. Lapisan berair
dikromatografi pada ODS, kemudian pada silika gel.
Fraksi yang mengandung glikosida steroid dikenai
HPLC fase terbalik berulang untuk menghasilkan
linckosida M (1, 0,00003% berdasarkan berat basah
hewan), N (2,0,00003%), HAI (3,0,00002%), P (4,
0,00001%), Q (5, 0,00004%) dan echinasterosida A
yang didesulfasi (6, 0,0004%) dan B (7,0,0002%).
Rumus molekul linckoside M (1)ditemukan adalah
C39H64HAI14dengan analisis HR ESI – TOF – MS.
Spektrum IR mengandung serapan kuat pada jarak
3,422 cm-1–1dari gugus hidroksil. Itu1Spektrum H
NMR (Tabel1) berisi sinyal dari tiga metil sekunder (D
0,91, 0,95, dan 1,01), dua metil tersier (D1.16 dan
1.37), satu metoksil (D3.57), tiga kelompok olefin (D
5.40, 5.47, dan 5.64). Itu13Data C NMR (Tabel1) untuk1
mengungkapkan adanya sepuluh karbon oksimetin,
tiga karbon oksimetilen, dua karbon asetal (D104.6
dan 105.4), karbon olefin kuaterner (D148.5), dan tiga
sp kuaterner3karbon (DC
37.8, 45.1, dan 76.2). Resonansi fungsi asetal dan
beberapa oksigen menunjukkan adanya dua gugus
gula. Analisis DQF-COSY mengarah pada penentuan
struktur parsial, yang kemudian dihubungkan
dengan korelasi HMBC untuk menghasilkan struktur
kasar dari1 (Ara.3). Korelasi HMBC dari anomerik H-1
¢menjadi C–3 dan anomerik H–1¢¢ke C-26
menunjukkan lokasi dua gugus gula. Gula yang
terikat pada C-3 dari aglikon steroid ditentukan
sebagai 2¢-HAI-methylxylopyranose dari korelasi
NOESY H-1¢/H-3¢,H-1¢/H-5¢a, H-2¢/H-4¢,dan H-3¢/
H-5¢a (Gbr.4), di dekat visinal besarJnilai (~10 Hz), dan
dengan perbandingan13Data C NMR dengan data
yang dilaporkan [1]. ItuBKonfigurasi unit gula ini
disimpulkan dari konstanta koplingJ1¢–2¢=7,8Hz.
Bagian gula lain yang terkait dengan C-26 dari rantai
samping ditentukan sebagaiB-xylopyranose
berdasarkan korelasi NOESY H-1†/H-3†,H-1†/H-5†a,
H-2†/ H-4†,dan H-3†/H-5†a (Gbr.4), konstanta kopling
J1†–2†=7,8 Hz, dan dilaporkan13Data C NMR [1].
Stereostruktur inti steroid dibentuk oleh korelasi
NOESY, seperti yang ditunjukkan pada Gambar.4. 20
R- konfigurasi ditugaskan berdasarkan korelasi NOE
H-18/H-20 dan H-18/H-21 dan besar
139
konstanta koplingJ17–20= 10,8Hz. ItuEkonfigurasi
ikatan rangkap 1,2 tersubstitusi pada C-22–C-23
dikonfirmasi oleh konstanta koplingJ22–23= 15,3Hz. 24
R,25Skonfigurasi ditentukan sebagai berikut.
Linkkoside M (1)dihidrolisis secara enzimatik [5]
menjadi senyawa dexylosyl yang sesuai, yang identik
dengan echinasteroside A yang didesulfasi (6)dalam
segala hal [6]. Untuk mengkonfirmasi 24R,25S
konfigurasi, senyawa yang diperoleh,6,selanjutnya
diubah menjadi (R)-ester MTPA8.Perbedaan
pergeseran kimia antara dua proton 26-metilen, DD
0,12 ppm (D4,27–4,15), sesuai dengan nilai (0,12 ppm)
untuk (R)-MTPA ester dari (24R,25S)-D22E-24-metil-26-
hidroksi steroid sedangkan untuk(R)-MTPA esternya
(24S,25R)isomerDd =0,25 ppm [7].
Rumus molekul linckoside N (2)ditemukan adalah C
40H66HAI14oleh HR ESI–TOF–MS, yang lebih dari1oleh
CH2. Data NMR (Tabel1) untuk 2hampir dapat
ditumpangkan pada hal-hal tersebut1,kecuali sinyal
dari gugus 24-etil (C-28–C-29) dan bukan dari gugus
24-metil (C-28) pada1.Lokasi dua gugus gula dan
stereokimia inti steroid dan C-20 ditentukan sama
dengan lokasi1berdasarkan eksperimen HMBC dan
NOESY. 24R,25Skonfigurasi ditentukan dengan
analogi dengan metode yang digunakan1 [8].
Linkkosida N (2)diubah menjadi turunan dexylosyl9
dengan hidrolisis enzimatik [5]. Itu1Data H NMR
untuk rantai samping9sesuai dengan data terkait
yang dilaporkan untuk periode 15-HAI- tersulfasi9,
echinasterosida D [4]. Senyawa itu9kemudian diubah
menjadi (R)-ester MTPA10.Perbedaan pergeseran
kimia antara dua proton 26-metilen,DD 0,17 ppm (D
4.27–4.10), sesuai dengan nilai (0,22 ppm) untuk (R)-
MTPA ester dari (24R,25S)-D22E-24-etil-26-hidroksi
steroid sedangkan
Gambar 1Struktur dasar beberapa linkkosida neuritogenik
123
 Tabel 1Data NMR untuk linckosides MQ (1–5)dalam CD3OD
140

# 1 2 3 4 5

123
DC DHbanyak. (Jdalam Hz) DC DHbanyak. (Jdalam Hz) DC DHbanyak. (Jdalam Hz) DC DHbanyak. (Jdalam Hz) DC DHbanyak. (Jdalam Hz)

1 39.7 1,28 m, 1,78 m 39.7 1,27 m, 1,77 m 39.7 1,28 m, 1,78 m 39.7 1,26 m, 1,78 m 39.7 1,27 m, 1,77 m
2 27.9 1,74m, 1,96m 27.9 1,74m, 1,96m 27.9 1,77m, 1,97m 27.9 1,74m, 1,97m 27.7 1,74m, 1,98m
3 77.5 4,18 m 77.5 4,18 m 77.5 4,18 m 77.5 4,18 m 77.1 4,19 m
4 126.9 5,64 detik 126.9 5,64 detik 126.9 5,64 detik 126.9 5,63 detik 126.9 5,67 detik

5 148.5 – 148.5 – 148.5 – 148.6 – 148.3 –

6 76.4 4,30 ton (2,4) 76.4 04.30 s 76.4 4.31 br s 76.4 04.30 s 76.2 4,30 ton (3,0)
7a 44.4 1,50 hari (14.7, 3.0) 44.4 1,50 hari (14.7, 3.0) 44.4 1,50 hari (14.7, 3.0) 44.4 1,49 hari (14.7, 3.0) 44.4 1,50 hari (14.7, 3.0)
7b 2,56 hari (14.7, 2.4) 2,56 hari (14.7, 2.4) 2,56 hari (14.7, 2.4) 2,57 hari (14.7, 2.4) 2,57 hari (14.7, 2.4)
8 76.2 – 76.2 – 76.2 – 76.2 – 76.2
9 57.9 1,04 m 57.9 1,04 m 57.9 1,04 m 57.8 1,02 m 57.8 1,02 m
10 37.8 – 37.7 – 37.7 – 37.7 – 37.7 –
11a 19.5 1,50 m 19.5 1,50 m 19.5 1,50 m 19.5 1,48 m 19.5 1,48 m
11b 1,87 brq (13,2) 1,87brq (13,8) 1,87 brq (13,2) 1,86 brq (13,8) 1,86 brq (13,2)
12 43.0 1,21 m, 1,95 br d (12,6) 43.0 1,21 m, 1,94 br d (12,6) 43.0 1,21 m, 1,95 br d (12,6) 43.0 1,16 m, 1,95 br d (12,6) 43.0 1,18 m, 1,96 br d (12,6)
13 45.1 – 45.1 – 45.1 – 45.1 – 45.1 –
14 63.8 1,02 hari (10,5) 63.8 1,03 m 63.8 1,03 m 63.7 1,00 hari (10,5) 63.7 1.01 hari (10.2)
15 80.3 4.16 hari (10.5, 2.4) 80.3 4.16 hari (10.5, 2.4) 80.3 4.16 hari (10.5, 2.4) 80.8 4.14 hh (10.5, 2.4) 81.0 4.15 hari (10.8, 2.4)
16 83.4 3,90 hari (7.2, 2.4) 83.5 3,92 hari (7.2, 2.4) 83.4 3,92 hari (7.2, 2.4) 82.9 3,95 hari (7.5, 2.4) 82.9 3,96 hari (7.8, 2.4)
17 61.0 1,25 hari (10.8, 7.2) 61.0 1,26 hari (10.8, 7.8) 61.0 1,26 hari (10.8, 7.8) 60.6 1,14 m 60.5 1,20 hari (10.8, 7.8)
18 17.0 1,16 detik 17.0 1,16 detik 16.9 1,16 detik 16.7 1,12 detik 16.8 1,13 detik

19 22.7 1,37 detik 22.6 1,37 detik 22.6 1,37 detik 22.7 1,36 detik 22.6 1,35 detik

20 34.5 2,50 m 34.7 2,52 m 34.6 2,53 m 30.7 1,81 m 30.7 1,83 m
21 20.6 1.01 hari (6.6) 20.7 1,04 hari (6.6) 20.7 1,04 hari (7.2) 18.5 0,91 hari (6.6) 18.4 0,92 hari (6.6)
22 137.2 5.47 hh (15.6, 7.2) 139.5 5,45 hari (15.3, 7.8) 139.9 5,50 hari (15.3, 7.8) 34.8 0,95m, 1,44m 34.7 1,11 m, 1,54 m
23 134.2 5.40 hari (15.6, 7.8) 131.9 5.26 hari (15.3, 9.0) 130.9 5,24 hari (15.3, 9.0) 31.3 1,28 m, 1,44 m 32.7 1,27 m
24 40.2 2,14 m 49.3 1,77 m 47.3 1,93 m 45.7 2,17 m 35.1 1,53 m
25 39.9 1,67 m 39.0 1,70 m 33.4 1,55 m 148.6 – 41.2 1,61 m
26a 74.3 3,29 mA 74.2 3,28 mA 19.4 0,84 hari (6,6) 112.4 4,73 detik, 4,70 detik 66.9 3,34 hari (10.8, 6.6)
26b 3,80 hari (10.8, 5.4) 3,83 hari (9,6, 5.4) 3,46 hari (10,8, 6,0)
27 14.8 0,91 hari (6.6) 16.0 0,95 hari (6.6) 21.2 0,88 hari (6,6) 18.2 1,61 detik 12.0 0,80 hari (6,6)
28 17.4 0,95 hari (7.2) 25.8 1,23m, 1,53m 33.7 1,48 m, 1,77 m 43.8 1,66 m 14.7 0,79 hari (6,6)
29 – – 12.5 0,83 ton (7,2) 69.7 3,47 m, 3,81 m 69.4 3,73 m, 3,47 m – –
1¢ 104.6 4.41 hari (7.8) 104.6 4.41 hari (7.2) 104.6 4.41 hari (7.8) 104.6 4.41 hari (7.2) 104.4 4.36 hari (7.8)
2¢ 84.9 2,82 hari (9.0, 7.8) 84.9 2,82 hari (8.4, 7.8) 84.9 2,82 hari (9.0, 7.8) 84.9 2,81 hari (9.6, 7.8) 75.7 3,14 hari (9.0, 7.8)
3¢ 77.5 3,30 mA 77.5 3,29 mA 77.5 3,29 mA 77.5 3,29 mA 78.0 3,29 mA
4¢ 71.3 3.47 hdd (10.2, 9.0, 5.4) 71.3 3.46 hdd (10.2, 9.0, 5.4) 71.3 3.47 hdd (10.2, 9.0, 5.4) 71.2 3.46 hdd (10.2, 9.0, 5.4) 71.2 3.47 hdd (10.2, 9.0, 5.4)
5¢A 66.8 3.17 hari (11.4, 10.2) 66.8 3.16 hari (11.4, 10.2) 66.8 3.16 hari (11.4, 10.2) 66.8 3,15 hari (11.4, 10.2) 66.9 3.19 hari (11.4, 10.2)
5¢B 3,80 hari (11.4, 5.4) 3,80 hari (11.4, 5.4) 3,80 hari (11.4, 5.4) 3,80 hari (11.4, 5.4) 3,83 hari (11.4, 5.4)
Ya ampun 61.1 3,57 detik 61.1 3,57 detik 61.1 3,57 detik 61.1 3,57 detik

1'' 105.4 4.16 hari (7.8) 105.4 4.15 hari (7.2) 105.3 4.16 hari (7.8) 105.1 4.15 hari (7.8)
2'' 74.9 3,17 m 74.9 3,18 m 74.8 3,16 m 74.9 3,14 m
3'' 77.9 3,29 mA 77.9 3,30 mA 77.9 3,30 mA 77.9 3,30 mA
4'' 71.3 3.46 hdd (10.2, 9.0 5.4) 71.3 3.46 hdd (10.2, 9.0 5.4) 71.3 3.46 hdd (10.2, 9.0 5.4) 71.2 3.46 hdd (10.2, 9.0 5.4)
5'a 67.0 3.18 hari (11.4, 10.2) 66.9 3.19 hari (11.4, 10.2) 66.9 3.18 hari (11.4, 10.2) 66.9 3.16 hari (11.4, 10.2)
5'b 3,85 hari (11.4, 5.4) 3,84 hari (11.4, 5.4) 3,84 hari (11.4, 5.4) 3,83 hari (11.4, 5.4)

Diamati pada 150 MHz untuk13C dan pada 600 MHz untuk1H
ASinyal di bawah sinyal pelarut
J Nat Med (2007) 61:138–145
J Nat Med (2007) 61:138–145
Untuk (R)-MTPA esternya (24S,25R)isomer Dd =0,34
ppm [8].
Rumus molekul linckoside O (3)ditentukan menjadi
C40H66HAI14oleh HR ESI–TOF–MS. Data NMR (Tabel1)
untuk3mirip dengan linckoside B (11) [1] kecuali
kehadiran anE ikatan rangkap pada rantai samping,
yang dikonfirmasi oleh korelasi DQF-COSY dari H-21-
H-22-H-23-H-24 dan konstanta kopling dariJ22–23=
15,3Hz. Berdasarkan percobaan DQF-COSY, HMBC,
dan NOESY, lokasi dan sifat dua gugus gula dan
stereokimia relatif molekulnya sama dengan
linckoside B (11).Stereostruktur absolut dari3
dikonfirmasi oleh hidrogenasi regioselektif dengan
Rh-Al2HAI3ke11.
Berdasarkan HR MS, linckoside P (4)mempunyai
rumus molekul yang sama dengan3,C40H66HAI14. Data
NMR (Tabel1) untuk4hampir dapat ditumpangkan
pada linckoside B (11),kecuali sinyal dari gugus
isopropenil dan bukan dari gugus isopropil terminal
11.Struktur lengkapnya, termasuk konfigurasi
absolut, dikonfirmasi dengan konversi4menjadi
linckoside B (11)dengan reduksi selektif, dengan cara
yang sama seperti konversi3ke11.
Data NMR untuk linckoside Q (5)hampir dapat
ditumpangkan pada metabolit bintang laut yang
diketahui, desulfasi 22(23)-dihydroechinasteroside A [
4], kecuali kurangnya gugus metil eter pada 2¢-HAI-
posisi xilosa terikat pada C-3. Rumus molekul yang
diperoleh dari analisis HR MS mendukung hal ini
Gambar 2Struktur
linckosida M – Q (1–5)dan
senyawa terkait
141
2¢-HAI-struktur demetil. Data NMR untuk bagian kiri
molekul dapat ditumpangkan pada data untuk
linckosida G, H, dan J, sedangkan data untuk bagian
kanan molekul sangat sesuai dengan data untuk 22(23)-
dihydroechinasteroside A yang didesulfasi,
menunjukkan bahwa stereostruktur absolut diberikan
untuk5 pada Gambar.2.
Identifikasi metabolit echinasterosida A yang
didesulfasi (6) [6] dan B (7) [2,6] dicapai dengan
membandingkan data spektral dengan yang dilaporkan.
Glikosida steroid1–7dievaluasi aktivitas neuritogeniknya,
dibandingkan dengan NGF, dengan menggunakan sel
PC12. Angka5menunjukkan aktivitas neuritogenik mirip
NGF (meniru NGF) yang diwakili oleh persentase sel dengan
pertumbuhan neurit yang jelas yang diinduksi 6 hari setelah
pengobatan. Konsentrasi disesuaikan dengan perkiraan
nilai maksimum antara 20 dan 40akumol L–1, sehingga
sitotoksisitas tidak akan diamati. Diantara ketujuh senyawa
tersebut1–7, linkkoside P (4)pada usia 40akumol L–1memiliki
aktivitas neuritogenik tertinggi (55%), yang sebanding
dengan NGF pada 10 ng mL–1. Aktivitas ini juga mirip
dengan linckoside B (11) [1], mendukung pentingnya
struktur dasar yang diberikan pada Gambar.1.
Fotomikrograf pada Gambar.6menunjukkan induksi proses
multipolar pada sel PC12 dengan4 (Ara.6c) dengan cara
yang sama seperti NGF pada 10 ng mL–1(Ara.6B). Tidak ada
pertumbuhan neurit yang diekspresikan dalam percobaan
kontrol (Gbr. 2).6A). Hasilnya ditunjukkan pada Gambar.5
mengungkapkan beberapa hubungan struktur-aktivitas
penting
123
142
Gambar 3Struktur kasar linckoside M (1)dengan korelasi NMR
2D
Gambar 4Korelasi NOE penting yang ditentukan oleh eksperimen
NOESY pada linckoside M (1)
Gambar 5Aktivitas meniru NGF dari linckosida dan metabolit
terkait. Konsentrasi: 40akumol L–1untuk linckosida M (1), O–Q (
3–5),dan B (11);30akumol L–1untuk linckoside N (2); 20akumol L–
1untuk echinasterosida A yang didesulfasi (6)dan B (7).Aktivitas
tersebut diwakili oleh persentase sel PC12 dengan proses
neurit yang lebih panjang dari diameter sel pada hari ke 6
setelah pengobatan.Ckontrol (1% DMSO),NGFkontrol positif (10
ng mL–1)
kapal yang memperluas ketepatan dan kedalaman hubungan
yang diketahui sebelumnya [3]:
cabang karbon C-24 yang dimodifikasi oleh pentosa pada
rantai samping (A)adalah arsitektur terbaik (aktivitas3, 4,
Dan11lebih besar dibandingkan senyawa lainnya);
123
J Nat Med (2007) 61:138–145
Gambar 6Fotomikrograf fase kontras sel PC12 6 hari setelah
perawatan.AKontrol (tidak ada sampel),BNGF (10 ng mL–1), C
linkkoside P (4,40akumol L–1),Dlinkkoside P (4,40akumol L–1) +
NGF (1,5 ng mL–1)
pentosa pada cabang karbon C-24 lebih baik daripada
gugus yang sama pada ujung rantai samping (aktivitas3,
4,Dan11lebih besar dari pada1Dan2);
yang 2¢-HAI-metil eter dari xilosa C-3
meningkatkan aktivitas (aktivitas6lebih besar dari
pada5)[3]; Dan
cabang karbon C-24 itu sendiri tidak penting
(aktivitas11jauh lebih besar dari itu7).
Semua senyawa secara signifikan meningkatkan
aktivitas neuritogenik sejumlah kecil NGF (Gbr. 2).7). Tiga
hari setelah pengobatan, senyawa saja (20-40akumol L–1)
hanya menginduksi 1–13% pertumbuhan neurit, dan
NGF pada konsentrasi rendah (1,5 ng mL–1) memiliki 11%
dari aktivitas ini. Namun, aktivitas NGF yang rendah ini
ditingkatkan menjadi 60–99% dengan adanya senyawa
lain. Angka6d menunjukkan proses neurit yang luar
biasa pada sel PC12 yang disebabkan oleh efek
peningkatan ini. Aktivitas peningkatan NGF nampaknya
merupakan karakteristik umum dari linckosida, terlepas
dari jumlah kelompok gulanya (Gbr. 1).7).
Eksperimental
Prosedur eksperimen umum
HPLC preparatif dilakukan dengan sistem HPLC yang
dilengkapi dengan pompa Jasco PU-1586 dan Jasco
PU-2086 serta detektor UV-visibel Jasco UV-1570.
Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan pada
J Nat Med (2007) 61:138–145
Gambar 7Peningkatan aktivitas neuritogenik NGF oleh
linckosida dan metabolit terkait. Konsentrasi sama dengan
yang ditunjukkan pada Gambar.5. Aktivitas dievaluasi pada hari
ke 3 setelah perlakuan.Ckontrol (1% DMSO),NGFkontrol positif
(40 ng mL–1)
silika gel 60 F254piring (Merck). Rotasi optik diukur
pada polarimeter digital Jasco DIP-370. Spektrum IR
direkam pada Jasco FT/IR-7000S. HR ESI – TOF – MS
direkam pada Stasiun Kerja Biospektrometri Mariner
Biosystems Terapan menggunakan PEG 600 sebagai
standar kalibrasi dalam mode ion positif. Spektrum
NMR direkam pada spektrometer Bruker AMX2–600
(600 MHz untuk1H), dan pergeseran kimiaDdalam
ppm direferensikan ke puncak pelarut diDC49.0 danD
H3.30 untuk CD3OD.
Bahan binatang
Bintang lautL.laevigatadikumpulkan di Pulau Akajima
di Prefektur Okinawa, Jepang, pada bulan September
2004. Spesimen voucher (No.031023A) disimpan di
laboratorium penulis.
Isolasi
Ekstraksi bintang lautL.laevigata (7,7 kg, berat basah) dan
pemisahan kromatografi pada ODS kemudian silika gel
telah dijelaskan sebelumnya secara rinci [3]. Di antara fraksi
yang diperoleh dengan kromatografi silika gel, fraksi
keempat neuritogenik (833 mg) dielusi dengan CHCl3–
MeOH (7:1, 6:1) dipisahkan dengan HPLC (TSK gel ODS-120T
(/ 20 mm·250 mm), TOSOH, Tokyo; 70% persegi. MeOH, laju
alir 8 mL min–1, terdeteksi pada 205 nm, delapan suntikan)
untuk menghasilkan echinasteroside B yang terdesulfasi (7,
17,9 mg,TR= 125,3–133,8 menit) dan tiga
143
fraksi yang mengandung senyawa relevan. Fraksi (11,3 mg)
yang dielusi dalam 64,8–67,9 menit dimurnikan dengan
HPLC (Develosil ODS-5 (/ 20 mm·250 mm), Nomura
Chemical, Aichi, Jepang; 35–50% persegi. MeCN, gradien
linier 60 menit, laju aliran 8 mL mnt–1, terdeteksi pada 205
nm) untuk menghasilkan linckoside M (1,2,5mg,TR= 25,0–
28,2 menit). Fraksi (63,7 mg) dielusi dalam
81,6–90,9 menit dimurnikan dengan HPLC (TSK gel
ODS-120T (/ 20 mm·250 mm), 30–50% aq. MeCN, gradien
linier 80 menit, laju aliran 8 mL mnt–1, terdeteksi pada 205
nm) untuk menghasilkan echinateroside A yang terdesulfasi
(6, 34mg,TR= 61,4–63,0 menit). Fraksi (34,5 mg) yang dielusi
dalam 111,6–121,7 menit dimurnikan dengan HPLC
(Develosil ODS-5 (/ 10 mm·250 mm), 38% persegi. MeCN,
laju alir 2 mL mnt–1, terdeteksi pada 205 nm) untuk
menghasilkan linckoside N (2,2,2mg,TR= 46,4–55,1 menit)
dan linckoside O (3,1,3mg,TR= 62,8–67,1 menit). Fraksi
kelima neuritogenik (680 mg) dari kromatografi silika gel,
yang dielusi dengan CHCl3–MeOH (5:1, 4:1), dipisahkan
dengan HPLC pada kondisi yang sama untuk fraksi
keempat. Fraksi (16,5 mg) dielusi dalam 53,8–56,8 menit
kemudian dimurnikan dengan HPLC (TSK gel ODS-120T (/ 20
mm·250 mm), 38% persegi. MeCN, laju aliran 6 mL min–1,
terdeteksi pada 205 nm) untuk menghasilkan linckoside P (
4,0,8mg,TR= 28,9–31,5 menit) dan campuran (5,4 mg,TR=
36,5–44,0 menit). Campuran ini kemudian dimurnikan
dengan HPLC (Develosil ODS-5 (/ 10 mm· 250 mm), 58% aq.
EtOH, laju alir 1 mL min-–1, terdeteksi pada 205 nm) untuk
menghasilkan linckoside Q (5,2,8 mg, TR= 34,9–38,5 menit).
LinkkosideM (1)
Bubuk putih. [A]16 D–35- (C0,22, MeOH). IR (KBr)
cm–1: 3.422, 1.636, 1.160, 1.117, 1.055, 982, 881. Data
NMR : lihat Tabel1. SDM ESI–TOF–MSm/z:779.4190 [M +
Na]+(Hitung untuk C39H64HAI14Na: 779.4188).
LinkkosideN (2)
Bubuk putih. [A]23 D–36- (C0,11, MeOH). IR (KBr)
cm–1: 3.421, 1.647, 1.161, 1.046, 982. Data NMR : lihat
Tabel1. SDM ESI–TOF–MSm/z:793.4327 [M + Na]+
(Hitung untuk C40H66HAI14Na: 793.4344).
LinkkosideHAI (3)
Bubuk putih. [A]18 D–33- (C0,12, MeOH). IR (KBr)
cm–1: 3.417, 1.637, 1.386, 1.161, 1.058, 981. Data
NMR : lihat Tabel1. SDM ESI–TOF–MSm/z:793.4349 [M
+ Na]+(Hitung untuk C40H66HAI14Na: 793.4344).
123
144
LinkkosideP (4)
Bubuk putih. [A]22 D–29- (C0,07, MeOH). IR (KBr)
cm–1: 3.421, 1.647, 1.161, 1.058, 983, 885. Data NMR :
lihat Tabel1. SDM ESI–TOF–MSm/z:793.4310 [M + Na]+
(Hitung untuk C40H66HAI14Na: 793.4344).
LinkkosideQ (5)
Bubuk putih. [A]21 D–16- (C0,25, MeOH). IR (KBr)
cm–1: 3,425, 1,637, 1,61, 1,069, 879. Data NMR : lihat
Tabel1. SDM ESI–TOF–MSm/z:635.3753 [M + Na]+
(Hitung untuk C33H56HAI10Na: 635.3766).
Echinasteroside A yang didesulfasi (6)
Bubuk putih. [A]16 D–22- (C0,25, MeOH).1H NMR
(CD3OD)D:5.64 (1H, s, H-4), 5.42 (1H, hh,J =15.3, 7.8
Hz, H-22), 5.27 (1H, hh,J =15.3, 9.0Hz, H-23),
4.41 (1H, hari,J =7,2 Hz, H-1¢),4.30 (1H, br s, H-6), 4.18
(1H, m, H-3), 4.15 (1H, hh,J =10,8, 2,4 Hz, H-15), 3,88
(1H, hh,J =7.2, 2.4 Hz, H-16), 3.80 (1H, hh, J =11.4,
5.4Hz, H-5¢persamaan), 3,57 (3H, s, OMe), 3,50 (1H,
dd,J =10.8, 5.4 Hz, H-26), 3.46 (1H, hdd,J =10.2, 9.0,
5.4Hz, H-4¢),3,34 (1H, m, H-26), 3,30 (1H, m, H-3¢),
3.16 (1H, hh,J =11.4, 10.2Hz, H-5¢kapak), 2,81 (1H, hh,
J =9.6, 7.8Hz, H-2¢),2.56 (1H, hh,J =14.7, 2.4 Hz, H-7),
2.51 (1H, m, H-20), 2.07 (1H, m, H-24), 1.96 dan
1,75 (masing-masing 1H, m, H-2), 1,95 (1H, br d,J =12,6 Hz, H-
12), 1,87 (1H, brq,J =13,8 Hz, H-11), 1,78 dan 1,28
(masing-masing 1H, m, H-1), 1,51 (2H, m, H-25), 1,50 (1H,
m, H-11), 1,49 (1H, hh,J =14,7, 3,0 Hz, H-7), 1,36 (3H, s, H-
19), 1,24 (1H, hh,J =10.8, 7.2 Hz, H-17), 1.21 (2H, m,
H-12), 1.15 (3H, s, H-18), 1.04 (1H, m, H-9), 1.02 (1H, d,J
=10,2 Hz, H-14), 1,01 (3H, hari,J =6,6 Hz, H-21), 0,94
(3H, hari,J =6,6 Hz, H-28), 0,87 (3H, t,J =7,2Hz, H-27).
ESI–TOF–MSm/z:647,4 [M + Na]+.
Echinasteroside B yang didesulfasi (7)
Bubuk putih. [A]21 D–15- (C0,36, MeOH). (dilaporkan
data: [A]D–16-) [4]; ESI–TOF–MSm/z:663,2 [M + Na]+.
Ehidrolisis enzimatik dari1ke6dengan xilosidase
Linkkoside M (1,1,4 mg) dilarutkan dalam campuran 0,25
mL EtOH, 0,4 mL 0,1 mol L-–1buffer asetat (pH 4,0), dan
0,05 mL air suling. Ke dalam larutan, 0,3 mLexo-1,4-B-D
-xylosidase (dariAspergillus niger,1,45 U mL–1, Sigma) [5],
ditambahkan, dan campuran diinkubasi selama 2 jam
pada suhu 38-C. Reaksi dipadamkan dengan 0,55 mol L–
1Tidak2BERSAMA3larutan
123
J Nat Med (2007) 61:138–145
(0,2 mL), dan campuran didesalinasi melalui ODS (0,21 g
Cosmosil 75C18-OPN, Nacalai Tesque) dengan H2HAI dan
kemudian MeOH. Fraksi yang dielusi dengan MeOH
diuapkan dan dimurnikan dengan HPLC (Develosil ODS-
UG-5 (/ 10 mm·250 mm), 75% aq. MeOH, laju alir 2 mL
min–1, terdeteksi pada 205 nm) menghasilkan
echinasteroside A yang terdesulfasi (6) (0,2 mg, 14%,
TR= 51,3 menit): [A]16 D–25- (C0,02, MeOH).
(R)-ester MTPA8dari6
Menggabungkan6 (2,7mg, 4.2akumol) diperlakukan dengan (+)-
(S)-metoksi-trifluorometilfenilasetil (MTPA) klorida (3.5
akuaku, 16akumol, Fluka Chemie, Swiss) dalam piridin
kering (2 mL) selama 3 jam pada suhu kamar. Tiga tetes
air suling kemudian ditambahkan untuk menghentikan
reaksi. Campuran reaksi diuapkan dan dimurnikan
dengan HPLC (Develosil ODS-UG-5 (/ 10 mm·250 mm),
85–100% aq. MeOH, gradien linier 60 menit, laju aliran 2
mL mnt–1, terdeteksi pada 205 nm) menghasilkan (R)-
ester MTPA8 (1,5 mg, 56%,TR= 30,4 menit) :
1H NMR (CD3OD)D:5.64 (1H, s, H-4), 5.44 dan 5.20
(masing-masing 1H, dd,J =15.3, 7.8 Hz,
H-22, 23), 4.41 (1H, hari, J =7,8 Hz, H-1¢),4.30 (1H, br s,
H-6), 4.27 (1H, hh, J =10.8, 4.8 Hz, H-26), 4.18 (1H, m,
H-3), 4.15 (2H, m, H-15 dan H-26), 3.87 (1H, hh,J =7.2, 2.4
Hz, H-16), 3.80 (1H, hh,J =11.4, 5.4Hz, H-5¢persamaan),
3,57 (3H, s, OMe), 3,47 (1H, ddd,J =10.2, 9.0 dan 5.4 Hz,
H-4¢),
3.30 (1H, m, H-3¢),3.15 (1H, hh,J =11.4, 10.8Hz, H-5¢kapak),
2,82 (1H, hh,J =9.0, 7.8Hz, H-2¢),2.56 (1H, hh, J =14.7, 2.4 Hz,
H-7eq), 2.49 (1H, m, H-20), 2.04 (1H, m, H-24), 1.96 dan 1.76
(masing-masing 1H, m, H-2), 1.95 (1H, saudara
d, J = 12,6 Hz, H-12), 1,87 (1H, br q,J =12,6 Hz, H-
11), 1,78 dan 1,28 (masing-masing 1H, m, H-1), 1,73 (1H, m, H-
25), 1,50 (1H, m, H-11), 1,49 (1H, hh,J =14,4, 3,0 Hz,
H-7ax), 1,37 (3H, s, H-19), 1,24 (1H, dd,J =10.8, 7.8 Hz,
H-17), 1.22 (1H, m, H-12), 1.16 (3H, s, H-18),
1,04 (1H, m, H-9), 1,03 (3H, hari,J =10,2 Hz, H-14), 1,00
(1H, hari,J =6,6 Hz, H-21), 0,93 (3H, hari,J =6,6 Hz,
H-28), 0,90 (3H, hari,J =7,2Hz, H-27).
Ehidrolisis enzimatik dari2ke9dengan xilosidase
Linkkosida N (2,1,2 mg) diobati denganexo-1,4-B-D-
xilosidase dalam kondisi yang sama seperti untuk1.
Produk mentah dimurnikan dengan HPLC (Develosil
ODS-UG-5 (/ 10 mm·250 mm), 80% persegi. MeOH, laju
alir 2 mL min–1) untuk memberikan turunan dexyloside9
(0,2 mg, 17%,TR= 44,9 menit):1H NMR (CD3OD)D:5.64 (1H,
s, H-4), 5.42 (1H, hh,J =15.3, 7.8 Hz, H-22), 5.27 (1H, hh,J =
15.3, 9.0 Hz, H-23), 4.41 (1H, hari,J =7,8 Hz, H-1¢),4.30
(1H, br s, H-6), 4.18 (1H, m, H-3), 4.15 (1H, hh,J =10,8, 2,4
Hz, H-15), 3,90 (1H, hh,J =7.2,
J Nat Med (2007) 61:138–145
2,4 Hz, H-16), 3,80 (1H, hh,J =11.4, 5.4Hz, H-5¢persamaan),
3,57 (3H, s, OMe), 3,53 (1H, hh,J =10,8, 5,4 Hz, H-
26), 3,47 (1H, hh,J =10.2, 9.0, 5.4Hz, H-4¢),3.30 (1H, m,
H-3¢),3,29 (1H, m, H-26), 3,15 (1H, hh, J =11.4, 10.2Hz,
H-5¢kapak), 2,82 (1H, hh,J =9.0, 7.8Hz, H-2¢),2.56 (1H,
hh,J =14.7, 2.4 Hz, H-7), 2.53 (1H, m, H-20), 1.96 dan
1.72 (masing-masing 1H, m, H-2), 1.95 (1H, br d,J =
12,6 Hz, H-12), 1,87 (1H, br q, J =13,8 Hz, H-11), 1,78
dan 1,28 (masing-masing 1H, m, H-1), 1,72 (1H, m,
H-24), 1,54 (2H, m, H-25, H-28), 1,50 ( 1 jam,
m, H-11), 1,49 (1H, hh,J =14.4, 3.6 Hz, H-7), 1.36 (3H, s,
H-19), 1.25 (1H, hh,J =10.8, 7.2 Hz, H-17), 1.21 (2H, m,
H-12, H-28), 1.16 (3H, s, H-18), 1.05 (1H,
m, H-9), 1,04 (3H, hari,J =6,6 Hz, H-21), 1,03 (1H, m,
H-14), 0,91 (3H, d,J =6,6 Hz, H-27), 0,84 (3H, t, J =7,2Hz,
H-29).
(R)-ester MTPA10dari9
Menggabungkan9 (0,5 mg, 0,47akumol) diperlakukan dengan (+)-
(S)-MTPA klorida (2akuL) dalam kondisi yang sama
seperti untuk6.Produk mentah dikromatografi pada
ODS (Cosmosil 75C18-OPN, 0,23 g) dielusi dengan 90
% aq. MeOH untuk mampu (R)-ester MTPA10 (0,4 mg,
80%):1H NMR (CD3OD)D:5.48 (1H, s, H-4), 5.40 (1H, hh,J
=15.3, 7.8 Hz, H-22), 5.21 (1H, hh,J =10.8, 1.2 Hz, H-15),
5.13 (1H, hh,J =15.3, 9.0Hz, H-23),
4,97 (1 jam, hh,J =10.2, 9.0, 5.4Hz, H-4¢),4.43 (1H, hari,
J =7,2 Hz, H-1¢),4.27 (1H, hh,J =10.8, 4.8 Hz, H-26), 4.13
(1H, m, H-3), 4.10 (1H, hh,J =10,8, 6,6 Hz, H-
26), 4.01 (1H, hh,J =6,9, 1,2 Hz, H-16), 3,92 (1H, hh, J =
11.4, 5.4Hz, H-5¢persamaan), 3,81 (1H, br s, H-6), 3,58
(3H, s, OMe), 3,30 (1H, m, H-3¢),3.20 (1H, hh,J =11.4,
10,2 Hz, H-5¢kapak), 2,93 (1H, hh,J =8.7, 7.8Hz, H-2¢),
2,59 (1H, m, H-20), 1,97 (1H, br d,J =12,0 Hz, H-12),
1,93 dan 1,72 (masing-masing 1H, m, H-2), 1,86 (1H, br q, J =
10,8 Hz, H-11), 1,73 dan 1,29 (masing-masing 1H, m, H-1),
1,70 (1H, m, H-24), 1,69 (1H, m, H-25), 1,48 (2H, m, H-
11, H-28), 1,43 (1H, hh,J =14,4, 2,4 Hz, H-7), 1,30 (3H, s,
H-19), 1,28 (1H, m, H-17), 1,23 (3H, s, H-18), 1,22 (1H,
m, H -14), 1,21 (1H, m, H-12), 1,12 (1H, m, H-
28), 1,11 (1H, m, H-9), 1,02 (3H, d,J =6,6 Hz, H-21), 0,89
(3H, hari,J =6,6 Hz, H-27), 0,85 (1H, hh,J =14,4, 3,6 Hz,
H-7), 0,75 (3H, t,J =7,2Hz, H-29).
Hidrogenasi katalitik linckoside O (3) ke
linkkoside B (11)
Linkkosida O (3) (0,4 mg, 0,52akumol) dilarutkan dalam
MeOH (0,5 mL), dan Rh-Al2HAI3(1,2 mg, Wako, Osaka,
Jepang) ditambahkan. Campuran diaduk dalam atmosfer
hidrogen selama 2 jam pada suhu kamar. Katalis
dihilangkan dengan penyaringan (Minisart RC 4,
145
0,45akum, Sartorius, Goettingen, Jerman), dan
filtratnya dipekatkan. Residunya dimurnikan dengan
HPLC (Develosil ODS-UG-5 (/ 10 mm·250 mm), 40%
persegi. MeCN, laju alir 2 mL mnt–1) memberi11
(0,3 mg, 75%,TR= 28,9 menit): [A]21 D–25- (C0,03,
MeOH). menyala. [A]25 D–27- (C0,17, MeOH) [1].
Hidrogenasi katalitik linckoside P (4) ke
linkkoside B (11)
Solusi linckoside P (4,0,4 mg, 0,52akumol) dalam MeOH
(0,5 mL) diaduk dengan adanya Rh-Al2HAI3(1,0 mg)
dalam atmosfer hidrogen selama 1 jam pada suhu
kamar. Prosedurnya sama seperti untuk3 memberi
linckoside B (11) (0,2 mg, hasil 50%,TR= 30,7–
33,4 menit): [A]23 D–24- (C0,02, MeOH).
Tes biologis
Aktivitas neuritogenik (induksi ekstensi neurit)
ditentukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [1].
Ucapan Terima KasihPekerjaan ini didukung secara finansial oleh
KAKENHI (B) (16310151) dari JSPS dan Grand-in-Aid for Scientific
Research on Priority Areas (18032038) dari MEXT, Jepang. Kami
berterima kasih kepada Laboratorium Sains Kelautan Akajima
(Pembentukan Penelitian Ekologi Kelautan Tropis, Tokyo) atas
bantuan mereka dalam pengumpulan bintang laut.
Referensi
1. Qi J, Ojika M, Sakagami Y (2002) Linckosida A dan B, dua
glikosida steroid neuritogenik baru dari bintang laut
OkinawaLinckia laevigata.Bioorg Med Kimia 10:1961–1966
2. Qi J, Ojika M, Sakagami Y (2004) Linckosides C – E, tiga
glikosida steroid neuritogenik baru dari bintang laut
OkinawaLinckia laevigata.Bioorg Med Kimia 12:4259–4265
3. Han C, Qi J, Ojika M (2006) Hubungan struktur-aktivitas
glikosida steroid neuritogenik baru dari bintang laut
OkinawaLinckia laevigata.Bioorg Med Kimia 14:4458–4465
4. Iorizzi M, De Riccardis F, Minale L, Riccio R (1993) Saponin
bintang laut, 52. Kandungan kimia dari bintang laut
Echinaster brasiliensis.J Nat Prod 56:2149–2162
5. Shinoyama H, Yasui T (1988)B-Aktivitas xilosidase dan reaksi
transxylosyl dengan adanya pelarut yang larut dalam air.
Nippon Nogeikagaku Kaishi 62:1339–1343
6. Zollo F, Fiamore E, Minale L (1985) Saponin bintang laut. XXIV.
Dua glikosida sulfat steroid baru dari bintang laut Echinaster
sepositus.Gazz Chim Italia 115:303–306
7. D'Auria MV, De Riccardis F, Minale L, Riccio R (1990) Sintesis
rantai samping 24-metil-26-hidroksisteroid: model untuk
tugas stereokimia dalam steroid laut polihidroksilasi. J Chem
Soc Perkin Trans 1:2889–2893
8. D'Auria MV, Paloma LG, Minale L, Riccio R (1990) Penugasan
stereokimia pada C-24 dan C-25 steroid 24-etil-26-hidroksi
laut melalui perbandingan dengan sintetis (24S,25S)-, (24S,25
R)-, (24R,25R)-, (24R,25S)-model. J Chem Soc Perkin Trans
1:2895–2898
123