TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

MAKALAH

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas

Mata Kuliah Bioteknologi

Oleh :
Erlin Fujianti

122154042

Wini Agustin

122154052

Neng Revi Rismayanti

122154061

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SILIWANGI
TASIKMALAYA
2014

KATA PENGANTAR

Puji serta syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt. karena berkat
rahmat-Nya yang telah memberi nikmat kesehatan dan kesempatan sehingga
penulis mampu menyelesaikan makalah berjudul Teknologi DNA Rekombinan.
Makalah ini disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Bioteknologi.
Dengan berkembangnya ilmu pengetahuan diketahui bahwa setiap
makhluk hidup menggunakan DNA dan RNA untuk menyimpan dan metransfer
informasi genetiknya. Sehingga para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya
materi gen ini dimanipulasi sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat
genetiknya sesuai dengan yang diinginkan. Kemudian berkembang teknologi baru
dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi
DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik.
Penulis menyadari bahwa selama penulisan makalah ini banyak mendapat
bantuan dari berbagai pihak. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada :
1.

Egi Nuryadin, S.Pd., selaku dosen mata kuliah Bioteknologi yang telah
membantu selama menyusun makalah ini;

2.

rekan-rekan kelas yang telah memotivasi penulis untuk menyelesaikan

penyusunan makalah ini;

3.

semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.
Semoga Allah swt. memberikan balasan yang berlipat ganda. Makalah ini

bukanlah karya yang sempurna karena masih memiliki banyak kekurangan, baik
dalam hal isi maupun sistematika dan teknik penulisannya. Oleh sebab itu, penulis
sangat mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun demi
kesempurnaan makalah ini. Semoga makalah ini bisa membarikan manfaaat bagi
penulis dan bagi pembaca. Amin.

Tasikmalaya, 20 September 2014

Penulis

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .................................................................................

DAFTAR ISI ................................................................................................

ii

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................

A. Latar Belakang ................................................................................

B. Rumusan Masalah ...........................................................................

C. Tujuan Makalah ..............................................................................

D. Kegunaan Makalah .........................................................................

E. Prosedur Makalah ...........................................................................

BAB II PEMABAHASAN ..........................................................................

A. Teknik Isolasi DNA .........................................................................

B. Isolasi mRNA dan Pembuatan cDNA ...........................................

C. Pembuatan Gen Sintetik .................................................................

D. Amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR ..................................

E. Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi ............ 12

F. Penyambungan DNA (ligasi DNA) ................................................ 14
BAB III PENUTUP ..................................................................................... 17
A. SIMPULAN ..................................................................................... 17
B. SARAN ............................................................................................. 18

ii

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Seiring

berkembangnya

ilmu

pengetahuan

banyak

ditemukan

penemuan-penemuan baru salah satunya tentang biologi molekular. Setelah

banyak penelitian diketahui bahwa setiap makhluk hidup menggunakan DNA
dan RNA untuk menyimpan dan metransfer informasi genetiknya. Sehingga
para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya materi gen ini dimanipulasi
sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat genetiknya sesuai dengan
yang kita inginkan.
Pada awal tahun tujuh puluhan, Paul Berg berhasil menyambungkan
molekul DNA secara in vitro, maka kemudian berkembang teknologi baru
dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi
DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik. Teknologi ini pada
dasarnya adalah teknik menyambungkan molekul-molekul DNA secara in vitro
sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan sesuai dengan yang diharapkan.
Teknologi ini memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat
tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi
secara konvensional.
Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka perlu diakukan
penyusunan makalah terkait dengan teknologi DNA rekombinan untuk
mengetahui lebih jelas mengenai teknologi DNA rekombinan tersebut serta
manfaat yang diperoleh dari aplikasi teknologi tersebut bagi kehidupan
manusia.

2
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah diatas, penulis merumuskan
rumusan masalah sebgai berikut.
1. Bagaimana teknik isolasi DNA ?
2. Bagaimana isolasi mRNA dan pembuatan cDNA ?
3. Bagaimana pembuatan gen sintetik ?
4. Bagaimana amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR ?
5. Bagaimana pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi ?
6. Bagaimana penyambungan DNA (ligasi DNA) ?

C. Tujuan Makalah
Sejalan dengan rumusan masalah di atas, makalah ini disusun dengan
tujuan untuk mengetahui :
1. Teknik isolasi DNA;
2. isolasi mRNA dan pembuatan cDNA;
3. pembuatan gen sintetik;
4. amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR;
5. pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi; dan
6. penyambungan DNA (ligasi DNA).

D. Kegunaan Makalah
Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik seara
teoritis maupun secara praktis. Secara teoritis makalah ini berguna sebagai
pengembangan konsep teknologi DNA rekombinan. Secara praktis makalah ini
bermanfaat bagi :
1.

penulis, sebagai wahana penambah pengetahuan dan konsep teknologi

DNA rekombinan;

2.

pembaca, sebagai media informasi tentang manfaat teknologi DNA

rekombinan.

3
E. Prosedur Makalah
Makalah ini disusun dengan menggunakan pendekatan kualitatif.
Metode yang digunakan adalah metode deskriptif. Melalui metode ini penulis
akan menguraikan permasalahan yang dibahas secara jelas dan konprehensif.
Data teoritis dalam makalah ini dikumpulkan dengan menggunakan teknik
studi pustaka, artinya penulis mengambil data melalui kegiatan membaca
berbagai literatur yang relewan dengan tema makalh. Data tersebut diolah
dengan teknik analisis isi melalui kegiatan mengeksposisikan data serta
mengaplikasikan data tersebut dalam konteks tema makalah.

BAB II
PEMBAHASAN

Sejak keberhasilan penyambungan molekul DNA secara in vitro

pertama kali oleh Paul berg pada awal tahun 70-an, maka kemudian
berkembang teknologi baru dalam pengubahan sifat-sifat genetik suatu jasad
yang dikenal dengan Teknologi DNA rekombinan, atau secara umum disebut
sebagai rekayasa genetik. Teknologi ini pada dasarnya adalah teknik untuk
menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro sehingga diperoleh
molekul DNA rekombinan sesuai yang diharapkan dalam pemuliaan jasa
secara konvensional, sebenarnya terjadi proses rekombinasi genetik tetapi
prosesnya tidak diatur secara khusus. Dalam pemuliaan tanaman secara
konvensional, rekombinasi genetik berlangsung secara in vivo.
Untuk melakukan rekombinasi DNA secara in vitro, maka perlu
dilakukan beberapa tahapan dasar yaitu :
a. Isolasi molekul DNA yang akan digabungkan
b. Pemotongan DNA dengan enzim endoklease restriksi
c. Penyambungan molekul DNA dengan enzim ligase ke dalam molekul
DNA vektor
d. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinan hasil ligasi
e. Analisis dan konformasi keberadaan DNA rekombinan dalam sel inang
f. Karakterisasi fungsional gen yang diklon.
A. Teknik Isolasi DNA
Untuk menyisipkan suatu gen tertentu ke dalam sel jasad target, maka
terlebih dahulu harus dilalukan isolasi gen DNA yang mencangkupi gen yang
dimaksud. Sumber gen yang akan disisipkan tersebut biasanya berasa dari
DNA gemon jasad hidup yang bersangkutan. Untuk mengisolasi secara
sepesifik DNA yang mencangkup gen tertentu , dapat dilakukan teknik, yaitu :
1. Isolasi DNA gemon dan dilanjutkan dengan pemotongan DNA gemon
menggunakan enzim endonuklease restriksi,

5
2. Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil traskripsi gen yang dimaksud
kemudian

dilanjutkan

dengan

membuat

turunan

(complementary

DNA/cDNA),
3. Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen sintetik)
dengan teknik sintesis nkimiawi,
4. Melakukan amplifikasi DNA dengan teknik PCR (Polymerase Chain
Reation).
DNA gemin dapat diisolasi dengan berbagai macam teknik.pada
prinsipnya, sel harus dipecah dahulu menggunakan beberapa agensia baik
secara fisik maupun kimiawi, termasuk pengguanaan enzim tertentu.
Pemecahan sel secara fisik dapat dilakukan misalnya dengan menggunakan alat
sonikator, yaitu suatu alat yang menghasilkan suara dengan frekuensi yang
ultra tinggi (ultra sound). ketika alat dihidupkan, maka akan dihasilkan suara
dengan frekuensi ultra tinggi sehingga dapat memecah sel.
Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim
lisozim yang dapat memecah dinding sel.senyawa lain yang sering digunakan
untuk memecah sel untuk isolasi DNA gemon adalah CTAB (Cetyl Treimethyl
Ammonium Bromide).
Setelah sel dipecah selanjutnya dilakukan iolasi dan pemurnian DNA.
Beberapa diantaranya menggunakan kit yang terdiri atas mengikat molekul
lainya yang ada didalam sel.
Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom
kemudian dipiotong dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi .
Enzim endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat memotong
molekul DNA pada bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu
akan menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong
oleh enzim.
Fragmen-fragmen DNA tersebut selanjutnya disambung dengan suatu
DNA vektor sehingga menghasilkan molekul DNA rekombinan.

6
B. Isolasi mRNA dan Pembuatan cDNA
Gen yang mengkode suatu protein juga dapat diisolasi dengan cara
mengisolasi mRNA hasil traskripsi gen tersebut,selanjutnya mRNA diubah
menjadi turunan DNA (cDNA).
Pembuatan cDNA memungkinkan dilakukianya kloning dengan
ekspensi gen eukaryot yang memiliki intron yang tidak akan diekspresikan
dalam bentuk ututan asam-asam amino suatu protein. Dalam proses traskrpsi
dihasilkan molekul mRNA matang yang akan ditranslasi.
Hal ini menyebabkan perubahan pada hasil traslasi karena sekuen intron
masih terikut pada mRNA sehingga ikut ditraslasi. Hasilnya adalah suatu
protein yang mengandung urutan asam amino yang beberapa protein alami
yang dihasilkan oleh sel eukariyot. Dengan mengisolasi mRNA yang suadah
matang dari sel eukariyot, maka sekuen intron sudah dihilangkan dalam proses
traskripsi. Setelah mRNA diisolasi, selanjutnya diubah menjadi cDNA dengan
buatan enzim traskriptase balik.

C. Pembuatan Gen Sintetik

Suatu gen yang tersusun atas rangkaian nukleotida juga dapat diperoleh
denga melakukan sintesis kimia sehingga diperoleh gen sintetik. Sekarang telah
banyak metode sintesis nukleotida, baik secara otomatis maupun semiotomatis. Meskipun demikian, gen-gen dengan ukuran besar tidak selalu
mudah disintesis sehingga seringkali harus dilakukan sintesis secara bertahap.
Hasil sintesis gen tersebut selanjutnya harus dicek kembali urutan
nukleotidanya dengan teknik penentuan urutan DNA (DNA sequencing).
Dengan metode sintesis kimiawi maka dimungkinkan untuk membuat suatu
gen yang sama sekali baru yang tidak pernah ada di alam. Meskipun
demikian, belum tentu gen baru tersebut dapat diekspresikan menjadi suatu
rangkaian asam amino suatu protein yang fungsional.
Sintesis gen buatan merupakan suatu metode dalam biologi sintetis
yang digunakan untuk membuat gen buatan di laboratorium. Saat ini
berdasarkan sintesis DNA fase padat, berbeda dari molekul kloning dan

7
polymerase chain reaction (PCR) dalam bahwa pengguna tidak harus dimulai
dengan urutan DNA yang sudah ada sebelumnya. Oleh karena itu, adalah
mungkin untuk membuat molekul DNA beruntai ganda benar-benar sintetis
tanpa batas jelas di kedua urutan nukleotida atau ukuran. Metode ini telah
digunakan

untuk

menghasilkan

kromosom

bakteri

fungsional

yang

mengandung sekitar satu juta pasangan basa.

Sintesis gen telah menjadi alat penting dalam berbagai bidang teknologi
DNA rekombinan termasuk ekspresi heterolog gen, pengembangan vaksin,
terapi gen dan rekayasa molekuler. Sintesis sekuens asam nukleat sering lebih
ekonomis daripada kloning dan mutagenesis prosedur klasik.
Membuat Humulin dengan memasukkan gen insulin ke dalam vektor
yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli,.
Proses membuat vaksin dengan Bioteknologi dimulai dengan
mengisolasi virus penyakitnya terlebih dahulu. Proses berlanjut sequence dan
kemudian menghasilkan bibit vaksin.
Terapi gen adalah proses DNA rekombinan di mana sel-sel yang
diambil dari pasien, diubah dengan menambahkan gen, dan diganti pada
pasien. Gen-gen kemudian memberikan kode genetik untuk protein pasien
kurang. Sel nonreproductive digunakan dalam terapi gen, sehingga tidak ada
sisa-sisa gen disisipkan ke generasi berikutnya.
D. Amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR
Metode ini ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985. Metode
PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA,
akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan untuk melipatgandakan
molekul mRNA. Kemajuan teknologi telah memungkinkan para ilmuan untuk
meniru urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan amplifikasi DNA
dengan teknis reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, atau
PCR). Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan
menggunakan :

8
1. Enzim DNA polimerase,
2. dNTP (dinukleatida triphosphat),
3. oligonukleatida primer,
4. Molekul DNA cetakan (DNA template)
Enzime DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi
polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. Dalam teknik PCR, biasanya
digunakan enzim DNA polimerase yang berasal dari bakteri termotoleran yang
berasal dari laut, yaitu Thermus aquaticus, sehingga enzimnya disebut Taq
DNA polymerase. Enzim ini mempunyai kelebihan dibanding dengan enzim
Dna polimerase yang lain karena ketahanannya terhadap suhu sangat tinggi
mencapai suhu 95 - 100C. Selain itu enzim DNA polimerase yang termostabil
lainnya diisolasi dari bakteri yang hidup pada turbin kapal selam yang disebut
dengan Vent DNA polymerase. Suhu setinggi ini diperlukan sebab untuk dapat
menyalin urutan basa DNA cetakan dalam metode PCR, maka DNA cetakan
harus didenaturasi (dipisahkan ikatan antar untaiannya) dengan perlakuan
panas. Sekarang telah banyak enzim DNA polimerase termotoleran lain yang
dikembangkan untuk PCR, misalnya Tth DNA polymerase, dan Pwo DNA
polymerase. Aktifitas enzim DNA polimerase ini mengkatalisis polimerase
DNA berlangsung dari ujung 5 ke ujung 3.
Molekul dNTP (yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP) diperlukan untuk
teknik PCR sebagai bahan dasar untuk membuat untaian DNA karena molekul
DNA disusun oleh keempat nukleotida tersebut. Biasanya konsentrasi masingmasing-masing dNTP adalah 200 M, pada pH 7,0. Bila konsentrasi terlalu
tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan DNA polimerase.
Sedangkan bila konsentrasi terlalu rendah dapat mempengaruhi ketepatan dan
ketelitian hasil amplifikasi DNA.
Oligonukleotida primer adalah molekul nukleotida berukuran pendek
(sekitar 10 30 basa nukleotida) yang diperlukan dalam mengawali proses
sintesis DNA. Perlu diketahui bahwa proses sintesis DNA, baik secara in vivo
(di dalam sel) maupun secara in vitro (di luar sel) memerlukan molekul primer.
Urutan basa nukleotida pada primer ditentukan agar menempel (komplementer)

9
pada bagian molekul DNA cetakan yang akan disalin atau diamplifikasi.
Molekul primer dapat dibuat dengan cara sintesis kimiawi.
Beberapa hal penting yang harus diperhatikan pada perancangan primer
oligonukleotida antara lain adalah :
1. Harus dihindari susunan tiga basa berturut-turut terdiri dari G atau C pada
ujung primer, misalnya CCG, CCC, GCG, GGG, dan GCC
2. Urutan basa sepasang primer tidak boleh saling komplementer, sehingga
dapat membentuk dimer, atau membentuk ikatan seperti jepitan rambut
(hairpins) dan hindari rancangan suatu primer pada daerah repetitif.
Molekul DNA cetakan adalah molekul DNA yang urutan nukleotidanya
akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel dan selanjutnya digunakan sebagai
cetakan yang akan dibaca oleh enzim DNA polimerase untuk membuat salinan
urutan nukleotida.
Pemilihan sekuen DNA target perlu diperhatikan kestabilannya genetik,
terutama untuk tujuan identifikasi. Sebagai contoh, misalnya gen virulensi
suatu bakteri biasanya merupakan elemen genetik yang tidak stabil, sehingga
biasanya akan hilang pada saat isolasi dan pemindahan kultur bakteri secara
serial. Oleh sebab itu, untuk mengamplifikasi gen semacam ini harus dilakukan
segera setelah proses isolasi DNA.
PCR dilakukan dengan mencampurkan empat komponen tersebut dalam
tabung Eppendorf kemudian dimasukan ke dalam alat thermocycler. Volume
total campuran reaksi diperlukan biasanya berkisar antara 25 100 l.
Thermocycler adalah alat yang dapat diatur untuk membuat suatu siklus
perubahan suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi DNA. Mesin PCR
dilengkapi dengan program komputer yang mengatur secara otomatis pada
setiap siklus.

10
Thermocycler

Tabung

Pertama kali suatu alat diatur sehingga mencapai 95 - 100C selama

beberapa menit (biasanya sekitar 5 menit). Pada saat ini, molekul DNA cetakan
mengalami denaturasi sehingga dua untaiannya terpisah. Pemisahan untaian ini
diperlukan agar oligonukleat primer dapat menempel, karena primer tidak akan
dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam bentuk untaian ganda
(double stranded).
Setelah beberapa menit pada suhu denaturasi, suhu alat diturunkan
sehingga mencapai suhu yang sesuai untuk penempelan primer (primer
annealing) pada DNA cetakan. Biasanya suhu diperlukan sekitar 50 - 60C,
tetapi suhu yang tetap harus ditentukan secara empiris tergantung pada basa
nukleotida primer yang digunakan. Pada suhu yang tepat, molekul primer akan
menempel pada daerah DNA yang komplementer. Sebagai contoh, jika urutan
nukleotida primer adalah GATCTTCG, maka primer tersebut akan menempel
pada daerah DNA cetakan yang mempunyai urutan CTAGAAGC. Molekul
primer yang menempel tersebut berfungsi sebagai molekul awal dalam proses
polimerisasi DNA. Nukleotida-nukleotida baru akan ditempelkan di ujung
primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida pada DNA cetakan.
Proses penempelan primer biasanya memerlukan waktu beberapa menit
(sekitar 2-3 menit), selanjutnya suhu alat dinaikan ke suhu yang optimum
untuk aktivitas polimerisasi DNA oleh DNA polimerase. Jika digunakan Taq
DNA polymerase, maka biasanya suhu dinaikan menjadi 72C. Pada suhu
inilah terjadi proses polimerisasi (sintesis) DNA baru dengan adanya aktivitas

11
DNA polimerase, dNTP, primer, dan DNA cetakan. Proses polimerisasi
biasanya berlangsung selama 2-5 menit.
Setelah proses polimerisasi, kemudian dilakukan lagi siklus seperti
semula, yaitu dengan menaikan suhu menjadi 95-100C (denaturasi), kemudian
diturunkan menjadi 50-60C (penempelan primer), dan kemudian dinaikan lagi
menjadi 72C (polimerisasi). Siklus perubahan suhu semacam ini dilakukan
berulang-ulang sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi
sintesis DNA secara berulang-ulang sehingga diperoleh molekul DNA baru
dengan jumlah yang jauh berlipat ganda dibanding dengan molekul DNA
cetakannya. Inilah yang disebut sebagai proses reaksi berantai polimerase atau
PCR. Dengan teknik ini dimungkinkan mengamplifikasi suatu fragmen DNA
dengan cepat dan dalam jumlah banyak. Selain itu, amplifikasi juga dapat
diarahkan hanya pada bagian-bagian tertentu suatu gen sehingga dapat
dikembangkan untuk tujuan rakayasa struktur suatu gen atau suatu protein.
Skema dasar proses PCR.

Skema PCR
Sejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi
molekular dan bioteknologi semakin pesat. Beberapa contoh penerapan PCR
antara lain:
analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari
atau jaringan

12
deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV
pengujian kualitas air minum
identifikasi jenis kelamin

E. Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi

Molekul DNA dapat dipotong pada suat urutan nukleoptida tertentu
dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi atau secara singkat disebut
enzim restriksi. Saat ini telah berhasil diisolasi ratusan macam endonuklease
restriksi,

terutama

dari

sel

jasad

prokariyot.

Enzim-enzim

tersebut

dikarakterisasi titik pengenalan (recognition site) dan titik potongnya

(restriction site) pada molekul DNA. Enzim restriksi dikelompokan menjadi 3
(tiga) tipe,
Tipe

Konfaktor

Unrutan DNA

Urutan DNA

yang dikenali

yang dipotong

Contoh

ATP, Mg++, S- 13-15 pasangan Tidak spesifik, EcoK

adenosil

basa

yang tidak

sama

metionim

mengandung

urutan

urutan

yang dikenali

DNA

neopleotida
tidak

spesifik

sepanjang

6-8

pasangan basa
II

Mg++

4-8

pasangan Sangat spesifik,

basa,

biasanya pemotongan

dengan susunan pada

simetris

EcoRI

urutan

nukleotida yang
dikenali

II

ATP, Mg++, (S- 5-6

adenosil

basa,

pasangan Sangat spesifik,

tidak tetapi

metionim dapat tersusun secara pemotongan

EcoPI

13
menstimulasi

simetris

aktivitas)

terjadi

pada

daerah

yang

bukan

tempat

pengenalan
yaitu ke arah
ujung 3 dan
titik pengenalan

Dalam teknologi DNA rekombinan, enzim restriksi yang paling

sesering digunakan tipe II karena urutan nukleotida yang dikenali dan dipotong
oleh enzim tersebut adalah sama sehingga memudahkan strategi kloningnya. Di
antara enzim rektriksi tipe II tersebut, pola pemotonganya pun berbeda. Banyak
enzim rektriksi yang menghasilkan ujung DNA kohesif (ujung lekat/ sticky
end, atau ujung runcing), tetapi ada juga yang menghasilkan ujung tumpul.
Sebagai contoh, enzim EcoRI mengenali dan memotong urutan nukeleotida 5GAATTC-3 yang besifat palindromik, artinya kalau urutan tadi dibaca dari
urutan untaian komplementernya maka hasilnya tetap sama (pembacaan searah
dengan anak panah).
5-GAATTC-3
3-CTTAAG-5
Jika urutan semacam ini dipotomg oleh enzim EcoRI maka hasilnya
adalah sebagai berikut :
5-GAATTC-3
3-CTTAAG-5

Anak panah menggambarkan letak pemotongan oleh enzim EcoRI

sehingga dihasilkan potongan dengan ujung kohesif:

14
5-G

5-AATTC-3

3-CTTAA-5

G-5

Ujung kohesif artinya ujung-ujung yang akan dengan mudah

membentuk ikatan komplementer lagi seperti semula jika kedua potongan
DNA tersebut disambung lagi dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA
ligase merupakan enzim yang dapat menyambung potongan DNA.
Ada juga enzim rektriksi yang hasil potongannya membentuk ujung
tumpul (blunt end), misalnya enzim PvuII. Enzim ini mengenali dan memotong
DNA pada urutan CAGCTG dengan hasil sebagai berikut :
5-CAGCTG-3

5-CAG-3

5-CTG-3

3-GTCGAC-5

3-GTC-5

3-GAC-5

Ujung-ujung tumpul semacam ini lebih sukar disambung lagi oleh

enzim DNA ligase, jika dibandingkan dengan penyambungan ujung-ujung
kohesif
Jika dua macam DNA yang berbeda asalnya tetapi mempunyai daerah
pengenalan oleh enzim yang sama dan kemudian dipotong dengan enzim
rektrisi yang sama, maka kedua molekul DNA tersebut akan mempunyai
ujung-ujung yang komplementer. Dengan menggunakan enzim DNA ligase
kedua potonngan DNA yang komplementer tersebut dapat disambung
membentuk molekul DNA rekombinan.

F. Penyambungan DNA (ligasi DNA)

Molekul-molekul DNA yang mempunyai ujung hasil pemotongan oleh
enzim restriksi yang sama dengan mudah disambung (diligasi) dengan
menggunakan enzim DNA ligase. Enzim yang sering digunakan untuk
menyambung DNA adalah enzim yang sering digunakan untuk menyambung
DNA adalah enzim yang gennya berasal dari genom virus (bakteriofag) T4
sehingga disebut T4 DNA ligase. Enzim T4 DNA ligase mampu menyambung
DNA dengan ujung kohesif maupun tumpul. Hal in berbeda dari enzim DNA
ligase yang gennya merupakan bagian genom bakteri Escherchia coli karena
enzim karena enzim ligase E. Coli tersebut hanya mampu menyambung ujung

15
DNA yang kohesif. Selain itu, T4 DNA ligase juga mampu menyambung
molekul RNA dengan DNA, sedangkan enzim dari E.coli tidak mampu
melakukan hal semacam ini. Oleh karena itu enzim T4 ligase sering digunakan
dalam kloning DNA
Dibandingkan

dengan

penyambungan

ujung-ujung

kohesif,

penyambungan ujung-ujung DNA yang tumpul memerlukan lebih banyak

molekul DNA dan enzim DNA ligase. Ligasi DNA dilakukan dengan
mencampur dua macam molekul DNA yang akan disambung dengan enzim
DNA ligase, kemudian diinkubasikan pada suhu 12-15oC selama semalam.
Akan tetapi sekarang telah banyak kit yang dikembangkan untuk ligasi DNA
secara cepat, bahkan dengan jangka waktu hanya beberapa menit. Kit ligasi
DNA tertentu bahkan dapat digunakan untuk ligasi DNA pada suhu kamar
Dalam keadaan tertentu molekul DNA yang akan diligasi mempunyai
ujung-ujung yang tidak sama karena merupakan hasil pemotongan oleh enzim
rektriksi yang berbeda. Untuk menyambung molekul-molekul yang berbeda
ujungnya tersebut dapat dikerjakan dengan melakukan beberapa macam
modifikasi, yaitu
1.

Penambahan adaptor atau penyambungan (linier)

2.

Pembentukan ekor homopolimer pada ujung DNA

3.

Pengisian ujung-ujung DNA kohesif

4.

Penghilangan ujung DNA kohesif

Adaptor ialah suatu molekul oligonlukleotida sintetik yang urutan

nukleotidanya dirancang sedemikian rupa sehingga masing-masing ujung DNA
yang akan disambung, Sebagai contoh, adasuatu adaptor yang dapat digunakan
untuk menyambung ujung-ujung DNA yang dipotong oleh enzim EcoRI dan
BamHI. Linker adalah molekul oligonukleotida suntetik yang dapat mengalami
penyambungan sendiri (self-ligation) membentuk molekul untai ganda
berujung tumpul tetapi mempunyai urutan nukleoptida yang dikenal oleh
enzim rektriksi tertentu. Linker tersebut kemudian diphosphorilasi dengan
enzim polinukleotida kinase. Selanjutnya linier tersebut disambung dengan

16
DNA berujung tumpul dengan metode penyambungan ujung tumpul (blunt end
ligation) skema adaptor dan linier.
Ekor homopolimer adalah molekul deoksitibonukleotida yang terdiri
atas satu macam nukleotida dan ditambahkan pada ujung 3 suatu molekul
DNA untai tunggal atau ganda sehingga DNA tersebut dapat membentuk
rekombinan dengan DNA lain yang mempunyai ekor homoplimer yang
komplementer. Enzim ini dapat menambahkan ekor homopolimer sepanjang 50
sampai 150 nukleotida da atau dT, dan sekitar 20 dG atau dC. Skema
penambahan ekor homopolimer
Pengisian ujung kohesif dilakukan dengan menggunakan aktivitas
enzim DNA polimerase untuk mengisi ujung 3 DNA hasil pemotongan oleh
enzim restriksi. Enzim yang sering digunakan untuk keperluan ini adalah DNA
polimerase I dari E.coli yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease 5 3
sehingga hanya mempunyai aktivitas polimerase 5 3 dan endonuklease 3
5. Fragmen DNA polimerase I semacam ini disebut fragmen klenow yang
dapat diperoleh dengan memotong DNA polimerase I yang lengkap dengan
enzim subtilisin. Dengan adanya dNTP dan ion Mg++ , enzim Klenow akan
menyintesis untaian DNA yang komplementer dengan ujung 5 yang menonjol
dengan menggunakan ujung 3 sebagai primer. Selain dengan cara semacam
ini, ujung 5 atau 3 yang menonjol dapat dihilangkan dengan menggunakan
aktivitas eksonukleolitik 3 5 fragmen Klenow, atau dengan menggunakan
enzim T4 DNA polimerase.
Jika ujung-ujung DNA yang akan diligasi sudah dimodifikasi dengan
salah satu cara diatas maka selanjutnya dapat dilakukan ligasi, baik dengan
menggunakan teknik ligasi DNA tumpul atau dengan memotong terlebih
dahulu menggunakan enzim rektriksi, jika modifikasinya berupa penambahan
adaptor atau linker.

BAB III
PENUTUP

A. Simpulan
Teknik DNA rekombinan merupakan pengubahan sifat-sifat genetik
suatu jasad, dengan tahapan
1. Isolasi molekul DNA yang akan digabungkan
2. Pemotongan DNA dengan enzim endoklease restriksi
3. Penyambungan molekul DNA dengan enzim ligase ke dalam molekul DNA
vektor
4. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinan hasil ligasi
5. Analisis dan konformasi keberadaan DNA rekombinan dalam sel inang
6. Karakterisasi fungsional gen yang diklon.
Sintesis gen buatan merupakan suatu metode dalam biologi sintetis
yang digunakan untuk membuat gen buatan di laboratorium.
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah perbanyakan (amplifikasi)
DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan menggunakan Enzim
DNA polimerase, dNTP (dinukleatida triphosphat), oligonukleatida primer,
Molekul DNA cetakan (DNA template).

B. Saran
Teknologi

DNA rekombinan

digunakan secara bijaksana dan

bermanfaat. Kita selaku mahasiswa biologi harus mengetahui mengenai

bioteknologi terbaru sebagai penyesuaian terhadap perkembangan zaman.
Karena ilmu pengetahuan akan senantiasa berkembang.

17

DAFTAR PUSTAKA

Radji, Maksum. (2011). Rekayasa Genetika. Jakarta : Sagung Seto.

Yuwono, Triwibowo. (2012). Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gajah Mada
University Press.

18