Hiperglikemia mengeksarserbasi keganasan kanker kolon melalui

jalur biosintetik hexosamine

Abstrak

Hiperglikemia adalah ciri--ciri umum diabetes mellitus, yang dianggap sebagai

faktor risiko kanker. Namun, efek langsungnya terhadap perilaku sel kanker relatif
belum diteliti lebih jauh. Di sini kita menunjukkan bahwa konsentrasi glukosa
yang tinggi menginduksi glikosilasi yang menyimpang, peningkatan proliferasi
sel, invasi dan perkembangan tumor pada kanker usus besar. Dengan memodulasi
aktivitas enzim rate-limiting, glutamin-fruktosa-6 fosfat amidotransferase (GFAT),
kami menunjukkan bahwa jalur biosintesis heksosamin (HBP) terlibat dalam
proses tersebut. Biopsi dari pasien dengan kolon karsinoma menunjukkan
peningkatan kadar GFAT dan akibat dari ekspresi glikogen menyimpang
menunjukkan peningkatan aliran HBP pada kanker usus manusia. Secara
keseluruhan, hasil kami membuka kemungkinan bahwa HBP menghubungkan
hiperglikemia, glikosilasi yang menyimpang dan keganasan tumor, dan
menyarankan jalur ini sebagai target terapeutik potensial untuk kanker kolorektal.

PENGANTAR

Kanker kolorektal (CRC) adalah kanker ketiga yang paling umum dan penyebab
utama kedua kematian akibat kanker di Amerika Serikat. Bukti epidemiologis
menunjukkan bahwa individu dengan diabetes mellitus (DM) memiliki risiko
lebih tinggi untuk mengembangkan beberapa jenis kanker. Selanjutnya, DM
berkorelasi erat dengan kejadian dan mortalitas CRC.

Hiperglikemia adalah ciri-ciri DM yang paling penting, ciri khas DM1 dan DM2.
Kelebihan glukosa mendukung sel kanker untuk meningkatkan kebutuhan
energetik dan biosintesisnya. Telah dilaporkan bahwa glukosa tinggi (HG)
memicu beberapa mekanisme langsung dan tidak langsung yang bekerja sama
untuk mempromosikan perkembangan kanker, seperti induksi transisi epitel

1
mesenchymal (EMT), peningkatan kadar insulin/IGF-1 dan sitokin inflamasi yang
beredar, peningkatan leptin dan pensinyalan AKT/mTOR pro-survival dan
peningkatan pensinyalan WNT/-catenin. Bersama-sama, penelitian ini
mengungkapkan bahwa hiperglikemia memliki dampak yang penting pada sel
kanker.

Sebagian besar jaringan ganas telah mengalami peningkatanan uptake

fludeoksiglukosa yang terkait dengan peningkatan laju glikolisis dan transportasi
glukosa. Tingkat glikolitik tinggi ini kemungkinan menguntungkan proliferasi sel
melalui produksi zat antara glikolitik, yang memicu jalur metabolisme yang
menghasilkan biosintesis nukleotida, NADPH, lipid, asam amino dan
glikokonjugat. Terlepas dari fakta bahwa mayoritas glukosa mengalami glikolisis,
~ 2-5% glukosa dari sel memasuki jalur biosintesis heksosamin (HBP), yang
menghasilkan UDP-N-asetil-Dglucosamin (UDP-GlcNAc), dan derivatnya, UDP-
N -asetil-Dgalaktosamin (UDP-GalNAc), dan asam asetilneuraminat CMP-N
(CMP-Neu5Ac). Senyawa ini adalah substrat untuk N- dan O-glikosilasi protein
ekstraselular dan glikolipid, dan untuk proses modifikasi translasi protein
intraseluler pasca-translasi oleh O-GlcNAc transferase (OGT). UDP-GlcNAc
sangat responsif terhadap variasi nutrisi sel karena sintesisnya bergantung pada
produk metabolisme glukosa, asam amino, asam lemak dan nukleotida. Oleh
karena itu, UDP GlcNAc dapat berfungsi sebagai reporter untuk status fungsional
beberapa jalur, dan dianggap sebagai sensor metabolik yang ideal.

Enzim pembatas laju pada fluks glukosa melalui jalur heksosamin adalah
glutamin-fruktosa-6-fosfat amidotransferase (GFAT), yang mengkatalisis sintesis
glukosamin-6-fosfat dari fruktosa 6-fosfat dan glutamin. GFAT memiliki dua
isoform pada mamalia, GFAT1 dan GFAT2, yang diekspresikan dalam jaringan
yang berbeda dan mungkin memiliki fungsi yang berbeda. Studi telah
menunjukkan asosiasi GFAT yang berkembang dengan penyakit metabolik seperti
DM dan kanker. Dalam studi sebelumnya, kami menunjukkan bahwa
meningkatkan aliran metabolit melalui HBP, dengan meningkatkan konsentrasi
glukosa ekstraselular atau overekspresi GFAT2, memrpovokasi penyimpangan

2
glikolisasi dari fibronektin dan menginduksi EMT pada sel adenokarsinoma epitel
alveolar manusia (A549). Baru-baru ini, kami menunjukkan bahwa glukosa yang
didorong ke HBP selama EMT mengubah glikofenotip sel A549. Bersama-sama,
hasil kami menunjukkan bahwa glikosilasi sel merangsang perubahan glukosa
dalam lingkungan mikro dan memodulasi plastisitas sel.

Glikokonjugat memiliki peran penting dalam berbagai proses seluler termasuk

adhesi seluler, migrasi, pertumbuhan, diferensiasi, transduksi sinyal, aktivasi
reseptor, modulasi respons imun, dan merupakan target antibodi yang digunakan
dalam diagnosis dan terapi kanker. Bukti yang berkembang menunjukkan bahwa
glikosilasi yang menyimpang memberikan keuntungan adaptif pada sel selama
transformasi onkogenik pada CRC. Namun, efek langsung hiperglikemia pada
perilaku sel kanker relatif belum dieksplorasi. Hipotesis kami adalah bahwa HG
meningkatkan keganasan kanker usus besar dengan mengubah glikosilasi sel
melalui HBP. Di sini, kami menunjukkan bahwa sel adenokarsinoma usus besar
dengan HG menunjukkan glikosilasi yang menyimpang dan peningkatan
proliferasi, invasi dan pertumbuhan tumor. Selain itu, tikus hiperglikemik
menunjukkan pertumbuhan tumor dan metastasis yang memburuk. Modulasi
aktivitas GFAT menyebabkan penurunan signifikan pertumbuhan tumor, motilitas
sel dan metastasis. Selanjutnya, kami menunjukkan tingkat GFAT yang lebih
tinggi pada sampel kanker usus manusia dibandingkan dengan jaringan normal di
sekitarnya. Hasil yang ditunjukkan di sini menunjukkan peran penting HBP untuk
pengembangan tumor kanker usus besar, dan menemukan kemungkinan target
baru untuk kemoterapi kanker.

HASIL

Konsentrasi glukosa yang tinggi meningkatkan pertumbuhan dan invasi sel. Untuk
menguji efek HG terhadap perkembangan kanker, sel adenokarsinoma induk
MC38 dikultur di media yang mengandung konsentrasi glukosa rendah (LG; 5
mM) atau HG (25 mM) selama lebih dari 30 hari. Sel MC38 yang dibudidayakan
di HG (MC38-HG) menunjukkan peningkatan proliferasi bila dibandingkan

3
dengan sel yang dikultur di LG (MC38-LG) yang dianalisis dengan waktu
penggandaan populasi (PDT; Gambar 1a). Kami menemukan bahwa HG
menginduksi potensi invasif sel MC38-GFP+ pada membran transwell yang
dilapisi dengan matrigel bila dibandingkan dengan kondisi LG (Gambar 1b dan c).

Hiperglikemia mengatur pertumbuhan tumor, menjadi rumah dan metastasis in

vivo

Kami selanjutnya mengeksplorasi potensi sel MC38-LG atau MC38-HG 'untuk

menginduksi pertumbuhan tumor melalui injeksi ektopik di sisi tikus Euglikemik
C57BL/6 (EuG). Hasil menunjukkan area pertumbuhan dan berat yang lebih besar
pada tikus yang disuntik dengan sel MC38-HG bila dibandingkan dengan tikus
yang disuntik dengan sel LG (Gambar 2a dan b).

Hiperglikemia diinduksi secara in vivo dengan penghancuran Sel -pankreas

secara selektif dengan pengobatan streptozotocin (STZ) pada tikus C57BL/6.
Tikus hiperglikemik menunjukkan kadar glukosa darah tiga kali lebih besar
daripada hewan kontrol (Po0.0001) (Gambar Tambahan S1A). Sel MC38-LG
yang disuntikkan pada tikus hiperglikemik (HyG) tidak menunjukkan potensi
pertumbuhan tumor. Namun, tikus HyG yang disuntik dengan sel MC38-HG
menunjukkan pertumbuhan tumor bertambah jika dibandingkan dengan kelompok
lainnya (Gambar 2a dan b). Tumor tikus HyG (Gambar 2a dan b) terjadi lebih
awal pada 60% kasus seperti yang ditunjukkan oleh resonansi magnetik seluruh
tubuh (11 dari 18; Gambar 2c).

Menyuntikkan sel MC38-GFP+ ke dalam vena lateral ekor tikus EuG atau HyG,
kami menilai dampak hiperglikemia pada homing dan metastasis sel. Pertama,
kami mengamati peningkatan sel MC38-HG GFP+ ke dalam paru 3 hari setelah
injeksi ke tikus EuG dibandingkan dengan sel MC38-LG GFP+ (Gambar 2d).
Metastasis dianalisis 21 hari setelah injeksi sel. Gambar 2e dan f menunjukkan
gambar paru-paru dan jumlah nodul metastasis dari kelompok yang berbeda.
Selanjutnya, organ-organ tersebut dihomogenisasi dan diencerkan untuk
kuantifikasi pembacaan fluoresensi (Gambar 2g). Paru-paru tikus HyG hampir

4
dikuasai oleh nodul metastasis sel injeksi MC38-HG, dan pengukuran fluorosensi
tingkat tinggi juga telah diperoleh. Selain itu, inkubasi sel MC38 yang dikultur
dalam medium HG cukup untuk menginduksi metastasis di paru-paru tikus EuG.
Selanjutnya, penyebaran metastasis sel MC38-HG secara statistik signifikan
karena tikus EuG yang menerima sel MC38-LG menunjukkan fokus metastasis
yang lebih sedikit dan deteksi fluoresensi yang lebih rendah. Glukosa darah tinggi
berkontribusi terhadap peningkatan metastasis sel karena tikus HyG menyajikan
lebih banyak nodul daripada tikus EuG yang disuntik dengan sel MC38-LG. Hasil
ini menunjukkan bahwa HG menginduksi perubahan fenotipik pada sel MC38
yang mengatur proliferasi, homing dan metastasis sel.

Glukosa tinggi menginduksi glikolisasi yang menyimpang

Perubahan dalam glikosilasi seluler memberikan keuntungan dalam hal

pertumbuhan tumor, penyebaran tumor dan pelepasan kekebalan tubuh. Bukti
menunjukkan bahwa hiperglikemia menginduksi biosintesis glikokonjugat yang
menyimpang. Oleh karena itu, kami menyelidiki perubahan glikofenotipe sel
MC38 yang dikultur di LG atau HG dengan alur sitometri menggunakan
serangkaian protein pengikat gula (lectin, Tabel Tambahan SI) yang
mengidentifikasi perubahan pada glikosilasi permukaan sel yang terlihat selama
tumorigenesis (Gambar 3a). Pengaruh hiperglikemia terhadap biosintesis
glikokonjugat bergantung pada waktu (Gambar Tambahan S2), dan Gambar 3b
menunjukkan peningkatan yang signifikan dari N-glycans dimana -maniose (-
Man) dari inti sakarida bercabang dengan 1-6-GlcNAc, menghasilkan
triantennary-N-glycans (Phytohemagglutinin-L, PHA-L; P = 0,0615). Kami juga
mengamati peningkatan unit un-substituted -GalNAc, O-linked dengan protein
inti, yang dikenal sebagai antigen Tn (Vicia villosa Lectin, VVL; P = 0,0243).
Pengamatan ini sesuai dengan peningkatan pengikatan aglutinin kedelai pada
residu -GalNAc (P = 0,0018). Selain itu, konsentrasi HG menginduksi
hipersilisasi permukaan sel seperti yang terlihat pada peningkatan glikokonjugat
yang diterminasi dengan 2-6- and2-3-linked Neu5Ac, yang diimplikasikan
dengan pewarnaan dengan Sambucus nigra agglutinin (SNA; P = 0,0170), dan

5
Maackia amurensis agglutinin (MAA; P = 0,0170 ). Peningkatan ekspresi asam
sialik disertai dengan pengurangan kesatuan terminal-galactopyranose (-Galp)
yang direkognisi oleh Peanut agglutinin (PNA; P = 0,0324). Meskipun
peningkatan ikatan sakarida turunan dari jalur heksosamin, ekspresi auksin
glikokonjugat yang mengandung -fucose (-Fuc) yang diamati dengan
peningkatan pengikatan Aleuria aurantiaagglutinin (AAL; P = 0,0329) juga
terdeteksi (Gambar 3b). Hiperglikemia menginduksi perubahan glikofenotipik
yang sama pada garis sel karsinoma mammae 4T1 murine dari BALB/cfC3H
(Gambar Tambahan S3) yang menunjukkan bahwa efek HG pada glikosilasi tidak
bersifat-spesifik.

Gambar 1. Hiperglikemia meningkatkan proliferasi dan invasi pada sel MC38.

(A) Waktu penggandaan populasi (PDT) sel MC38 yang dikultur pada konsentrasi
glukosa tinggi (HG) atau glukosa rendah (LG).n = (3); Baris error menunjukkan
mean se.m. (B) Fotomikrografi dari membran transwell matrigel-coated (LG
dan HG) dari sel MC38-GFP. (C) Semua sel yang menyerang ke ruang bawah
dihitung setelah 24 jam inkubasi. N = 3; *** Tes Po0.0001t; skala batang, 100m.

6
Gambar 2. Hiperglikemia memperburuk perkembangan tumor secara in vivo. (A)
Area tumor dan (b) berat dari MC38-LG atau MC38-HG yang disuntikkan pada
tikus euglikemik (EuG) dan hiperglikemik (HyG).n = 9-18 per kelompok; Baris
error menunjukkan mean s.e.m ;; *Po0.05, **Po0.001, *** Po0.0001, #Po0.05,
###Po0.0001; (*) Merupakan perbandingan antara MC38-HG dan MC38-HG
(HyG) dengan MC38-LG; (#) Relatif terhadap perbandingan antara MC38-HG
dan MC38-HG (HyG). Anova dua arah, tes pos Bonferonni. (C) Magnetic
resonance seluruh tubuh tikus euglikemik (EuG) dan hiperglikemik (HyG), 5 hari
setelah injeksi sel MC38-HG subkutan. (D) Tingkat fluoresensi paru tikus
euglikemik, 3 hari setelah injeksi sel MC38-GFP LG atau MC38-GFP-HG ke
dalam vena ekor lateral. N = 3 per kelompok. (E) Gambar neon representatif paru-
paru 21 hari setelah infus sel MC38-GFP. Gambar menunjukkan kelompok yang
berbeda: Tikus yang tidak disuntik; Tikus euglyikemik (EuG) yang disuntik
dengan sel MC38-LG atau MC38-HG; Tikus hiperglikemik (Hyg) yang disuntik
dengan MC38-HG atau MC38-LG. Setelah perolehan gambar, nodul dihitung (f)
dan paru-paru dihomogenisasi dan diencerkan untuk pembacaan fluoresensi (g); N

7
= 5 per kelompok, * Po0.05; ** Po0.001; s.e.m .; ANOVA satu arah; uji
perbandingan Turkey Multipel.

Hasil menunjukkan bahwa HG meningkatkan biosintesis oligosakarida yang

membawa heksosamin, menunjukkan peningkatan fluks HBP. Karena kadar
GFAT1 atau 2 tidak meningkat pada konsentrasi HG (Gambar Tambahan S4),
kami menganalisis dampak hiperglikemia dalam biosintesis produk akhir HBP,
UDP-GlcNAc. Dengan menggunakan kromatografi cair dengan kolom grafit
berpori, kami dapat menunjukkan bahwa sel yang dikultur dalam HG secara in
vitro mensintesis lebih banyak UDP-heksosamin (UDP-GlcNAc dan UDP-
GalNAc) daripada sel MC38 yang dikultur di LG (Gambar 3c). Dengan
menggunakan high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization
Fouriertransform ion cyclotron resonance mass spectrometry imaging (MALDI-
FT-ICR MSI) pada sampel jaringan, kami mengakses dampak hiperglikemia
dalam produksi UDP-GlcNAc pada tumor subkutan dari tikus EuG dan HyG.
Matrix-assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry imaging (MALDI-
MSI) adalah teknik yang hebat, yang menggabungkan spektrometri massa dengan
histologi, memungkinkan deteksi secara spasial terselesaikan dan bebas label dari
ratusan hingga ribuan senyawa di dalam satu jaringan. Gambar 3d menunjukkan
lokalisasi untuk nilai m/z yang berbeda pada tumor subkutan dari tikus EuG dan
HyG. Dari Gambar 2c jelas bahwa [M-H]-m/z606.073 relatif terhadap UDP-
heksosamin yang sebagian besar terdapat pada jaringan dari tikus HyG.
Sebaliknya, NADPH (m/z 743.074), produk jalur pentosa fosfat, hadir di kedua
sampel, namun sangat kuat pada tumor tikus EuG. Perlu dicatat bahwa
m/z606.073 menyajikan distribusi yang serupa dengan ion m/z 202.107 yang
terkait dengan asetilkarnin, penanda daerah hipoksia tumor.

Oleh karena itu, hiperglikemia berkelanjutan meningkatkan biosintesis UDP-

GlcNAc. Sesuai dengan perubahan dalam kumpulan heksosamin yang diaktifkan,
histokimia tumor subkutan menunjukkan adanya peningkatan glikokonjugat yang
mengandung residu 2-6-linked Neu5Ac (SNA), dengan pengurangan serentak

8
ikatan PNA ke kumpulan terminal Galp (Gambar 3d). Selain itu, peningkatan
residu -Fuc (AAL) dibenarkan dengan hasil in vitro.

GFAT menentukan pertumbuhan, invasi dan glikolisasi yang menyimpang dari

tumor

Untuk mendapatkan wawasan tentang apakah efek HG terhadap perkembangan

tumor dikaitkan dengan asimilasi glukosa menjadi HBP, kami telah melakukan
pra-perlakuan sel GFP-MC38-HG dengan inhibitor farmakologis GFAT, 6-Diazo-
5-oxo-L-norleucine (DON ). Pengobatan DON menurunkan proliferasi MC38-
HG, yang diukur dengan uji PDT (Gambar 4a). DON secara signifikan
mengganggu pertumbuhan tumor pada sel yang diobati dengan MC38-HG yang
disuntikkan pada tikus EuG (Gambar 4b dan c). Selain itu, DON
mempresentasikan kecenderungan untuk menurunkan homing ke paru-paru 3 hari
setelah injeksi sel (Gambar Tambahan S5). Selain itu, pengobatan DON
mengurangi sifat invasif sel MC38 pada membran transwell yang dilapisi dengan
matrigel (Gambar 4d, panel atas). Sebagaimana DON bukan penghambat GFAT
yang spesifik, karena menghambat penghambatan lainnya, kami menguji apakah
penambahan GlcNAc dapat mengembalikan invasi sel dengan melewati
penghambatan GFAT oleh DON. Sudah diketahui dengan baik bahwa O-GlcNAc
sangat responsif terhadap HBP. Hasil kami menunjukkan dengan jelas bahwa
DON menurunkan kadar O-GlcNAc, sedangkan penambahan GlcNAc dapat
meningkatkan kadar O-GlcNAc, bahkan dengan adanya DON (Gambar 4d, panel
bawah), yang menunjukkan bahwa efek DON yang diamati pada model kami
adalah karena untuk penghambatan HBP. Seperti yang digambarkan pada Gambar
4d (panel atas), GlcNAc meningkatkan invasi sel; Selain itu, penambahan glcNAc
ke sel MC38-HG yang diobati dengan DON sebagian mengembalikan
kemampuan sel untuk menyerang, sehingga mengurangi inhibitor DON. Hasil ini
memperkuat peran GFAT dalam perkembangan tumor.

Untuk lebih memperkuat peran GFAT dalam perkembangan tumor yang

disebabkan oleh hiperglikemia, kami menilai dampak dari knockdown gen pada

9
sel MC38-HG (Gambar 5a dan b). Sesuai dengan hasil di atas dengan
menggunakan DON, penurunan regulasi tingkat protein GFAT mengurangi
pertumbuhan tumor in vivo (Gambar 5e-g), walaupun tampaknya tidak
berpengaruh pada uji proliferasi (Gambar 5c). Kapasitas invasi tinggi yang
diamati pada sel HG (Gambar 1b dan c) sangat menurun pada kelompok shGFAT
(Gambar 5d). Selain itu, analisis metastasis eksperimental menunjukkan bahwa
defisiensi GFAT secara signifikan mengurangi penyebaran sel shGFAT-MC38
secara metastasis ke paru-paru hewan HyG dibandingkan dengan sel shScramble-
MC38 (Gambar 5h). Kuantitas nodul menunjukkan bahwa sel shGFAT-MC38
menghasilkan satu atau dua pengukuran, hanya pada tingkat deteksi (Gambar 5i).
Dengan demikian, GFAT membungkam secara dramatis inhibisi metastasis tumor
agresif ini.

10
Gambar 3. Hiperglikemia menginduksi glikosilasi yang menyimpang. (A) Skema
yang mewakili spesifitas pengikatan lektin dan antibodi RL2 yang digunakan
dalam penelitian ini. (B) Arus histogram sitometri menunjukkan profil pengikat
yang representatif dari lekukan yang berbeda pada sel MC38 yang dikultur pada
konsentrasi tinggi (HG, oranye) atau glukosa rendah (LG, biru). Histogram merah

11
mengacu pada sel-sel yang ternoda dengan streptavidin FITC terkonjugasi, dan
grafik batang menunjukkan perbedaan antara intensitas fluoresensi untuk setiap
pelabelan lectin. O-GlcNAc diakses dengan imunolabel dengan antibodi RL2, dan
histogram merahnya merupakan sel-sel yang ternoda dengan Fluorosensi Alexa
488-terkonjugasi antibodi. Hasilnya mewakili empat replika eksperimental. (N =
4); Tidak berpasangan (C) Kromatogram metabolit polar ekstrak sel dari sel
MC38-LG (garis abu-abu) dan sel MC38-HG (garis putus-putus hitam),
menunjukkan daerah yang sesuai dengan waktu retensi UDP-HexNAc dan pNP.
Kanan, kuantifikasi UDP-HexNAc sel MC38-LG (abu-abu) dan MC38-HG
(hitam). Analisis kuantitatif ditunjukkan sebagai mean s.d. Dari dua percobaan
independen. (D) Perbandingan lokalisasi m/z pada tumor subkutan dari tikus
euglikemik dan hiperglikemik. Analisis MALDI-MSI yang menunjukkan
distribusi m/z606.073 (UDP-hexosamine), m/z202.10 (asetilkarnin) dan
m/z743.074 (NADPH) dan panel kanan diberi H&E. (E) Lectin mengikat jaringan
tumor tikus hiperglikemik versus euglikemik. Fotomikrografi mewakili jaringan
tumor subkutan dari tikus hiperglikemik (HyG) versus euglikemik (EuG) yang
dianalisis 28 hari setelah implantasi MC38. Bilah skala, 100m. (N = 3).

12
Gambar 4. Penghambatan farmakologis GFAT menurunkan pertumbuhan tumor
dan invasi. (A) Analisis proliferasi sel MC38-HG yang dibiakkan dengan tanpa
adanya (Ctrl) atau adanya 1MDON (DON). (N = 3); Baris error menunjukkan
mean s.e.m; t-test. (B) Area tumor dan (c) berat sel MC38-HG yang tidak
diobati, atau diobati, dengan 1MDON (MC38-HG+DON) dan disuntikkan pada
tikus-tikus euglikemik. MC38-HG (n = 12); MC38-HG+DON (n = 7). (D) Panel
bawah. Analisis blot Western lisat dari sel MC38-LG yang diobati dengan
Mannitol (kontrol osmotik), GlcNAc, DON dan DON + GlcNAc menganalisis
kadar Gl-NA dan ekspresi -actin. Panel atas. Invasi sel MC38-LG yang diobati
dengan Mannitol (kontrol osmotik, 40 mM), GlcNAc (40 mM), DON (1M) dan
DON+GlcNAc dengan analisis transwell 24 jam inkubasi; N = 3, s.e.m .;

13
ANOVA satu arah, beberapa uji perbandingan Bonferroni * Po0.05; ** Po0.001;
*** Po0.001.

Gambar 5. Efek delesi GFAT pada perkembangan tumor. (a, b) Ekspresi protein
GFAT pada sel shGFAT-MC38. (N = 4). (c) Analisis penggandaan populasi (PDT)
populasi sel Orluk MC38-HG acak yang terkait dengan sel shGFAT MC38-HG.
(d) The Matrigel coated chamber transwell invasion assay daripada sel shGFAT
MC38-HG dibandingkan dengan sel MC38-HG scrambled. (e) Area tumor, (f)
gambar representatif dan (g) berat tikus euglikemik (EuG) yang disuntikkan
secara subkutan dengan sel MCGH38-HG shGFAT atau sel MC38-HG teracak (n
= 6-8). (h) Gambar representatif dan (i) kuantifikasi nodul metastasis paru pada
tikus hiperglikemik (HyG) yang disuntik dengan sel shGFAT MC38-HG atau sel
MC38-HG scrambled (n = 5). Hasil dinyatakan sebagai mean s.e.m .; Two-
tailed, unpaired t-test dan Anova dua arah; Tes pasca Bonferonni. * Po0.05, ***
Po0.001.

Gambar 6 menunjukkan bahwa penurunan regulasi GFAT secara signifikan

menurunkan ekspresi triantennaryN-glycans bercabang dengan 1-6GlcNAc
seperti yang terlihat pada penurunan ikatan L-PHA (P = 0,0218). Demikian juga,
penurunan ekspresi GFAT menyebabkan penurunan biosintesis antigen Tn
(pengikatan VVL). Penurunan ikatan SNA (P = 0,0252) dengan peningkatan yang
terkait dari unit-unit termina l-Galp yang dikenali oleh PNA (P = 0,0397) dan
ECA (P = 0,0065) pada penurunan regulasi GFAT adalah konsisten dengan
partisipasi HBP dalam dekorasi glycan oleh 2- 6-linked Neu5Ac. Sudah
diketahui bahwa O-GlcNAcylation sangat responsif terhadap HBP. Di sini, kami
menganalisis O-GlcNAcylation oleh flow sitometri menggunakan antibodi RL2
setelah permeabilisasi membran sel. Seperti yang diharapkan, kadar O-GlcNAc
secara signifikan menurun pada sel shGFAT1.

GFAT diekspresikan secara berlebihan pada kanker usus besar manusia.

Data kami menyarankan peran penting HBP dalam kanker usus tikus dan
memotivasi kami untuk menyelidiki apakah jalur ini diubah pada kanker usus

14
besar manusia. Dengan arah ini, kami menganalisis mRNA GFAT dan kadar
protein dari adenokarsinoma (T) dan jaringan normal yang berdekatan (N) pada
pasien kanker usus besar. Data kami menunjukkan peningkatan yang signifikan
dari mRNA GFAT2 (Gambar 7e dan f). Analisis blot Barat mengungkapkan
bahwa ekspresi protein untuk GFAT1 (Gambar 7a dan b), GFAT2 (Gambar 7a dan
c) dan O-GlcNAcylation (Gambar 7a dan d) juga meningkat secara luar biasa
dalam jaringan tumor bila dibandingkan dengan jaringan normal yang berdekatan.
Selain itu, analisis dot blot menunjukkan peningkatan sialilasi (berhubungan
dengan peningkatan kanker) (Gambar 7g dan h). Data ini menunjukkan
peningkatan produk HBP pada jaringan tumor.

DISKUSI

Telah diketahui secara luas bahwa glikolisasi menyimpang terlibat dalam banyak
jenis kanker termasuk CRC. Perubahan dalam glikosilasi permukaan sel secara
langsung mempengaruhi pertumbuhan sel, kelangsungan hidup dan meningkatkan
perilaku invasif sel tumor yang, pada akhirnya, menyebabkan metastasis dan
perkembangan kanker. Di sini kami menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi
glukosa ekstraseluler menyebabkan glikosilasi menyimpang, peningkatan
proliferasi dan invasi sel, yang menghadirkan peran penting dalam perkembangan
tumor. Dengan meregulasi GFAT, kami menunjukkan bahwa HBP terlibat dalam
proses tersebut. Tikus hiperglikemik menunjukkan perkembangan tumor subkutan
yang dipercepat yang menunjukkan glikokonjonju yang menyimpang.
Selanjutnya, model metastasis eksperimental juga menyajikan profil yang lebih
agresif pada tikus hiperglikemik. Secara keseluruhan, hasil kami memungkinkan
kita untuk menyimpulkan bahwa peningkatan kadar glukosa menginduksi
biosintesis glikokonjugat yang menyimpang, dan meningkatkan progresi tumor
sel karsinoma kolon tikus MC38 melalui HPB karena penurunan regulasi GFAT
menurunkan glikosilasi yang menyimpang dan keganasan sel. Sesuai dengan data
percobaan, biopsi dari pasien dengan kolon karsinoma mengekspresikan lebih
banyak GFAT dan glikol yang menyimpang, bila dibandingkan dengan jaringan

15
normal yang berdekatan. Data ini menunjukkan peningkatan aliran HBP pada
kanker usus manusia.

Baru-baru ini, hiperglikemia telah dianggap sebagai faktor risiko yang

menghubungkan DM dengan perkembangan kanker. Efek hiperglikemia telah
banyak ditunjukkan pada proliferasi dan metastasis sel. Di antara laporan tersebut,
sebuah studi epidemiologi menunjukkan bahwa, pada pasien kanker DM2 atau
hiperglikemia, proporsi kekambuhan tumor, metastasis, atau hasil fatal lebih
tinggi daripada pada pasien tanpa penyakit metabolik. Studi epidemiologi juga
mendukung peran antineoplastik untuk metformin, obat anti-hiperglikemik,
mengenai risiko kanker. Metformin menghambat proliferasi sel kanker secara in
vitro dan menekan pertumbuhan karsinoma kolon in vivo. Selanjutnya,
pengobatan Metformin secara signifikan dapat menurunkan risiko CRC pada
pasien DM2. Laporan ini sesuai dengan temuan kami yang menunjukkan bahwa
hiperglikemia menginduksi pertumbuhan tumor, invasi sel dan metastasis.

Meskipun mekanisme yang mendasari hiperglikemia dan asosiasi kanker belum

dijelaskan, pembengkakan, stres oksidatif dan imunosupresi berpotensi terlibat
dalam perkembangan tumor dengan berbagai cara. Data kami menunjukkan
bahwa inkubasi sel MC38 yang dikultur dalam medium HG cukup untuk
menginduksi pertumbuhan tumor subkutan, homing dan metastasis ke paru-paru
tikus EuG menyingkirkan efek hiperglikemia pada inflamasi host dan sistem
kekebalan tubuh. Selain itu, hasil ini meningkatkan hipotesis bahwa hiperglikemia
mencantumkan memori pada sel MC38 (lihat Diskusi di bawah).

Efek kadar glukosa yang tinggi mungkin disebabkan oleh peningkatan transporter
glukosa (GLUT), meningkatkan penyerapan glukosa. Memang, sel tumor
memiliki uptake HG melalui peningkatan ekspresi transporter GLUT. Dengan
demikian, sel kanker mungkin mendapat manfaat dari konsentrasi HG. Begitu
berada di dalam sel, glukosa terfosforilasi oleh heksokinase yang membentuk
glukosa-6-fosfat yang dapat dilipat ke dalam jalur pentosa fosfat oleh glukosa-6
fosfat dehidrogenase atau menjalani isomerisasi enzimatik, membentuk fruktosa-

16
6-fosfat. Meskipun sebagian besar glukosa mengalami glikolisis, 2-5% glukosa
total di dalam sel memasuki HBP, menghasilkan UDP GlcNAc, dan turunannya,
substrat donor UDP-GalNAc dan CMP-Neu5Ac yang digunakan dalam produksi
glikoprotein dan glikolipid. Dengan demikian, HBP menghubungkan metabolisme
yang diubah dengan glikosilasi yang menyimpang, memberikan mekanisme
bagaimana sel kanker dapat merasakan dan merespons perubahan lingkungan
mikro. Kelompok kami telah menunjukkan bahwa sel A549 meningkatkan
pengambilan glukosa selama EMT; Namun, alih-alih meningkatkan jalur
glikolisis dan pentosa fosfat, glukosa dilepaskan melalui HBP, menghasilkan
peningkatan yang signifikan dari glikosilasi UDP-GlcNAc dan menyimpang. Di
sini kami menunjukkan bahwa sel MC38-HG dan tumor dari tikus hiperglikemik
menunjukkan lebih banyak UDP-GlcNAc daripada sel dan tumor MC38-LG yang
dilakukan dari tikus euglikemik. Oleh karena itu, hiperglikemia berkelanjutan
akan menyebabkan kelebihan UDP-GlcNAc, dan turunannya. Bukti yang
berkembang menunjukkan bahwa perubahan pada genangan substrat yang
diaktifkan dapat menyebabkan terjadinya glikosilasi diferensial. Juga, perubahan
glikosilasi dikaitkan dengan beberapa langkah progresi CRC. Hasil kami
menunjukkan bahwa hiperglikemia menginduksi perubahan glikofenotip
permukaan baik secara in vitro maupun in vivo, mendukung fenotip sel ganas. HG
meningkatkan kadar antigen Tn, 2,6-sialilasi, 2,3-sialilasi, fukolisasi, kompleks
1,6-branched N-linked glycans dan O-GlcNAcylation intraseluler. Hasil ini
sesuai dengan glikosilasi menyimpang yang diamati pada tumor kolon manusia.
Memang, -fucosylation terlihat pada banyak jenis tumor, termasuk kolorektal
dan berkorelasi dengan metastasis tumor, kekambuhan penyakit dan kelangsungan
hidup pasien yang buruk. Namun, mutasi pada PDB mannose-4,6-dehydratase
(GMDS) yang mengganggu biosintesis nabati-GDP berkontribusi pada pelepasan
CRC dari pengawasan kekebalan tubuh, yang menunjukkan bahwa hilangnya
fungsi fukosilasi memfasilitasi perkembangan kanker. Oleh karena itu,
peningkatan fukosilasi telah diusulkan untuk menjadi awal terjadinya kanker,
sedangkan gllikan kembali mengalami defukosilasi dengan perkembangan dan
metastasis kanker.

17
Gambar 6. Reduksi glikosilasi menyimpang pada sel MC38 yang dimusnahkan
dengan GFAT. Arus sitometri histogram daripada ikatan lectin dan
immunolabeling CO-GlcNAc. Histogram menunjukkan profil pengikat
perwakilan dari berbagai lectin dan imunolabeling O-GlcNAc pada sel MC38-HG

18
scrambled (Scr, green) atau shGFAT MC38-HG (merah). Histogram kosong
berwarna kuning mengacu pada sel-sel yang diwarnai dengan streptavidin
terkonjugasi FITC dan antibodi Fluorosensi Alexa 488-conjgated. Grafik batang
menunjukkan perbedaan antara intensitas fluoresensi untuk setiap penanda. N = 4
per kelompok; Baris error menunjukkan mean s.e.m. Unpaired t-test

Gambar 7. Tingkat penyimpangan GFAT, SNA danO-GlcNAc pada jaringan usus

manusia. (a-d) Analisis Western blot pada adenokarsinoma kolon manusia (T) dan
jaringan normal yang berdekatan (N) terhadap GFAT1, GFAT2, O-GlcNAc dan
aktin. (e, f) kadar mRNA GFAT1 dan GFAT2 pada tumor (T) dibandingkan
dengan jaringan normal di sekitarnya (N). (g, h) Analisis dot blot pada tumor (T)
dan jaringan normal yang berdekatan (N), mengukur tingkat SNA. Gambar
tersebut mewakili empat pasien (P22, P24, P28 dan P36). Semua grafik mewakili
mean s.e.m .; one-tailed unpaired t-test; Jumlah tujuh pasien n = 7; *Po0.05.

Ekspresi antigen Tn (GalNAc-O-Ser / Thr), dikaitkan dengan CRC tahap awal,

sedangkan pasangan sialasinya diekspresikan secara berlebihan pada tahap
selanjutnya, juga dikenal sebagai tahap metastatik. Hasil ini sesuai dengan hasil

19
penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa hiperglikemia memicu O-
glikosilasi yang menyimpang dan pengaturan tingkat mRNA untuk UDP-GalNAc:
polipeptida Nacetylgalactosaminyltransferases (ppGalNAc-T6), enzim yang
mengkatalisis biosintesis antigen Tn. Selain itu, di sini kami mengamati bahwa
hiperglikemia menginduksi peningkatan glikokonjugat yang yang didekorasi
dengan 2-6Neu5Ac (pelabelan SNA). Peningkatan asam sialat pada permukaan
sel tumor digambarkan dengan baik dalam literatur beberapa jenis tumor.
Peningkatan ekspresi asam sialat 2-6-linked pada N-glycans dikaitkan dengan
perkembangan kanker, terjadinya metastasis, prognosis buruk dan kegagalan
terapeutik pada CRC karena interaksi sel-sel yang berkurang dan peningkatan
sifat invasifnya. Terdapat bukti bahwa semua peran pro-tumor dari asam sialat 2-
6 terkait dengan N-glycans adalah berhubungan dengan maintenans tangkapan
pada sel CRC. Selanjutnya, peningkatan regulasi ST6Gal1 pada sel
adenokarsinoma kolorektal ditunjukkan untuk meningkatkan 2-6-sialilasi N-
glikol pada reseptor adhesi 1-integrin. Sialilasi reseptor ini meningkatkan
interaksi mereka dengan talin protein terkait sitoskeletal dan juga migrasi
mengikat dan haptotaktik pada kolagen, sehingga menyebabkan peningkatan
tumor. Ekspresi glikan yang didekorasi oleh asam sialat 2-3-linked (label MAA)
yang ditemukan di sini sesuai dengan penelitian yang menunjukkan 2-3-
sialylation meningkat pada garis sel kanker kolon metastatik. Glikol 2-3-sialilat
adalah komponen utama antigen sialil Lewis terkait kanker yang berperan penting
dalam adhesi sel kanker yang dimediasi oleh E-selectin ke sel endotel vaskular
selama metastasis secara hematogen. Dengan demikian, pengaruh hiperglikemia
terhadap ekspresi oligosakarida sialil Lewis oleh sel MC38 harus diverifikasi.
Sialilasi sering dikaitkan dengan penurunan unit -Gal bagian luar, sehingga
mengurangi pelabelan oleh PNA. Mengingat residu -Gal terminal berimplikasi
pada apoptosis sel tumor yang dimediasi oleh galektin (keluarga protein pengikat
karbohidrat dengan afinitas untuk beta-galaktosida, disekresikan oleh berbagai sel
termasuk sistem kekebalan tubuh), sialilasi pada permukaan sel tumor bisa
melindungi sel tumor dari infiltrat sel imun. Oleh karena itu, hypersialilasi yang
terlihat di sini mungkin mendukung penghindaran sistem kekebalan tubuh. Perlu

20
dicatat bahwa hiperglikemia meningkatkan ekspresi glikan N-linked bercabang
1-6 yang kompleks, seperti yang terlihat pada peningkatan ikatan L-PHA.
Oligosakarida 1-6GlcNAc bercabang adalah produk aktivitas Mgat5. Aktivitas
Mgat5 dibatasi oleh konsentrasi UDP-GlcNAc, sehingga peningkatan
ketersediaan substrat yang diaktifkan ini sangat meningkatkan produk 1-
6GlcNAc bercabang. Ketersediaan metabolit pada HBP dan Golgi meningkatkan
jumlah N-glycans dan percetakan N-glikan per molekul protein. N-glycans adalah
ligan untuk galektin 1 dan 3 pada permukaan sel, membentuk kisi yang
meningkatkan waktu tinggal reseptor sebagai transporter glukosa. (GLUT4,
GLUT2). N-glikosilasi secara tidak langsung mempengaruhi metabolisme dengan
mengatur ekspresi permukaan reseptor faktor pertumbuhan, yang mana
mengaktifkan jalur transduksi sinyal yang mengatur pertumbuhan dan
metabolisme sel. Bersama dengan data sebelumnya, kita mungkin menyarankan
bahwa hiperglikemia mempengaruhi pelokalan dan pengorganisasian dari
permukaan glikoprotein.

UDP-GlcNAc adalah substrat donor untuk OGT, enzim yang bertanggung jawab
untuk penambahan glcNAc dalam hubungan glikosidik terhadap hidroksil serin
atau treonin protein sitoplasma dan nuklir. Dengan demikian, O-GlcNAcylation
sangat responsif terhadap peningkatan serapan glukosa. Onodera dkk.
menunjukkan bahwaO-GlcNAcylation beberapa protein diamati hanya pada sel-
sel ganas, dan kekurangan glukosa atau penghambatan HBP atau OGT secara
signifikan mengurangi tumor-specificO-GlcNAcylation dalam kultur 3D. Banyak
penulis telah melaporkan bahwa beberapa jenis kanker, termasuk payudara,
kandung kemih, prostat dan kolon menunjukkan tingkat OGT atauO-
GlcNAcylation yang lebih tinggi pada tumor kelas II atau III dibandingkan
dengan kanker kelas I yang mengindikasikan adanya hubungan dengan
keganasan. Laporan ini sesuai dengan pengamatan kami bahwa ekspresi protein
O-Glcobalcylated pada jaringan tumor pasien lebih tinggi bila dibandingkan
dengan jaringan normal yang berdekatan. Meskipun penelitian lebih lanjut
diperlukan, kami dapat menyarankan bahwa glukNAer intraselular dapat

21
mengendalikan sialilasi permukaan sel, karena telah ditunjukkan baru-baru ini
bahwa aktivitas UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-asetilenzosamin kinase
(GNE), enzim utama untuk biosintesis asam sialat, dimodulasi oleh O-
GlcNAcylation yang menyimpang.

Baru-baru ini, O-GlcNAc telah muncul sebagai regulator epigenetik dari ekspresi
gen melalui pengaruhnya pada struktur kromatin tingkat tinggi, transkripsi dan
modulasi dari RNA polimerase II. Jadi, disarankan bahwa O-GlcNAcylation bisa
menghubungkan hiperglikemia dengan epigenetik. Memang, bukti yang
berkembang telah menunjukkan bahwa pemaparan yang berkepanjangan terhadap
HG secara epigenetik mempengaruhi ekspresi gen ke tingkat perubahan yang
stabil selama tidak adanya hiperglikemia, efek yang dikenal sebagai memori
hiperglikemik. Banyak perubahan kanker pada transkripsi gen dan organisasi
genom telah terbukti sangat bergantung pada mekanisme epigenetik, dan modulasi
epigenetik jalur onkogenik yang diinduksi oleh HG menghasilkan aktivasi
proliferasi sel kanker yang berkepanjangan. Data kami menunjukkan bahwa HG
mencetak memori glikofenotip pada sel MC38 yang tetap stabil keluar dari
lingkungan hiperglikemik, yang mana telah ditemukan di bawah glukosa darah
tinggi. Pengaturan epigenetik glikosilasi adalah konsep yang baru muncul namun
dengan cukup banyak penelitian yang dilakukan untuk menyoroti kepentingannya.
MGAT5B, gen pengkode enzim bercirikan N-glycan GnT-IX, diatur oleh
mekanisme epigenetik yang melibatkan aktivasi kromatin oleh kompleks OGT-
TET3. Dalam studi selanjutnya, akan menarik untuk mengetahui pengaruh
hiperglikemia dalam modifikasi histone untuk gen glikan lainnya.

Untuk mengevaluasi pentingnya GFAT dalam tumorigenesis kanker usus besar,

kami memodulasi fluks substrat melalui HBP. Selain menggunakan HG, metode
lain untuk mendorong peningkatan masuknya HBP adalah dengan mengobati sel
dengan GlcNAc, yang memasuki HBP, melewati GFAT. Demikian pula yang
diamati untuk HG, GlcNAc meningkatkan invasi sel. Sebaliknya, penghambatan
farmakologis GFAT oleh DON menurunkan invasi sel. Data yang menunjukkan
bahwa GlcNAc mengembalikan inhibisi DON membuktikan bahwa pengaruhnya

22
terhadap invasi sel disebabkan oleh inhibisi GFAT. Selanjutnya, kita
membungkam enzim pembatas laju GFAT1. Strategi ini memungkinkan kami
menunjukkan bahwa GFAT1 mengendalikan pertumbuhan dan invasi tumor, dan
glikosilasi yang menyimpang. Dengan menguatkan data ini, kami mengamati
peningkatan kadar GFAT1 dan GFAT2, serta O-GlcNAcylation dan sialisasi, pada
adenokarsinoma kolon manusia, menunjukkan peran penting HBP dalam
perkembangan kanker. Overekspresi GFAT telah diamati pada biopsi kanker
prostat sebelumnya, dan aktivitasnya tampaknya terkait dengan hiperglikemia
postprandial pada pasien DM2. Singkatnya, data kami menunjukkan bahwa HBP
dapat mengubah biologi sel tumor dan mempercepat proses keganasan melalui
glikosilasi yang menyimpang. Hasil kami menunjukkan HBP sebagai satu
mekanisme dimana hiperglikemia terlibat dalam perkembangan kanker dan
mungkin mengarah ke jalur potensial yang dapat diterima untuk intervensi
terapeutik.

BAHAN DAN METODE

Kultur sel

Sel MC38 kolon tikus adenokarsinoma dan sel MC38 yang direkayasa yang
mengekspresikan protein Greenfluoresen, telah dengan baik disumbangkan oleh
Ajit Varki (Universitas California, San Diego, CA, AS). Sel A549 epitel basal
alveolar manusia telah dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC, AS).
Semua lini sel dipertahankan pada medium Eagle Eagle dalam Dulbecco
dimodifikasi dengan konsentrasi glukosa tinggi (glukosa 1%), 1% piruvat dan
10% serum bovine janin, gentamisin 20 mg/ml (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, AS
, 50 mg/ml) pada suhu 37C dalam atmosfir yang dilembabkan sebesar 5% CO2.
Sel-sel ini beralih dari HG ke LG (5 mM) selama lebih dari satu bulan sebelum
percobaan, membentuk dua kelompok yang ditunjukkan sebagai LG dan HG.
Kondisi ini ditunjukkan pada gambar.

Waktu penggandaan populasi- (uji PDT)

23
PDT adalah waktu dimana jumlah populasi sel bertambah. Sel MC38 dipanen
pada konfluen 90% dan dihitung. Setelah plating jumlah sel konstan (10 3 sel) ke
sel kultur w/2 mm grid (Nalge Nunc International, New York, NY, AS), sel
dihitung pada interval harian selama 5 hari. Waktu penggandaan dihitung
berdasarkan fase log dari kurva pertumbuhan yang diperoleh dengan menghitung
sel, dengan menggunakan rumus:

Dimana 'cf' adalah konsentrasi sel final dan 'ci' adalah konsentrasi sel awal. Untuk
durasi total, setiap unit waktu dapat digunakan dan penggandaan unit waktu akan
sama.

Uji invasi sel

Selaput transwell (membran polikarbonik, diameter 6,5 mm, ukuran pori 8m-
Costar, Cambridge, NY, AS) dilapisi dengan matrigel dalam total 100l setiap
transwell dalam kabinet aliran laminar yang berfungsi penuh untuk membiarkan
matrigel menguat (matrigel: 0,375 Mg/ml). Setelah itu, sel MC38-GFP 210 5
ditanam dalam 200l serum bebas DMEM ke ruang atas, dan media 900l dengan
serum betina 10% ditambahkan ke ruang bawah. Setelah 24 jam inkubasi, sel
yang menempel pada permukaan atas membran telah dilepas dengan kapas. Sel
yang bermigrasi, yang menempel pada permukaan yang lebih rendah, diobati
dengan paraformaldehid 4%, dan jumlah sel yang menempel pada permukaan
bawah dihitung dalam mikroskopi pada pembesaran 10. Data diperoleh dari tiga
percobaan independen.

Isolasi RNA dan RT-qPCR

Sampel diberikan protokol fenol-kloroform untuk ekstraksi RNA total

menggunakan Reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, AS) sesuai dengan

24
petunjuk pabrik pembuatnya, dan konsentrasi RNA ditentukan dengan
menggunakan Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, NC , USA).
Integritas RNA dinilai dengan elektroforesis gel agarosa agar-agar. RNA (1 g)
diobati dengan DNase I bebas RNAse (Fermentas International, Burlington,
Kanada) untuk menghilangkan kontaminasi genomik, dan digunakan sebagai
template untuk sintesis cDNA dengan menggunakan Kit Transkripsi Reverse
CDNA dengan Kapasitas Tinggi (Applied Biosystems, Foster City, CA,
AMERIKA SERIKAT).

Primer untuk qPCR dirancang menggunakan perangkat lunak Primer3. QPCR

dilakukan dalam Sistem PCR StepOne real-time (Biosistem Terapan) dengan
menggunakan SYBR Green PCR Master Mix (Biosistem terapan) dengan kondisi
berikut: satu siklus selama 10 menit pada suhu 95C, diikuti oleh 40 siklus 15 s
pada 95C dan 45 s pada suhu 60C. Amplifikasi qPCR dilakukan dengan
menggunakan primer spesifik untuk gen target. Semua tes dijalankan dalam
rangkap tiga, dengan HsGAPDH digunakan sebagai kontrol normalisasi endogen.
Kontrol template dijalankan pada semua percobaan qPCR untuk memverifikasi
apakah campuran reaksi telah terkontaminasi dengan DNA eksogen. Kontrol
reverse-transcriptase juga dilakukan untuk memastikan bahwa pengobatan DNaseI
telah mendegradasi DNA genom mana pun yang mungkin mengkontaminasi
sampel RNA, dan tidak ada amplifikasi DNA genomik. Dalam kondisi ini, nilai
ambang Ct (siklus ambang batas) untuk semua gen telah dianalisis sama dengan
kontrol template. Dalam analisis statistik hasil qPCR, ekspresi relatif dan nilai
Ct dihitung dari nilai Ct yang diperoleh, seperti yang dijelaskan di tempat lain.
Nilai mean Ct yang diperoleh dari percobaan diajukan ke uji Grubb untuk
mendeteksi outlier, dan perbandingan antara kondisi yang berbeda dibuat dengan
menggunakan uji t Student dan perbedaan dianggap signifikan pada Po0.05. Nilai
ekspresi relatif (2-Ct) hanya digunakan untuk konstruksi graf. Analisis statistik
dilakukan dengan menggunakan software SAS versi 9.1.3 (SAS Institute, Cary,
NC, USA).

Konstruksi lentivirus dan transduksi sel MC38

25
Partikel lentivirus diproduksi dengan plasmid pGFP-C-sh scrambled atau
shGFPT1 (Origene, TL511601) dan lentivirus kemasan (Invitrogen) sesuai
instruksi pabrik.

Flow Cytometric

Pengikatan sel lectin dilakukan seperti yang dijelaskan. Untuk imunolabeling O-

GlcNAc, sel-sel MC38 1x106 direaksikan dengan formaldehida 3,7% (Merck,
Darmstadt, FRG) dalam larutan garam buffer fosfat (PBS) selama 15 menit pada
suhu 4C. Sel telah di pellet dengan sentrifugasi pada 300 g selama 5 menit,
dimodifikasi selama 15 menit dengan 0,2% v/v Tween 20 (Sigma) dalam PBS
pada suhu 37C, dan dicuci sekali dengan PBS. Sel permeabilisasi diinkubasi
semalaman pada suhu 4C dengan pengenceran anti-O-GlcNAc 1:100 (RL2;
SC59624, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) di PBS (volume akhir
100l). Sel dicuci dua kali dan diikuti dengan inkubasi pada suhu 4C selama 2
jam pada 100lfa 1:2500 pengenceran antibodi Alexa Fluor 488-conjgated (A-
11001, Invitrogen) di PBS.

Pellet sel terakhir dicuci dua kali dan ditangguhkan

Pada PBS untuk akuisisi flow cytometric dari 10.000 kejadian dengan fACS
Calibur flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Data intensitas
fluoresensi dianalisis dengan FlowJo X.

Hewan

Percobaan dilakukan pada jantan dewasa C57BL/6 (3-4 bulan) sesuai dengan
National Institutes of Health Guide untuk Perawatan and Use of Laboratory
Animals (NIH Publication No. 80-23), dan telah disetujui oleh Komite untuk
Penggunaan Hewan Percobaan dari institusi kami. Hewan dipilih menggunakan
metode acak sederhana. Tikus hiperglikemik diinduksi dengan suntikan intra
peritoneal tunggal (i.p.) 150 mg/kg STZ (Sigma-Aldrich) yang diencerkan dengan
buffer 0,1 Msodium sitrat (pH 4.3) sebelum digunakan. Tikus kontrol menerima

26
buffer 0.1Msodium sitrat (pH 4.3) dalam satu injeksi i.p. sebagai tunggangannya.
Darah dikumpulkan setiap minggu dari vena ekor, dan kadar glukosa darah diukur
dengan menggunakan sistem pengukuran glukosa dasar sekali sentuh yang
divalidasi (Accu-chek Active Test meter, Roche) dan berat badan juga diukur
setiap minggu dari awal (Gambar Tambahan 1A, B). Tujuh hari setelah
pengobatan STZ, tikus dengan konsentrasi glukosa darah 4300 mg/dl menerima
infus sel. Tidak terdapat investigasi buta yang digunakan dalam eksperimen
hewan.

Uji pertumbuhan tumor

Tumor subkutan diinduksi dengan implantasi sel MC38 1105 pada sisi kanan dari
C57BL/6. Hewan dipisahkan menjadi enam kelompok eksperimen berikut: (1)
tikus yang disuntik dengan sel yang dikultur dalam kondisi LG (MC38-LG); (2)
tikus disuntik dengan sel yang dikultur dalam kondisi HG (MC38-HG); (3) tikus
hiperglikemia disuntik dengan sel yang dikultur dalam kondisi HG (MC38-HG-
HyG); (4) tikus disuntik dengan sel yang dikultur dalam kondisi HG dan diobati
dengan DON (MC38-HG-DON); (5) tikus disuntik dengan sel yang dikultur
dalam kondisi HG dan dibungkam dengan GFAT1 (MC38-HGshGAT); Dan (6)
tikus disuntik dengan sel yang dikultur dalam kondisi HG dan diacak ke GFAT1
(MC38-HG-shGAT). Tumor diukur dua kali seminggu selama 28 hari, dan daerah
tumor dihitung. Kurva pertumbuhan untuk tumor diplot sebagai daerah rata-rata
s.e.m. tumor tikus dari masing-masing kelompok. Tidak ada metode statistik yang
digunakan untuk memprediksi ukuran sampel dan ukuran sampel bervariasi dari 9
sampai 18 per kelompok, yang ditentukan dalam legenda masing-masing.

Metastasis paru eksperimental

Sebagai model hewan metastasis paru, sel MC38 2105 diinokulasi dalam 100 l
DMEM melalui vena ekor tikus. Setelah 22 hari, tikus dianestesi dengan injeksi
i.pamin ketamin/xylazine 100 mg/kg dan berat badan 10 mg/kg, masing-masing,

27
dan diserap secara transkrit dengan PBS. Gambar paru-paru yang membelah
diambil dan gambar fluoresensi GFP diperoleh pada IVIS Lumina System.
Selanjutnya, paru-paru diproses untuk kuantifikasi metastasis dengan mendeteksi
fluoresensi GFP. Paras-paru yang dilarutkan dihomogenkan dalam 2 ml buffer
hipotonik (20 mMTris-Cl, pH 7.0) dengan menggunakan potter. Triton X-100
ditambahkan ke konsentrasi afinal 0,5%. Setelah 30 menit di atas es, puing-puing
yang tidak larut dipintal (10.000 g selama 10 menit), 10l setiap supernatan
diencerkan dengan buffer Tris-Cl (20 mMTris-Cl, pH 7.0) sampai volume afin
100l, dan dipindahkan ke Sebuah kotak kuarsa. Fluoresensi dibaca pada Varian
Cary Eclipse (Varian) pada Ex 485 dan Em 508. Tingkat latar belakang untuk
substraksi ditentukan pada paru-paru dari tikus, yang sebelumnya tidak disuntik
dengan sel berlabel GFP.

Lisat jaringan dan western blot

Total lisat telah diperoleh menghomogenisasi sampel jaringan dalam potter

dengan buffer lisis 1% Triton X-100, natrium deoksikolat 0,5%, 0,2% SDS, 150
mM NaCl, 2 mMEDTA, 10 mMHEPES (pH 7,4), 20 mMNaF, 1 mMortovanadat
dan sebuah koktail protease inhibitor, selama 30 menit pada suhu 4oC. Setelah
sentrifugasi pada 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4C, supernatan telah
dilepaskan dan disimpan pada suhu -80C. Untuk imunoblotting jumlah protein
yang sama (30 g/lane) dari lisat jaringan dipisahkan pada 7,5% SDS-PAGE dan
dipindahkan ke lembaran nitroselulosa. Membran diblokir dan diinkubasi
semalaman dengan antibodi primer GFAT1 dan GFAT2 (SC134894 dan
SC134710, masing-masing, Santa Cruz Biotechnology), CTD-110.6 untuk O-
GlcNAc (SC-59623, Santa Cruz Biotechnology), -actin (A5316, Sigma
Chemical ) Dan vinculin (V4505, Sigma Chemical). Setelah dicuci, membran
diinkubasi selama 1 jam dengan antibodi peroksidase terkonjugasi sekunder,
dikembangkan menggunakan ECL (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, AS) dan
terpapar dengan Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare). Perangkat lunak
ImageJ digunakan untuk analisis densitometri imunoblot, dan pengukuran
dinormalisasi terhadap kontrol pemuatan beta-aktin atau vinculin.

28
Lectin mengikat bagian-bagian jaringan

Hewan diberi anestesi dengan injeksi Ketamin/xilazin 100 mg/kg secara

intraperitoneal, dan disformat secara transkial dengan 4% paraformaldehida dalam
0,1MPBS, pH 7,4. Jaringan dikompromikan dalam sukrosa 30% dalam
0,1MTPO4 selama paling sedikit 1 minggu, lalu disematkan pada senyawa O.T.C
(Meio Tissue-Tek, Sakura) dan di cryoseksi menjadi bagian-bagian sebesar 20 m.
Lectin dan spesifistas gula nominalnya tercantum dalam Gambar Tambahan 1.
Pewarnaan dilakukan pada suhu 4C semalam sampai 100 g/ml. Kontrol negatif
terdiri dari streptavidin saja dan lektin biotinilasi tanpa streptavidin peptida.
Sampel fluoresen dianalisis dengan mikroskop confocal (Zeiss LSM 510 Meta).

Dot blot

Untuk analisis dot blot, 10g lisat sel total terlihat dan tidak bergerak dalam
membran nitroselulosa. Membran diblokir dengan 3% albumin serum sapi (BSA)
dan diinkubasi semalaman dengan biotinilasi sambucus nigralectin (SNA,
Laboratorium Vektor), pelabelan 2-6-Neu5Ac. Blot-blot tersebut kemudian
dicuci, diinkubasi dengan extravidinperoxidase (Sigma), dikembangkan
menggunakan ECL (GE Healthcare) dan terpapar dengan Image Quant LAS 4000
(GE Healthcare). Perangkat lunak ImageJ digunakan untuk analisis densitometrik,
dan pengukuran dinormalisasi terhadap pewarnaan Ponceau.

Magnetic Resonance Imaging (MRI)

Perkembangan awal tumor subkutan dianalisis secara in vivo dengan pengukuran

pencitraan resonansi magnetik 5 hari setelah injeksi sel MC38. Hewan tersebut
diberi anestesi dengan Isoforine dan mendapat suntikan intravena (0,5 ml/kg berat
badan) dengan agen kontras gadolinium (Dotarem; 0,5 mmol/ml). Gambar
diperoleh dengan pemindai resonansi magnetik 7T (Varian MRI System 7T/210

29
ASR Horizontal Bore Magnet, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).Tiga
sekuen T1-weighted spin echo telah diperoleh (aksial dengan TR/TE = 420 ms/15
ms, matriks = 128 128, FOV = 80 mm/50 mm, 20 irisan, tidak ada celah,
ketebalan = 1 mm, NEX = 10 ; Koronal dengan TR/TE = 750 ms/15 ms, matriks =
128 128, FOV = 35 mm/35 mm, 35 irisan, tidak ada celah, ketebalan = 1 mm,
NEX = 10; sagittal dengan TR/TE = 525 ms/15 ms, matriks = 128 128, FOV =
80 mm/40 mm, 25 irisan, tidak ada celah, ketebalan = 1 mm, NEX = 10) dan
rangkaian T2-wieghted fast spin echo (TR/TE = 2520 ms/15 ms, matriks = 128
128, FOV = 80 mm / 50 mm, 20 irisan, tidak ada celah, ketebalan = 1 mm, NEX =
10).

Deteksi UDP-heksosamin

UDP-heksosamin yang diproduksi oleh sel MC38 in vitro ditentukan oleh HPLC
menggunakan kolom PGC Hypercarb (3.0 mm 150 mm, Thermo Scientific)
seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Kehadiran sampel jaringan UDP-heksosamin diketahui oleh high-resolution

matrix-assisted laser desorption/ionization Fouriertransform ion cyclotron
resonance mass spectrometry imaging (MALDIFT-ICR MSI). Tumor subkutan
dari tikus euglikemik dan hiperglikemik dibekukan dalam nitrogen cair dan
disimpan pada suhu -80C. Bagian beku (12m) dipasang pada slide kaca indium-
timah-oksida (ITO) (Bruker Daltonik, Bremen, Jerman) yang diawali dengan
poliester L-lysine 1:1 (Sigma Aldrich, Munich, Jerman) dan 0,1% Nonidet P-40
(Sigma) untuk analisis MSI. Bagian yang berdekatan dipasang pada slide kaca
untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (H & E). Semua bagian disimpan pada
suhu -80C sampai analisis. Sebelum aplikasi matriks, bagian tumor mengalami
dehidrasi dalam ruang hampa selama 1 jam pada suhu kamar. Sampel dilapisi
dengan matriks 10-aminoacridine 10 mg/ml dalam metanol 70% menggunakan
ImagePrep spray roboter (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA). MSI dilakukan
dalam mode ion negatif pada sebuah Bruker Solarix 7 T FT-ICR MS (Bruker), di
atas rentang massa m/z 150-1000 dan resolusi lateral 50m. Semua pengukuran

30
termasuk daerah pengukuran non-jaringan sebagai kontrol latar belakang. Data
yang diperoleh dianalisis menggunakan Lab SCILS (Bruker Daltonics) dan
dinormalisasi terhadap kuadrat akar dari semua titik data. MS/MS dilakukan pada
sampel pada-jaringan dengan menggunakan disosiasi tangkapan elektron pada sel
yang bertubrukan.

Sampel pasien

Adenokarsinoma kolonr dan jaringan normal yang berdekatan berasal dari biopsi
tujuh pasien (empat laki-laki dan tiga perempuan) telah diperoleh dari Instituto
Nacional de Cncer (INCA), Rio de Janeiro, Brasil, yang membawa sampel
setelah mendapat persetujuan pasien. Semua sampel berasal dari reseksi bedah
dan dievaluasi oleh ahli patologi bersertifikat. Dalam semua kasus, spesimen
kontrol dikumpulkan dari mukosa normal yang menyertainya, jauh sekitar 10 cm
dari karsinoma. Jaringan kanker dan lapisan epitel normal diisolasi dengan hati-
hati dari reseksi kolon dengan gunting dan forsep. Semua sampel tumor yang
digunakan bertekad untuk menjadi tumor sebesar >80% dengan mengevaluasi
bagian-bagian H&E-stained. Bagian H&E-stained dari setiap sampel normal
dievaluasi dan ditentukan untuk tidak memiliki lesi prakanker. Gambaran
patologis klinis tercantum dalam Tabel Tambahan 2. Sampel untuk imunobloting
dibekukan pada suhu -80C dan yang digunakan untuk qRT-PCR segera direndam
dalam larutan stabilisasi RNA berikutnya (Ambion-Life Technologies, Carlsbad,
CA, AS) dan disimpan pada suhu 4C semalam, kemudian sampel dipindahkan ke
-80C untuk penyimpanan jangka panjang. Penelitian ini dilakukan dengan
persetujuan Komite Etika Institut Kanker Nasional Brasil (Nomor registrasi:
84/04).

Analisis statistik

Semua data dianalisis dalam Prism (Graphpad). Uji t tidak berpasangan satu/dua
atau ANOVA satu/dua arah (Dunnett, tes pasca Tukey / Bonferroni) digunakan
saat membandingkan dua kelompok atau lebih dari dua kelompok. Diagram
batang kesalahan (eror) mewakili mean s.e.m. ketika tidak dispesifikkan

31
Persetujuan studi

Semua percobaan yang melibatkan tikus telah disetujui oleh Institutional Animal
Care and Use Committee dan mengikuti semua peraturan dan peraturan negara
bagian dan federal. Semua sampel manusia yang digunakan dalam percobaan
diidentifikasi dan diperoleh dari Instituto Nacional do Cancer, yang membawa
sampel setelah di-informed consent.

32