dengan tekanan tinggi dimana fase geraknya berupa cairan

ANALISIS PARACETAMOL DENGAN METODE KCKT & fase diam dapat dalam bentuk cair / padat

TUJUAN : PRINSIP

1. Mampu membuat larutan fase gerak dg  Pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,

perbandingan tertentu utk analisis menggunakan dimana analit terpisah karena perbedaan kecepatan elusi.
KCKT Pemisahan analit ini diatur oleh distribusi analit dlm fase
2. Mampu melakukan analisis kualitatif paracetamol diam / fase gerak, digunakan tekanan tinggi utk
menggunakan KCKT mendorong fase gerak
3. Mampu melakukan analisis kuantitatif
paracetamol menggunakan KCKT

ALAT : Kuantitatif  berdasarkan perbandingan pengukuran

tinggi atau luas puncak dari solut dengan puncak standar
a. Instrumen KCKT (Kolom C18 KCKT, detektor UV, referensi pada konsentrasi yang diketahui.
alat injeksi sampel)
b. Labu ukur 100mL Kualitatif
c. Kertas saring
d. Pipet volume  RT/Retention time  peak mempunyai RT yang sama
e. Alat-alat kaca lainnya dg standar

BAHAN :  spektrum 3D

a. Paracetamol baku
b. Tablet paracetamol
c. Metanol HPLC grade KELEBIHAN KCKT :
d. Aquabides
1. Mampu memisahkan molekul dari suatu
e. Asetonitril
campuran
CAKER : 2. Waktu analisis cepat & kepekaan tinggi
3. Resolusi tinggi
1. Kondisi percobaan 4. Hasil analisis mempunyai akurasi & presisi tinggi
Kolom : ODS-C18 5. Sensitivitas detektor
Fase gerak : metanol : aquabides (1:1) 6. Kolom dapat digunakan kembali
Asetonitril : air (25:75) 7. Ideal utk zat termolabil dan volatilitas rendah
Detektor : UV dengan  207 nm 8. Mekanisme pemisahan lebih variatif
2. Penyiapan lart. Standar 9. Mudah recovery sampel
10 mg baku PCT dimasukan ke dlm labu ukur
100mL & dilarutkan dg fase gerak metanol :
aquabides (1:1) / asetonitril : air (25:75) sampai
KELEMAHAN KCKT :
tanda batas  dihomogenkan
3. Penyiapan lart. Sampel 1. Tdk dapat menganalisis >1 sampel sekaligus
Tablet PCT digerus & ditimbang 10mg  2. Kromatogram tdk dapat disimpan sebagai
dimasukan ke dalam labu ukur 100mL & dokumen otentik
dilarutkan dg fase gerak metanol : aquabides (1:1) 3. Biaya mahal
/ asetonitril : air (25:75) sampai tanda batas  4. Harus mengetahi kombinasi yg optimum antara
dihomogenkan dan disaring. Filtrat yg dihasilkan pelarut – analit – gadien elusi
dimasukan ke dalam wadah yg sesuai  larutan
siap utk diinjeksikan (lart. Uji)
KEGUNAAN KCKT :

a. Pemisahan berbagai senyawa

organik/anorganik/spesimen biologis
b. Pemisahan senyawa dg struktur kimia mirip
c. Pemisahan senyawa dlm jmlh kecil
d. Analisis ketidakmurnian (impurties)
e. Analisa senyawa-senyawa yg non volatil
PENGERTIAN f. Isolasi & pemurnian senyawa
g. Penentuan molekul-molekul netral, ionik, zwitter
Kromatografi  suatu teknik pemisahan molekul ion
berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak
dan fase diam utk memisahkan komponen (berupa JENIS KCKT :
molekul) yang berada pada larutan.
Berdasarkan pemisahan :
KCKT  merupakan salah satu metode fisikokimia
berdasarkan pada teknik kromatografi yang disertai
FASE NORMAL FASE TERBALIK
(fase diam lebih polar (fase diam kurang polar 6. Inert
dibanding fase geraknya) dibanding fase geraknya) Fase gerak tidak boleh bereaksi dengan campuran analit.

kemampuan elusi  kemampuan elusi  7. Toksisitas

dengan meningkatnya dengan meningkatnya Penggunaan pelarut toksik harus dihindarkan. Pelarut-
polaritas pelarut polaritas pelarut pelarut terklorinasi dapat melepaskan gas fosge yang
sangat toksik.

8. Harga
F.diam (p) : silika / F.diam (np) : siloksan
alumina / trietilenglikol yg
dilapiskan pd partikel silika

INSTRUMEN KCKT
F.gerak (np) : heksana / F.gerak (p) : air / metanol
propileter / asetonitril

Senyawa kurang polar Senyawa polar dielusi lebih

dielusi lebih awal awal

SYARAT FASE GERAK :

a. Hrs bertindak sbg pelarut yg baik utk cuplikan yg

akan dianalisis
b. Harus murni sekali utk menghindarkan masuknya
kotoran yg dapat mengganggu interpretasi 
harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC.
Untuk air digunakan aquabides.
c. Harus jernih sekali untuk menghindarkan
penyumbatan pd kolom
d. Harus mudah diperoleh, murah, tdk mudah
terbakar, tdk beracun
e. Tidak kental, umumnya kekentalan tdk > 0,5 cP
f. Sesuai dg detector
DASAR PEMILIHAN FASE GERAK :
1. RESERVOIR (WADAH FASE GERAK)
 terbuat dari kaca atau stainless steel yang mampu
memuat 200 - 1000 mL pelarut.
 dilengkapi dengan suatu alat degasser yang dapat
menghilangkan gas terlarut pada fase gerak
(biasanya O dan N) yang mengganggu analisis
karena dapat membentuk gelembung pada kolom
dan system detector.
 dilengkapi dengan penyaring milipore yang mampu
menyaring partikel-partikel halus pada pelarut. Hal
ini penting karena partikel halus dapat
menimbulkan kerusakan (menyumbat) system
injector, pompa dan juga kolom.

1. Viskositas. 2. POMPA
Pelarut dengan viskositas rendah menghasilkan tekanan Syarat :
yang lebih rendah. Viskositas rendah juga memungkinkan  Mamberikan tekanan yang
kromatografi yang lebih cepat karena perpindahan masa  Bebas dari pulsa
berlangsung lebih cepat.  Memberikan kecepatan aliran 0,1 – 10 ml/menit
 Aliran terkontrol dengan reprodusibilitas kurang
2. Transparansi terhadap UV dari 0,5%
Jika detector yang digunakan adalah detector UV, maka  Tahan karat
fase gerak harus transparan secara sempurna pada
 Dapat memberikan aliran sistem isokratik
panjang gelombang yang digunakan.
maupun gradient

3. Indeks bias Ada 2 tipe :

Jika detector yang digunakan adalah detector indek bias,
1. Pompa dg tekanan konstan (costant pressure)
maka perbedaan indeks bias antara pelarut dengan sampel
2. Pompa pendesakan tetap (constant displacement)
harus besar.

4. Titik didih
Titik didih fase gerak yang rendah diperlukan jika eluat
akan dilakukan pemrosesan lebih lanjut supaya
memudahkan dalam penguapannya.

5. Kemurnian
Tidak adanya senyawa lain yang mengganggu analisis
3. INJEKTOR
Ada 3 jenis :
Injektor Penyuntikan cuplikan dengan
septum memasukkan cuplikan itu ke dalam
syringe dan menusukkan jarum syringe
melalui septum elastomer merupakan
cara penyuntikan pada kolom yang paling
sederhana.
Injektor Stop Penyuntikan pada bagian atas kolom
flow menghasilkan kromatografi yang sangat
efisien
Injektor loop Prinsip : dimana pada saat awal sampel
valve akan masuk memenuhi volume loop
terlebih dahulu dan akhirnya segera
masuk menuju kolom pemisahan dengan
volume yang tidak berkurang sedikitpun.
Syarat injektor :
(1) Dpt memasukan sampel ke kolom dlm btk
sesempit mungkin
(2) Mudah digunakan
(3) Keberulangan tinggi
(4) Dpt bekerja walaupun ada tekanan balik
4. KOLOM
Ada 2 jenis :
I. Kolom analitik  digunakan untuk penentuan
jenis dan jumlah analit yang diperiksa
Jenis Panjang (cm) Diameter (mm)
Konvensional 10-20 4,5
Microbore 10 2,4
High speed 6 4,6
Keuntungan kolom microbore :
 konsumsi fase gerak  80% krna kecepatan
aliran fase gerak lambat
 adanya aliran fase gerak yg lebih lambat
membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dg spektrometer massa
 sensitif / sangat bermanfaat jika jumlah
sampel trbts misalnya sampel klinis
Kelemahan kolom microbore :
- Tdk setahan kolom konvensional
- Kurang bermanfaat utk analisis rutin
Tujuan kolom dibuat dengan diameter internal sangat
kecil (kolom mikro) adalah sebagai berikut:
- Kepekaan menjadi lebih teliti
- Mencegah difusi fase gerak
- Memperluas kemampuan detector
- Sampel yang dianalisis sedikit
Sedangkan tujuan kolom dibuat pendek (high speed)
adalah:
- 1. Menghasilkan resolusi yang baik
- 2. Memperkecil harga diameter rata-rata partikel
fasa diam
- 3. Waktu retensi (tR) menjadi singkat
II. Kolom Preparatif  digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen analit dalam
jumlah besar.
Umumnya kolom preparative memiliki diameter
dalam 6 mm/ lebih dan panjang 25-100 cm
5. DETEKTOR
Ada 2 tipe :
(1) Universal (mmpu mendeteksi zat scra umum,
tdk bersifat spesifik, & tdk bersifat selektif)
(2) Spesifik (hanya akan mendeteksi analit scra
spesifik & selektif
Syarat :
a. Mmpunyai respon trhdp solute yg cepat &
reprodusibel
b. Mmpunyai sensitifitas yg tinggi / mmpu
mendeteksi solut dlm kadar yg kecil
c. Stabil dlm pengoperasiannya
d. Mmpunyai sel volume yg kecil sehingga
mampu meminimalkan pelebaran pita
e. Signal dihasilkan berbanding lrs dg
konsentrasi solute pd kisaran yg luas
f. Tdk peka trhdp perubahan suhu & kecepaan
alir fase grak
Waktu Retensi (RT)  waktu yang diperlukan oleh analit
mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya
secara maksimal ditangkap oleh detektor
tR  Waktu retensi analit yang tertahan pada fase diam
tM  waktu retensi analit yang tidak tertahan pada fase
diam / waktu retensi pelarut pengelusi
Faktor mempengaruhi RT :
- Tekanan yg digunakan  krna akan
mempengaruhi lajunalir dri pelarut
- Kondisi dr fase diam  material dan ukurannya
- Komposisi yg tepat dr pelarut
- Temperatur pd kolom
Faktor Kapasitas / factor retensi  merupakan ciri khas
suatu analit pada kondisi tertentu, yaitu pada komposisi
fase gerak, suhu dan jenis kolom tertentu. Faktor kapasitas
dapat memberikan gambaran dimana puncak-puncak
analit terelusi secara relatif terhadap puncak fase
geraknya. Harga faktor kapasitas k’ yang baik adalah
berkisar antara 2 – 10
Sistim Elusi KCKT
Sistim elusi isokratik
didefinisikan sebagai suatu
system elusi dimana
kekuatan fase gerak dibuat
tetap dari awal sampai
akhir analasis.
Pada sistim ini elusi
dilakukan dengan satu
macam pelarut
pengembang atau lebih dari
satu macam pelarut
pengembang dengan
perbandingan yang tetap.
Misalnya metanol : air =
50% ; 50% v/v.
Sistim elusi gradien
didefinisikan sebagai
penambahan kekuatan fase
gerak selama analisis
kromatografi berlangsung.
Sistem elusi gradient dapat
mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-
senyawa yang tertahan kuat
dalam kolom
Pada sistim ini elusi
dilakukan dengan pelarut
pengembang campur yang
perbandingannya berubah
dalam waktu tertentu.
Misalnya metanol : air =
40% : 60% v/v dengan
kenaikan kadar metanol 8%
setiap menit.
Keuntungan :
1. Mempersingkat total
waktu analisis
2. Meningkatkan resolusi
persatuan waktu tiap
senyawa
3. Memberikan peak yang
tajam (ramping)
4. Meningkatkan
sensitivitas