IMMUNOBLOTTING

WESTERN BLOT

KELOMPOK7
ARASWATI NURUL SYIFA

NORMA MIFTAHUL JANNAH

RINA ANGGRAINI
APA ITU BLOTTING?

 Blots adalah teknik untuk mentransfer DNA, RNA dan protein ke

pembawa sehingga mereka dapat dipisahkan, dan sering mengikuti
penggunaan elektroforesis gel.
 Southern blot digunakan untuk mentransfer DNA,
 Northern blot untuk RNA dan
 Western blot untuk Protein
WESTERN BLOT (IMMUNOBLOTTING) ?

 Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis

 Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan spesifisitas
immunoassay
 Teknik untuk mendeteksi protein spesifik yang dipisahkan oleh
elektroforesis dengan menggunakan antibodi berlabel
 Teknik menggabungkan pemisahan dari SDS PAGE (elektroforesis
protein) untuk menilai keberadaan, jumlah dan berat molekul protein
dalam seluler atau ekstrak jaringan dengan menggunakan antibodi.
GEL ELECTROPHORESIS ?

 Menggunakan gel elektroforesis untuk

memisahkan protein asli atau protein
terdenaturasi dengan panjang
polipeptida (kondisi denaturasi) atau oleh
struktur 3-D protein (kondisi asli / non-
denaturasi).
 Protein kemudian ditransfer ke membran
(biasanya nitroselulosa atau PVDF), di
mana mereka diselidiki (terdeteksi)
menggunakan antibodi khusus untuk
protein target.
PRINSIP PEMERIKSAAN
 Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida
 Fraksi protein dipindah ke membran, menggambarkan replika pola fraksi-
fraksi protein
 Membran disaturasikan untuk menghindari pengikatan antibodi non
spesifik
 Membran direaksikan dengan antibodi primer
 Membran direaksikan dengan antibodi sekunder spesifik terhadap antibodi
primer, sebelumnya antibodi sekunder dikonjugasikan dengan enzim
 Pita protein yang berlabel enzim direaksikan dg substrat kromogen yang
akan menghasilkan produk berwarna
 Tissue preparation
Gel electrophoresis
PROSEDUR Transfer
PEMERIKSAAN
Blocking
Detection
Analysis
FIRST STEP
TISSUE PREPARATION
 Sampel dapat diambil dari seluruh jaringan atau dari kultur sel. Dalam
kebanyakan kasus, jaringan padat dipecah secara mekanis
menggunakan blender.
 Perlu dicatat bahwa bakteri, virus atau sampel lingkungan dapat
menjadi sumber protein dan dengan demikian Western blott tidak
terbatas pada studi seluler saja.
 Berbagai macam deterjen, garam, dan buffer dapat digunakan untuk
melisiskan sel dan melarutkan protein.
 Persiapan jaringan sering dilakukan pada suhu dingin untuk
menghindari denaturasi protein
GEL ELECTROPHORESIS

 Protein sampel dipisahkan

menggunakan elektroforesis gel.
Pemisahan protein dapat dilakukan
dengan berat molekul titik
isoelektrik, muatan listrik, atau
kombinasi faktor-faktor ini
SDS-PAGE SAMPLE PROCESSING
SECOND STEP
TRANSFERRING

 Untuk membuat protein yang

dapat diakses untuk deteksi
antibodi, mereka dipindahkan
dari dalam gel ke membran yang
terbuat dari nitroselulosa atau
polivinilidena difluorida (PVDF).
TRANSFERRING

 Membran ditempatkan di atas gel, dan setumpuk kertas filter

ditempatkan di atasnya.
 Seluruh tumpukan ditempatkan dalam larutan buffer yang bergerak
naik kertas dengan aksi kapiler, membawa protein bersamanya.
 Metode lain untuk mentransfer protein disebut electro blotting dan
menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke dalam
PVDF atau membran nitroselulosa.
THIRD STEP
BLOCKING

 Membran memiliki kemampuan untuk mengikat protein dalam hal ini target dan
antibodi adalah protein sehingga ada beberapa ikatan yang tidak diinginkan.
 Pemblokiran pengikatan non-spesifik dicapai dengan menempatkan membran
dalam larutan protein encer - biasanya Bovine serum albumin (BSA) dengan
persentase deterjen kecil seperti Tween 20.
 Protein dalam larutan encer melekat pada membran di semua tempat. di mana
protein target belum melekat. Jadi, ketika antibodi ditambahkan, tidak ada ruang
pada membran untuk dilampirkan selain di situs pengikatan protein target
spesifik
DETECTION
Ada dua langkah untuk mendeteksi protein
 Antibodi Primer
- Setelah pemblokiran, larutan encer antibodi primer (umumnya antara 0,5 dan 5
mikrogram / mL) diinkubasi dengan membran di bawah agitasi lembut.
- Solusi terdiri dari larutan salin buffer dengan persentase kecil deterjen, dan
kadang-kadang dengan susu bubuk.
- Solusi antibodi dan membran dapat disegel dan diinkubasi bersama selama 30
menit hingga semalam
FOURTH STEP
DETECTION

 Antibodi Sekunder
- Setelah membilas membran untuk menghilangkan antibodi primer
yang tidak terikat, membran tersebut terkena antibodi lain, diarahkan
pada bagian spesifik spesies dari antibodi primer.
- Beberapa antibodi sekunder akan mengikat satu antibodi primer dan
meningkatkan sinyal
FIFTH STEP
ANALYSIS

Deteksi Kalorimetri
 Metode deteksi kolorimetri tergantung pada inkubasi western blot
dengan substrat yang bereaksi dengan enzim reporter (seperti
peroksidase)
Deteksi Chemiluminescent
 Metode deteksi chemiluminescent bergantung pada inkubasi western
blot dengan substrat yang akan bercahaya saat terpapar oleh reporter
pada antibodi sekunder.
ANALYSIS

Deteksi Radioaktif
 Label radioaktif tidak memerlukan substrat enzim, melainkan
memungkinkan penempatan film sinar-X medis secara langsung
terhadap western blot yang berkembang ketika terkena label dan
menciptakan daerah gelap yang sesuai dengan pita protein interes.
WESTERN BLOT ANALYSIS
APPLICATIONS
 Tes konfirmasi HIV menggunakan western blot untuk mendeteksi
antibodi anti-HIV dalam sampel serum manusia.
 Protein dari sel yang diketahui terinfeksi HIV dipisahkan dan
dihilangkan pada membran seperti di atas. Kemudian, serum yang
akan diuji diterapkan pada langkah inkubasi antibodi primer; antibodi
bebas dihanyutkan, dan antibodi anti-manusia sekunder yang
dihubungkan dengan ditambahkan sinyal enzim.
 Pita bernoda kemudian menunjukkan protein yang mengandung
serum antibodi pasien.
 Western blot juga dapat digunakan sebagai tes konfirmasi untuk
infeksi Hepatitis B
KELEBIHAN

 Analisis Western blot dapat menganalisis sampel protein apa pun baik dari sel
atau jaringan, tetapi juga dapat menganalisis protein rekombinan yang disintesis
secara in vitro. Western blot tergantung pada kualitas antibodi yang digunakan
untuk menyelidiki protein yang diminati, dan seberapa spesifik untuk protein ini.
 Sementara ELISA menjadi tes yang tidak spesifik, Western blotting adalah tes
yang lebih spesifik untuk mendeteksi HIV. Ini dapat mendeteksi satu protein
dalam campuran protein sambil memberikan informasi tentang ukuran protein
sehingga lebih spesifik.
 Dapat memberi tahu berapa banyak protein yang terakumulasi dalam sel
KEKURANGAN

 Jika protein terdegradasi dengan cepat, Western blotting tidak akan

mendeteksinya dengan baik.
 Tes ini memakan waktu lebih lama dari tes lain yang ada. Mungkin
juga lebih mahal
 KELOMPOK 7

IMUNOPCR
1. ARASWATI NURUL SYIFA
2. NORMA MIFTAHUL JANNAH
3. RINA ANGGRAINI
 PENGERTIAN

Immuno-PCR adalah sistem deteksi antigen

dengan peningkatan sinyal eksponensial dari PCR, di
mana reaksi rantai polimerase (PCR) digunakan untuk
memperkuat segmen penanda DNA yang telah
melekat secara khusus pada kompleks antigen-
antibodi. Ini berarti menggabungkan keuntungan dari
ELISA dan PCR untuk mendeteksi antigen.
 Antibodi
spesifik diberi
label dengan
penanda DNA.
Dengan menggunakan langkah-
langkah amplifikasi PCR,
sensitivitas dapat lebih baik
dibandingkan dengan ELISA
"klasik"
SIAPA YANG MENGEMBANGKAN METODE
INI ?

Metode ini dikembangkan oleh Sano, T., Smith,

C. L. & Cantor, C. R. pada (1992). Penelitian
mereka dipublikasikan dalam jurnal sains.
Nama penelitian ini adalah ((Immuno-PCR:
deteksi antigen yang sangat sensitif dengan
konjugat antibodi-DNA spesifik))
 KONSEP I-PCR

Konsep immuno-PCR (reaksi berantai polimerase),

diilustrasikan pada Gambar. 1, cukup sederhana, dan mirip
dengan (ELISA) dan radioimmunoassays (RIA).

 Dalam skema immuno-PCR asli, sebuah penghubung

molekuler, yang memiliki afinitas pengikatan bispecific
untuk antibodi dan DNA, digunakan untuk melampirkan
molekul penanda DNA khusus untuk kompleks antigen -
antibodi.
 Segmen DNA penanda terlampir diamplifikasi oleh PCR
dengan primer yang sesuai, dan produk PCR yang
dihasilkan dianalisis.
 Kehadiran produk PCR spesifik menunjukkan bahwa
molekul DNA penanda melekat secara khusus pada
kompleks antigen-antibodi, menunjukkan adanya antigen.
 PERBEDAAN ANTARA ELISA DAN PCR

Immuno-PCR didasarkan pada prinsip yang sama dengan

ELISA:

 Capture of antigen (langsung di piring atau tidak

langsung oleh molekul tangkapan)
 Pengakuan antigen oleh antibodi deteksi
 Pengungkapan kompleks antigen / antibodi
 Perbedaannya adalah bahwa dalam kasus immuno -PCR,
deteksi kompleks antigen / antibodi dilakukan
menggunakan reporter DNA dan bukan enzim.
 Juga teknologi immuno-PCR memiliki sensitivitas lebih
besar dari ELISA
 Immuno-PCR menyediakan teknologi
ultrasensitif yang menggabungkan spesifisitas
molekul antibodi dengan sensitivitas PCR.

 Penggunaan reporter DNA memungkinkan

untuk melakukan langkah amplifikasi sinyal
dengan amplifikasi PCR, yang tidak mungkin
dicapai dalam kasus sistem ELISA. Ini
membawa peningkatan sensitivitas 10 hingga
1000 kali jika dibandingkan dengan ELISA
klasik.

 Peningkatan sensitivitas ini bisa sangat

berguna misalnya dalam kasus sampel yang
sangat encer.
HIMPUNAN 1

menangkap antiboy yang

teradsorpsi ke permukaan
sumur
Semua komponen
ditambahkan secara
bertahap
hubungan streptavidin-
biotin antara antibodi
deteksi dan DNA
6 langkah inkubasi dan
cuci
HIMPUNAN 2

menangkap antibodi
yang diserap ke
permukaan sumur
konjugasi kovalen
antara antibodi deteksi
dan label DNA
3 langkah inkubasi
dan mencuci
HIMPUNAN 3

hubungan streptavidin-
biotin untuk mengikat
antibodi penangkap
konjugasi kovalen
antara antibodi deteksi
dan label DNA
2 langkah inkubasi
dan mencuci
LANGKAH-LANGKAH UTAMA UJI IMMUNO-PCR
ADALAH SEBAGAI BERIKUT:

 Imobilisasi antibodi spesifik untuk target protein ke

permukaan pembuluh darah
 Mencuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak
terikat
 Penambahan sampel
 Cuci untuk menghapus sampel yang tidak terikat
 Penambahan antibodi spesifik kedua, digabungkan
ke molekul DNA
 Mencuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak
terikat
 Amplifikasi dan deteksi DNA
 KEUNTUNGAN IMMUNO-PCR:

Sensibilitas meningkat secara dramatis

dibandingkan dengan ELISA klasik
Kemungkinan untuk diukur
Volume dan jumlah yang dikurangi
Tidak ada kekhususan yang hilang
 MANFAAT IPCR

ilmu biologi dan biomedis seperti diagnosa,

toksin, sitokin, hormon..etc
metode ampuh untuk mendeteksi antigen
protein dalam jumlah rendah.
diagnostik mikroba.
Imunohistokimia
• ARASWATI NURUL SYIFA
• NORMA MIFTAHUL JANNAH
• RINA ANGGRAINI
Pengertian
Imunohistokimia (IHC) merupakan proses mendeteksi antigen
(misalnya protein) dalam sel dari bagian jaringan dengan
memanfaatkan prinsip antibodiyang mengikat secara khusus
untuk antigen dalam jaringan biologis. IHC berasaldari kata
"immuno", yaitu antibodi yang digunakan dalam prosedur, dan
"histo,"yang berarti jaringan (dibandingkan dengan
immunocytochemistry). Prosedur inidikonsep dan pertama kali
dilaksanakan oleh Albert Coons pada tahun 1941.Pewarnaan
imunohistokimia secara luas digunakan dalam diagnosissel
abnormal seperti yang ditemukan pada tumor kanker.
Imunohistokimia juga banyak digunakan dalam penelitian dasar
untuk memahami distribusi dan lokalisasi biomarker dan
proteinyang diekspresikan secara berbeda di berbagai bagian
dari jaringan biologis.
Metode Pewarnaan Imunohistokimia

 Prinsip : Prinsip dari metode imunohistokimia adalah

perpaduan antara reaksiimunologi dan kimiawi, dimana
reaksi imunologi ditandai adanya reaksi antaraantigen
dengan antibodi, dan reaksi kimiawi ditandai adanya reaksi
antara enzimdengan substrat.
 Tujuan : untuk mengenali bahanspesifik tertentu didalam
jaringan dengan menggunakan antibodi dan sistemdeteksi
yang memungkinkan untuk mengenali bahan spesifik
tersebut secara visual.
Pewarnaan Imunohistokimia terbagi 2
metode
 Metode Direct

 Metode Indirect
Metode Direct

 Metode langsung (direct method) merupakan metode

pengecatan satu langkah karena hanya melibatkan 1
jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya
antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC)
atau rodhamin
 Prinsip : menggunakan antibodi primer yang sudah
terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target
secara langsung.
 Adapun cara pewarnaannya adalah sebagai berikut :
• Persiapan reagen : • Cara kerja :
o H2O2 3% (digunakan untuk Lakukan deparafinisasi, caranya adalah
menghilangkan aktifitas endogenous dengan memasukkan sayatan jaringan
peroksidase). berturut – turut kedalam :
o Trypsin 0,025% dalam PBS (digunakan 1. xylol : 2 menit
untuk membersihkan debris protein
2. xylol : 2 menit
yang kemungkinan menutup epitope
dari bahan yang akan dideteksi). 3. etanol absolute : 1 Menit
o Larutan kerja DAB (digunakan sebagai 4. etanol absolute : 1 menit
indicator warna pada reaksi enzimatik). 5. etanol 95% : 1 menit
o R/ Aquadestilata 1 ml 6. etanol 95% : 1 menit
o Buffer substrat H2O2 50 tetes 7. etanol 80% : 1 menit
o Larutan DAB stok 1 tetes 8. etanol 70% : 1 menit
9. air mengalir : 10-15 menit
10.Masukkan kedalam larutan H2O2 30% : 30
menit
Lanjutan cara kerja
11. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12. Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13. Cuci dengan PBS (a : 2 menit)
14. Masukkan kedalam antibodi monoklonal dilabel enzim (misalnya untuk
mendeteksi IgG pada mencit, maka monoklonal antibodi yang dilabel
dengan enzim adalah IgG anti mencit) : 30 menit
15. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
16. Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
17. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
18. Cuci dengan aquadestilata
19. Masukkan ke dalam Mayer’s Haematoksilin : 6 menit
20. Cuci dengan air mengalir, sampai bersih
22. Dehidrasi – Clearing – Mounting
Metode Indirect

 Pada metode imunohistokimia indirect, antibodi monoklonal

yang digunakanuntuk mendeteksi suatu marker pada sel,
tidak dilabel dengan suatu enzim.Antibodi ini dikenal dengan
sebutan antibodi primer.
 Prinsip : menggunakan antibodi primer yang tidak ada
labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang
sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari
antibodi primer.
 Adapun caranya adalah sebagai berikut :
• Persiapan reagen :
o H2O2 3%Trypsin 0,025% dalam
PBS
o Larutan kerja DAB
o R/ Aquadestilata 1 ml
o Buffer substrat H2O2 50 tetes
o Larutan DAB stok 1 tetes
• Cara kerja :
Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan
sayatan jaringan berturut-turut kedalam :
1. xylol : 2 menit
2. xylol : 2 menit
3. etanol absolute : 1 menit
4. etanol absolute : 1 menit
5. etanol 95% : 1 menit
6. etanol 95% : 1 menit
7. etanol 80% : 1 menit
8. etanol 70% : 1 menit
9. air mengalir : 10-15 menit
10. Masukkan kedalam larutan H2O2 3% : 30 menit
11. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12. Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13. Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
Lanjutan Cara kerja
14. Masukkan kedalam monoclonal antibodi / antibodi primer. Apabila ingin
mendeteksi IgG pada mencit, maka antibodi primer yang digunakan adalah IgG
anti mencit (misalnya rat anti mous = 1:5) : 30 menit
15. Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
16. Masukkan kedalam sekunder antibodi (oleh karena primer antibodi yang
digunakan pada tulisan ini menggunakan rat anti mous, maka sekunder antibodi
yang digunakan dapat berupa rabbit anti rat peroksidase label) : 30 menit.
17. Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
18. Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
19. Cuci dengan PBS 3 kali ( a : 2 menit
), kemudian dibilas dengan aquadestilata
20. Masukkan kedalam Mayer’s Hematoxylin : 6 menit
21. Cuci dengan air mengalir
22. Dehidrasi – Clearing - Mounting
Interpretasi Hasil

 Negatif : Tidak ada matriks mesangial yang terwarnai

 Positif 1 : 25% dari matriks mesangial terdapat warna pengecatan pada
tuft glomerulus.
 Positif 2 :25% 50% dari tuft glomerulus terwarnai
 Positif 3 : 50% - 75% dari tuft glomerulus terwarnai
 Positif 4 :>75% dari tuft glomerulus terwarnai