PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RETRIKSI

Nama : Iqbal Auni Rahman

NIM : B1A018105
Rombongan : I
Kelompok : 2
Asisten : Bramassetyo Aji

LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2020
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah mengetahui perbedaan pola potongan
DNA genom menggunakan enzim retriksi EcoRI.

B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan pada acara praktikum kali ini adalah DNA
sampel kedelai (detap dan grobogan), DNA plasmid pUC19, Enzim EcoRI, buffer
enzim dan ddH2O.
Alat-alat yang digunakan pada acara praktikum kali ini adalah mikropipet
dan tip, mesin vortex, waterbath, microtube, seperangkat elektroforesis.

C. Prosedur Kerja

Larutan ddH2O dimasukkan ke dalam microtube

sebanyak 43 mikrolit.

Buffer enzim dimasukan ke dalam tube sebanyak

16 mikrolit.

Enzim EcoRI dimasukan ke dalam tube sebanyak

1 mikrolit

Retriksi mix dimasukan ke dalam 3 tube kosong

yang berbeda, 2 untuk sampel tanamn dan 1 untuk
plasmid masing-masing 15 mikrolit.

Ketiga tube ditandai (Drt, Grt, pUC)

Sampel dimasukan sebanyak 20 mikrolit ke dalam

tube Drt yang berisi retriksi mix
Sampel dimasukan sebanyak 20 mikrolit ke dalam
tube Grt yang berisi retriksi mix

Plasmid pUC dimasukan kedalam tube pUC yang

berisi retriksi mix sebanyak 1 mikrolit
D. Hasil dan Pembahasan

Langkah pertama yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah

memasukkan larutan ddH2O ke dalam microtube sebanyak 43 mikrolit seperti
pada Gambar 1. Fungsi dari larutan ddH2O adalah sebagai larutan pengencer atau
pelarut (Nugroho et al., 2019).

  
Gambar 1. Proses larutan ddH2O dimasukkan ke dalam microtube.
Langkah selanjutnya memasukan buffer enzim ke dalam tube sebanyak 16
mikrolit seperti pada gambar 2. Menurut Indah et al. (2017), larutan buffer yang
ditambahkan untuk mempertahankan pH dan menyediakan lingkungan yang
cocok untuk stabilitas enzim.

  
Gambar 2. Buffer enzim dimasukkan ke dalam tube
Langkah berikutnya memasukkan enzim EcoRI ke dalam tube sebanyak 1
mikrolit seperti pada Gambar 3. Enzim EcoRI yaitu enzim yang didapat dari
bakteri E.coli, enzim ini secara spesifik mengenali enam urutan nukleotida (GAA-
TTC dan CTT-AAG) yang kemudian memotong daerah spesifik pada G-A dan A-
G, yang nantinya akan membentuk ujung potongan stiky ends (Setyawan et al.,
2019). 
   
Gambar 3. Enzim EcoRI dimasukkan ke dalam tube
Setelah itu memasukan retriksi mix ke dalam 3 tube kosong, masing-masing
sebanyak 15 mikrolit untuk 2 sampel tanaman dan 1 plasmid seperti pada Gambar
4. Fungsi retriksi mix ini adalah memudahkan pengambikan volume larutan yang
sangat kecil. 

   
Gambar 4. Retriksi mix dimasukkan ke dalam 3 tube kosong
Selanjutnya ketiga tube diberi tanda (Drt, Grt, pUC) seperti pada gambar 5.

  
Gambar 5. Menandai ketiga tube
Langkah berikutnya memasukan sampel (Kedelai Detap) ke dalam tube Drt yang
telah terisi retriksi mix sebanyak 20 mikrolit seperti pada gambar 6.

  
Gambar 6. Sampel dimasukkan ke dalam tube Drt yang telah terisi retriksi mix
Selanjutnya memasukan sampel (Kedelai Detap) kedalam tube Grt yang telah
terisi retriksi mix sebanyak 20 mikrolit seperti pada gambar 7.

  
Gambar 7. Sampel dimasukkan ke dalam tube Grt yang telah terisi retriksi mix
Langkah terakhir memasukan plasmid pUC kedalam tube pUC yang telah terisi
retriksi mix sebanyak 1 mikrolit seperti pada gambar 8.

  
Gambar 8. Plasmid pUC dimasukkan ke dalam tube pUC
 
Enzim restriksi disebut juga sebagai “gunting biologi”. Enzim restriksi yang
digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotomg DNA asing
agar urutan basanya bisa sesuai, sehingga antara plasmid dan DNA asing yang
disisipkan bisa bersatu. Enzim endonuklease restriksi ini diisolasi dari bakteri
merupakan enzim yang dapat memotong ikatan fosfodiester untai DNA asing
pada sekuen pengenalan yang spesifik. Sekuen pengenalan spesifik enzim restriksi
ini berkisar antara 6-8 bp, dinamakan palindrom dengan sekuen pengenalan
spesifik yaitu 5’GAATTC3’ dan 3’CTTAAG5’. Prinsip kerja enzim restriksi
adalah yang digunakan merupakan enzim endonuklease restriksi, enzim pemotong
ini mengenali DNA pada situs pengenalan dan memotong pada situs tersebut,
situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah pengenalan yang simetri dengan
palindrom, artinya bila kedua untai DNA tersebut masing-masing dibaca dengan
arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya, dan
pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung
kohesif/lancip (sticky end) dan ujung rata/tumpul (blunt end) (Nugroho & Rahayu,
2018).
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi menghasilkan 2 jenis ujung
potongan yaitu potongan berujung rata (blunt end) dan potongan berujung tidak
rata atau kohesif (sticky end). Pada ujung rata, dua untai molekul dipotong pada
posisi yang sama yaitu tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan dan bagian
akhirnya rata. Sedangkan ujung kohesif diperoleh jika setiap molekul DNA
dipotong pada posisi tidak sama pada salah satu untai menggantung dengan
beberapa nukleotida. Akhirnya single strand yang tidak rata dapat berpasangan
secara spontan (Prihanto & Jaziri, 2019). Enzim restriksi yang memotong pada
pusat simetri atau pusat palindrom akan menghasilkan potongan berujung rata
atau tumpul, misal pada enzim PvuII, AluI, HaeIII, sedangkan enzim yang
memotong di luar pusat simetri menghasilkan potongan berujung kohesif atau
lancip, misal pada enzim EcoRI, BamHI, dan Sau3A (Gusriana, 2018).
Ada beberapa faktor yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan
dengan enzim restriksi (enzyme digestion) yaitu penggunaan jumlah DNA, enzim,
dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Penggunaan jumlah
DNA penting karena semakin banyak DNA yang dipakai maka enzim yang
digunakan juga semakin banyak. Penggunaan buffer yang sesuai dapat mencegah
perubahan suhu yang ekstrem dan menjaga enzim di lingkungan optimalnya.
Suatu enzim restriksi memerlukan kondisi optimal untuk melakukan pemotongan
DNA secara sempurna dan mampu menghasilkan fragmen restriksi yang sesuai.
Kondisi optimal tersebut meliputi pH buffer, temperatur digesti, waktu digesti,
dan konsentrasi garam dari buffer yang digunakan (Putri et al., 2017). Metilasi
DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA
harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, atau garam yang
berlebih yang seringkali ikut terbawa dan dapat menghambat kerja beberapa
enzim dalam reaksi (Nugroho et al., 2017).
 DAFTAR REFERENSI

Gusriana, 2018. Genetika dan Reproduksi Ikan. Yogyakarta: Deepublish.

Indah, Mappiratu & Musafira, 2017. Produksi Enzim Lipase dari Aspergillus niger
Isolat Kapang Kopra dengan Menggunakan Medium Kelapa Parut. Kovalen,
3(3), pp. 269-276.

Nugroho, E. D. & Rahayu, D. A., 2018. Pengantar Bioteknologi (Teori dan

Aplikasi). Yogyakarta: Deepublish.

Nugroho, K., Terryana, R. T. & Lestari, P., 2017. Metode Eksraksi DNA Cabai
(Capsicum annuum L.) Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB (Cethyl
Trimethyl Ammonium Bromide) Tanpa Nitrogen Cair. Scripta Biologica,
4(2), pp. 91-94.

Nugroho, K., Terryana, R. T., Reflinur & Lestari, P., 2019. Metode Ekstraksi DNA
Tanaman Tanpa Presipitasi Etanol untuk Kegiatan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia, 6(1), pp. 29-38.

Prihanto, A. A. & Jaziri, A. A., 2019. Bioteknologi Perikanan & Kelautan. Malang:
UB Press.

Putri, I. A. R. D. N., Yowani, S. C. & Wirajana, I. N., 2017. Optimasi Digesti Enzim
Restriksi SacII Pada Isolat Mycobacterium tuberculosis H37Rv untuk
Deteksi Mutasi Promoter inhA Pada Kasus MDR-TB dengan Metode PCR-
RFLP. Jurnal Metamorfosa, 4(1), pp. 87-93. 

Setyawan, E., Martasari, C. & Basuki, N., 2019. Optimasi Enzim Retriksi (EcoRI,
HINDIII,TASI) dalam Metode CAPS (Cleaved Amplifid Polymorphics
Sequence) dengan Menggunakan Narka MTSSR Untuk Identifikasi Genetik
Populasi Jeruk F1 Hasil Fusi Protoplasma. Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian,
15(1), pp. 102-110.