Gen Terganggu pada Eukariota: Ekson dan Intron

Sebagian besar gen prokariota yang dikarakterisasi dengan baik terdiri dari rangkaian
pasangan nukleotida yang terus menerus, yang menentukan urutan kolinear asam amino dalam
produk gen polipeptida. Namun, pada tahun 1977, analisis molekuler dari tiga gen eukariotik
menghasilkan kejutan besar. Penelitian terhadap gen tikus dan kelinci -globin (salah satu dari
dua protein berbeda dalam hemoglobin) dan gen ovalbumin ayam (protein penyimpan telur)
mengungkapkan bahwa mereka mengandung urutan nonkode yang mengintervensi urutan
kode. Mereka kemudian ditemukan di daerah beberapa gen yang tidak diterjemahkan. Mereka
disebut intron (untuk urutan intervening.) Urutan yang tetap ada dalam molekul mRNA dewasa
(baik urutan pengkodean dan nonkode) disebut ekson (untuk urutan yang diekspresikan).
Beberapa bukti paling awal untuk intron pada gen -globin mamalia dihasilkan dari visualisasi
hibrid DNA-mRNA genom dengan mikroskop elektron. Karena dupleks DNA-RNA lebih stabil
daripada heliks ganda DNA, ketika heliks ganda DNA yang terdenaturasi sebagian diinkubasi
dengan molekul RNA homolog dalam kondisi yang sesuai, untai RNA akan berhibridisasi
dengan untai DNA komplementer, menggantikan untai DNA yang setara (Gambar 11.19a) ).
Struktur hibrid DNA-RNA yang dihasilkan akan mengandung daerah untai tunggal DNA yang
disebut R-loop, di mana molekul RNA telah menggantikan untaian DNA untuk membentuk
daerah dupleks DNA-RNA. Loop-R ini dapat divisualisasikan secara langsung dengan
mikroskop elektron.
Ketika Shirley Tilghman, Philip Leder, dan rekannya menghibridisasi mRNA tikus -globin yang
dimurnikan menjadi molekul DNA yang mengandung gen -globin tikus, mereka mengamati dua
R-loop yang dipisahkan oleh loop DNA untai ganda (Gambar 11.19b). Hasilnya menunjukkan
adanya sekuens pasangan nukleotida di tengah gen -globin yang tidak terdapat dalam -globin
mRNA dan, oleh karena itu, tidak menyandikan asam amino dalam polipeptida -globin. Ketika
Tilghman dan rekan kerja mengulangi eksperimen R-loop menggunakan transkrip gen -globin
yang dimurnikan yang diisolasi dari nuklei dan diyakini sebagai transkrip gen primer atau
molekul pra-mRNA, sebagai pengganti mRNA sitoplasma -globin, mereka hanya mengamati
satu R-loop (Gambar 11.19) c). Hasil ini menunjukkan bahwa transkrip primer berisi urutan gen
struktural lengkap, termasuk ekson dan intron. Bersama-sama, hasil R-loop yang diperoleh
dengan mRNA sitoplasma dan pre-mRNA nuklir menunjukkan bahwa sekuens intron dipotong
dan sekuens ekson disambung bersama selama peristiwa pemrosesan yang mengubah
transkrip primer menjadi mRNA matang.
Tilghman dan rekan kerja mengkonfirmasi interpretasi mereka terhadap hasil R-loop dengan
membandingkan urutan gen -globin tikus dengan urutan asam amino yang diprediksi dari
-globin polipeptida. Hasilnya menunjukkan bahwa gen tersebut mengandung intron tanpa kode
pada posisi ini dalam gen tersebut. Penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa gen tikus -globin
sebenarnya mengandung dua intron. Untuk detail studi ini dan informasi tambahan tentang
penemuan intron, lihat Tonggak Sejarah dalam Genetika: Introns di situs Student Companion.

BEBERAPA GEN EUKARIOT YANG SANGAT BESAR

Setelah studi perintis pada gen globin mamalia dan gen ovalbumin ayam (lihat Milestone di
situs Student Companion), intron nonkode telah dibuktikan dalam sejumlah besar gen
eukariotik. Faktanya, gen terputus jauh lebih umum daripada gen tak terputus pada hewan dan
tumbuhan tingkat tinggi. Misalnya, gen Xenopus laevis yang mengkode vitellogenin A2 (yang
berakhir sebagai protein kuning telur) mengandung 33 intron, dan gen kolagen 12 ayam
mengandung setidaknya 50 intron. Gen kolagen mencakup 37.000 pasangan nukleotida tetapi
menghasilkan molekul mRNA yang panjangnya hanya sekitar 4600 nukleotida. Gen lain
mengandung intron yang relatif sedikit, tetapi beberapa intron berukuran sangat besar.
Misalnya, gen Ultrabithorax (Ubx) dari Drosophila mengandung intron yang panjangnya kira-kira
70.000 pasang nukleotida. Gen terbesar yang dikarakterisasi hingga saat ini adalah gen DMD
manusia, yang menyebabkan distrofi otot Duchenne jika tidak berfungsi karena mutasi. Gen
DMD mencakup 2,5 juta pasangan nukleotida dan mengandung 78 intron.
Meskipun intron ada di sebagian besar gen hewan dan tumbuhan tingkat tinggi, intron tidak
esensial karena tidak semua gen mengandung intron. Gen histon bulu babi dan empat gen
kejutan panas Drosophila termasuk di antara gen hewan pertama yang terbukti tidak memiliki
intron. Kita sekarang tahu bahwa banyak gen hewan dan tumbuhan tingkat tinggi tidak memiliki
intron.

INTRON: SIGNIFIKANSI BIOLOGIS?

Saat ini, para ilmuwan hanya mengetahui sedikit tentang signifikansi biologis dari struktur
ekson-intron gen eukariotik. Intron memiliki ukuran yang sangat bervariasi, mulai dari sekitar 50
pasangan nukleotida hingga ribuan pasangan nukleotida. Fakta ini telah menimbulkan spekulasi
bahwa intron mungkin berperan dalam mengatur ekspresi gen. Meskipun tidak jelas bagaimana
intron mengatur ekspresi gen, penelitian baru menunjukkan bahwa beberapa intron
mengandung sekuens yang dapat mengatur ekspresi gen baik secara positif maupun negatif.
Intron lain mengandung promotor spesifik jaringan alternatif; yang lain lagi berisi urutan yang
meningkatkan akumulasi transkrip. Fakta bahwa intron mengakumulasi mutasi baru jauh lebih
cepat daripada ekson menunjukkan bahwa banyak dari sekuens pasangan nukleotida spesifik
intron, tidak termasuk ujungnya, tidak terlalu penting.
Dalam beberapa kasus, ekson gen yang berbeda mengkodekan domain fungsional yang
berbeda dari produk gen protein. Hal ini paling jelas terlihat dalam kasus gen yang mengkode
rantai antibodi berat dan ringan (lihat Gambar 20.17). Dalam kasus gen globin mamalia, ekson
tengah mengkodekan domain pengikat heme protein. Ada spekulasi yang cukup besar bahwa
struktur ekson-intron gen eukariotik dihasilkan dari evolusi gen baru melalui fusi gen leluhur tak
terputus (ekson tunggal). Jika hipotesis ini benar, intron mungkin hanyalah peninggalan dari
proses evolusi.
Alternatifnya, intron dapat memberikan keuntungan selektif dengan meningkatkan laju urutan
pengkodean dalam ekson yang berbeda dari suatu gen dapat menyusun kembali dengan
rekombinasi, sehingga mempercepat proses evolusi. Dalam beberapa kasus, cara alternatif
untuk menyambung transkrip menghasilkan keluarga protein terkait. Dalam kasus ini, intron
menghasilkan banyak produk dari satu gen. Penyambungan alternatif transkrip troponin T tikus
diilustrasikan pada Gambar 19.2. Dalam kasus gen mitokondria dari ragi yang mengkode
sitokrom b, intron mengandung ekson dari gen yang mengkode enzim yang terlibat dalam
pemrosesan transkrip utama gen tersebut. Jadi, intron yang berbeda mungkin memang
memainkan peran yang berbeda, dan banyak intron mungkin tidak memiliki signifikansi biologis.
Karena banyak gen eukariotik tidak mengandung intron, daerah nonkode ini tidak diperlukan
untuk ekspresi gen normal.
Penghapusan Urutan Intron dengan RNA Splicing

Kebanyakan gen nuklir yang mengkode protein dalam eukariota multiseluler mengandung
intron. Lebih sedikit, tapi masih banyak, dari gen eukariota uniseluler seperti ragi mengandung
intron. Gen archaea langka dan beberapa virus prokariota juga mengandung intron. Dalam
kasus gen yang “terbelah” ini, transkrip primer berisi seluruh urutan gen, dan sekuens intron
dipotong selama pemrosesan RNA (lihat Gambar 11.12). Untuk gen yang menyandikan protein,
mekanisme penyambungan harus tepat; ia harus menggabungkan urutan ekson dengan
akurasi ke nukleotida tunggal untuk memastikan bahwa kodon dalam ekson distal ke intron
dibaca dengan benar (Gambar 11.20). Akurasi pada tingkat ini tampaknya membutuhkan sinyal
penyambungan yang tepat, mungkin sekuens nukleotida dalam intron dan pada persimpangan
ekson-intron. Namun, dalam transkrip utama gen inti, satu-satunya urutan yang dikonservasi
sepenuhnya dari intron yang berbeda adalah urutan dinukleotida di ujung intron, yaitu,

Urutan yang ditunjukkan di sini adalah untuk untai bukan template DNA (setara dengan
transkrip RNA, tetapi dengan T daripada U). Selain itu, ada urutan konsensus singkat di
persimpangan ekson-intron. Untuk gen nuklir, persimpangan konsensus adalah

Subskrip numerik menunjukkan frekuensi persentase dari basis konsensus di setiap posisi;
dengan demikian, 100 subskrip menunjukkan bahwa basis selalu ada pada posisi itu. N dan Py
menunjukkan bahwa salah satu dari empat nukleotida standar atau pirimidin, masing-masing,
mungkin ada pada posisi yang ditunjukkan. Persimpangan ekson-intron berbeda untuk gen
tRNA dan gen struktural di mitokondria dan kloroplas, yang menggunakan mekanisme
penyambungan RNA yang berbeda. Namun, spesies yang berbeda menunjukkan beberapa
konservasi sekuens di persimpangan ekson-intron.
Penelitian terbaru menunjukkan bahwa splicing dan intron sequence dapat mempengaruhi
ekspresi gen. Bukti langsung pentingnya mereka telah disediakan oleh mutasi di situs-situs ini
yang menyebabkan fenotipe mutan pada banyak eukariota berbeda. Memang, mutasi semacam
itu terkadang bertanggung jawab atas penyakit bawaan pada manusia, seperti kelainan
hemoglobin.
Penemuan intron noncoding dalam gen merangsang minat yang kuat pada mekanisme yang
dengannya sekuens intron dihilangkan selama ekspresi gen. Demonstrasi awal bahwa sekuens
intron pada gen eukariotik ditranskripsikan bersama dengan sekuens ekson yang memfokuskan
penelitian pada pemrosesan transkrip gen primer. Sama seperti sistem in vitro yang
memberikan informasi penting tentang mekanisme transkripsi dan translasi, kunci untuk
memahami peristiwa penyambungan RNA adalah pengembangan sistem penyambungan in
vitro. Dengan menggunakan sistem ini, para peneliti telah menunjukkan bahwa ada tiga jenis
eksisi intron yang berbeda dari transkrip RNA.
1. Intron prekursor tRNA dieksisi dengan pembelahan endonukleolitik yang tepat dan reaksi
ligasi yang dikatalisis oleh aktivitas endonuklease dan ligase penyambungan khusus.
2. Intron dari beberapa prekursor rRNA dihilangkan secara autokatalitik dalam reaksi unik yang
dimediasi oleh molekul RNA itu sendiri. (Tidak ada aktivitas enzimatik protein yang terlibat.)
3. Transkrip intron dari nukleus pra-mRNA (hnRNA) disambung dalam reaksi dua langkah yang
dilakukan oleh partikel ribonukleoprotein kompleks yang disebut spliceosom.
Ketiga mekanisme eksisi intron ini dibahas dalam tiga bagian berikut. Ada mekanisme lain
untuk eksisi intron, tetapi untuk singkatnya mekanisme tersebut tidak dibahas di sini.

tRNA PRECURSOR SPLICING: KEGIATAN NUKLEASE DAN LIGASE UNIK

Reaksi penyambungan prekursor tRNA telah dikerjakan secara rinci dalam ragi Saccharomyces
cerevisiae. Baik sistem penyambungan in vitro dan mutan penyambungan sensitif suhu telah
digunakan dalam membedah mekanisme penyambungan tRNA di S. cerevisiae. Eksisi intron
dari prekursor tRNA ragi terjadi dalam dua tahap. Pada tahap I, endonuklease splicing terikat
membran inti membuat dua pemotongan tepat di ujung intron. Kemudian, pada tahap II, ligase
penyambungan bergabung dengan dua bagian tRNA untuk menghasilkan bentuk molekul tRNA
yang matang. Kekhususan untuk reaksi ini terletak pada fitur tiga dimensi prekursor tRNA yang
dilestarikan, bukan pada urutan nukleotida itu sendiri.

PENCIPTAAN OTOKATALITIK

Tema umum dalam biologi adalah bahwa metabolisme terjadi melalui sekuens reaksi
enzimekatalisis. Enzim yang sangat penting ini umumnya adalah protein, terkadang polipeptida
tunggal dan terkadang heteromultimer kompleks. Terkadang, enzim membutuhkan kofaktor
nonprotein untuk menjalankan fungsinya. Ketika ikatan kovalen diubah, biasanya diasumsikan
bahwa reaksi sedang dikatalisis oleh enzim. Dengan demikian, penemuan tahun 1982 oleh
Thomas Cech dan rekan kerjanya bahwa intron dalam prekursor rRNA Tetrahymena
thermophila dipotong tanpa keterlibatan aktivitas katalitik protein cukup mengejutkan. Namun,
sekarang dengan jelas ditetapkan bahwa aktivitas penyambungan yang mengeluarkan intron
dari prekursor rRNA ini bersifat intrinsik ke molekul RNA itu sendiri. Memang, Cech dan Sidney
Altman berbagi Penghargaan Nobel Kimia tahun 1989 atas penemuan RNA katalitik mereka.
Selain itu, aktivitas self-splicing atau autocatalytic telah terbukti terjadi pada prekursor rRNA dari
beberapa eukariota yang lebih rendah dan dalam sejumlah besar prekursor rRNA, tRNA, dan
mRNA dalam mitokondria dan kloroplas dari banyak spesies berbeda. Dalam kasus banyak
intron ini, mekanisme sambung sendiri sama atau sangat mirip dengan yang digunakan oleh
prekursor Tetrahymena rRNA (lihat Gambar 11.21). Bagi yang lain, mekanisme sambung
sendiri mirip dengan mekanisme penyambungan yang diamati dengan prekursor mRNA inti,
tetapi tanpa keterlibatan spliceosom (lihat bagian selanjutnya).
Eksisi autokatalitik intron dalam prekursor Tetrahymena rRNA dan intron tertentu lainnya tidak
memerlukan sumber energi eksternal dan tidak ada aktivitas katalitik protein. Sebaliknya,
mekanisme penyambungan melibatkan serangkaian transfer ikatan fosforester, tanpa ikatan
yang hilang atau diperoleh dalam prosesnya. Reaksi membutuhkan nukleosida guanin atau
nukleotida dengan gugus 3-OH bebas (GTP, GDP, GMP, atau guanosin semuanya bekerja)
sebagai kofaktor ditambah kation monovalen dan kation divalen. Persyaratan untuk G-3-OH
adalah mutlak; tidak ada basa lain yang dapat disubstitusi dalam nukleosida atau kofaktor
nukleotida. Intron dipotong dengan menggunakan dua transfer ikatan fosforester, dan intron
yang dipotong selanjutnya dapat bersirkulasi melalui transfer ikatan fosforester lain. Reaksi ini
digambarkan pada Gambar 11.21.
Sirkularisasi autokatalitik dari intron yang dipotong menunjukkan bahwa penyambungan sendiri
prekursor rRNA ini berada terutama, jika tidak seluruhnya, dalam struktur intron itu sendiri.
Agaknya, aktivitas autokatalitik bergantung pada struktur sekunder intron atau setidaknya
struktur sekunder molekul prekursor RNA. Struktur sekunder RNA self-splicing ini harus
membawa gugus reaktif ke dalam penjajaran yang dekat untuk memungkinkan transfer ikatan
fosfor terjadi. Karena transfer ikatan fosforester sambung sendiri berpotensi menjadi reaksi
yang dapat dibalik, degradasi cepat intron yang dipotong atau ekspor rRNA yang disambung ke
sitoplasma dapat mendorong penyambungan ke arah depan.
Perhatikan bahwa reaksi penyambungan autokatalitik bersifat intramolekul dan karenanya tidak
bergantung pada konsentrasi. Selain itu, prekursor RNA mampu membentuk pusat aktif di
mana kofaktor guanosin-3-OH berikatan. Penyambungan autokatalitik dari prekursor rRNA ini
menunjukkan bahwa situs katalitik tidak terbatas pada protein; Namun, tidak ada aktivitas
katalitik trans seperti untuk enzim, hanya aktivitas katalitik cis. Beberapa ilmuwan percaya
bahwa penyambungan RNA autokatalitik mungkin merupakan peninggalan dari dunia awal
berbasis RNA.

PRA-mRNA SPLICING: snRNA, snRNP, DAN SPLICEOSOME

Intron dalam pre-mRNA nukleus dieksisi dalam dua langkah seperti intron dalam prekursor
tRNA ragi dan prekursor Tetrahymena rRNA yang telah dibahas dalam dua bagian sebelumnya.
Namun, intron tidak dieksisi dengan nuklease dan ligase penyambungan sederhana atau
secara autokatalitik, dan tidak diperlukan kofaktor guanosin. Sebagai gantinya, penyambungan
pra-mRNA nuklir dilakukan oleh struktur protein RNA kompleks yang disebut spliceosom.
Struktur ini dalam banyak hal seperti ribosom kecil. Mereka mengandung satu set molekul RNA
kecil yang disebut snRNA (RNA inti kecil) dan sekitar 40 protein berbeda. Dua tahap dalam
penyambungan premRNA inti telah diketahui (Gambar 11.22); Namun, beberapa detail dari
proses penyambungan masih belum pasti.
Lima snRNA, disebut U1, U2, U4, U5, dan U6, terlibat dalam penyambungan pra-mRNA nuklir
sebagai komponen spliceosom. (snRNA U3 terlokalisasi di nukleolus dan mungkin terlibat
dalam pembentukan ribosom.) Pada mamalia, ukuran snRNA ini berkisar dari 100 nukleotida
(U6) hingga 215 nukleotida (U3). Beberapa snRNA dalam ragi S. cerevisiae jauh lebih besar.
SnRNA ini tidak ada sebagai molekul RNA bebas. Sebaliknya, mereka hadir dalam kompleks
RNA-protein inti kecil yang disebut snRNPs (ribonukleoprotein nuklir kecil). Spliceosomes dirakit
dari empat snRNP berbeda dan faktor penyambungan protein selama proses penyambungan.
Setiap snRNA U1, U2, dan U5 hadir dengan sendirinya dalam partikel snRNP tertentu. snRNA
U4 dan U6 hadir bersama dalam snRNP keempat; SnRNA U4 dan U6 mengandung dua daerah
komplementaritas antarmolekul yang berpasangan dasar dalam snRNP U4 / U6. Masing-
masing dari empat jenis partikel snRNP berisi himpunan bagian dari tujuh protein snRNP yang
dikarakterisasi dengan baik ditambah satu atau lebih protein unik untuk jenis partikel snRNP
tertentu.
Tahap pertama dalam penyambungan pra-mRNA nuklir melibatkan pembelahan pada 5 situs sambungan
intron (↓ GU-intron) dan pembentukan hubungan fosfodiester intramolekul antara 5 karbon G di lokasi
pembelahan dan 2 karbon dari A yang dilestarikan residu di dekat ujung 3 intron. Tahap ini terjadi pada
spliceosom lengkap (Gambar 11.22) dan membutuhkan hidrolisis ATP. Bukti menunjukkan bahwa
snRNP U1 harus mengikat di 5 lokasi sambungan sebelum reaksi pembelahan awal. Pengenalan situs
belahan di ujung 5 intron mungkin melibatkan pasangan basa antara urutan konsensus di situs ini dan
urutan komplementer di dekat 5 ujung snRNA U1. Namun, spesifisitas pengikatan setidaknya beberapa
snRNP ke sekuens konsensus intron melibatkan snRNA dan protein snRNP spesifik.
SnRNP kedua yang akan ditambahkan ke kompleks penyambungan tampaknya adalah U2
snRNP; ia mengikat pada urutan konsensus yang berisi residu A yang dilestarikan yang
membentuk titik cabang dalam struktur lariat dari intron yang disambung. Setelah itu, snRNP U5
berikatan di 3 lokasi sambungan, dan snRNP U4 / U6 ditambahkan ke kompleks untuk
menghasilkan sambungan lengkap (Gambar 11.22). Ketika 5 situs sambungan intron dibelah
pada langkah 1, snRNA U4 dilepaskan dari spliceosom. Dalam langkah 2 dari reaksi
penyambungan, 3 situs sambungan intron dibelah, dan kedua ekson dihubungkan oleh
hubungan fosfodiester 5 sampai 3 yang normal (Gambar 11.22). MRNA yang disambung
sekarang siap untuk diekspor ke sitoplasma dan terjemahan pada ribosom.
Karena terbukti bahwa gen mengontrol struktur polipeptida, perhatian difokuskan pada
bagaimana urutan empat nukleotida berbeda dalam DNA dapat mengontrol urutan 20 asam
amino yang ada dalam protein. Dengan ditemukannya perantara mRNA (Bab 11),
pertanyaannya menjadi salah satu bagaimana urutan dari empat basa yang ada dalam molekul
mRNA dapat menentukan urutan asam amino dari suatu polipeptida. Apa sifat dari kode genetik
yang menghubungkan urutan basa mRNA dengan urutan asam amino? Jelas, simbol atau huruf
yang digunakan dalam kode harus menjadi basis; tetapi apa yang terdiri dari kodon, satuan
atau kata yang menentukan satu asam amino atau, sebenarnya, satu aminoasil-tRNA?

SIFAT-SIFAT KODE GENETIK: SEKILAS TINJAUAN

Ciri-ciri utama dari kode genetik dikerjakan selama tahun 1960an. Memecahkan kode adalah
salah satu peristiwa paling menarik dalam sejarah sains, dengan informasi baru dilaporkan
hampir setiap hari. Pada pertengahan 1960-an, sebagian besar kode genetik telah terpecahkan.
Sebelum fokus pada fitur spesifik dari kode, mari kita pertimbangkan properti terpentingnya.
1. Kode genetik terdiri dari triplet nukleotida. Tiga nukleotida dalam mRNA menentukan satu
asam amino dalam produk polipeptida; dengan demikian, setiap kodon mengandung tiga
nukleotida.
2. Kode genetik tidak tumpang tindih. Setiap nukleotida dalam mRNA hanya dimiliki oleh satu
kodon kecuali dalam kasus yang jarang terjadi di mana gen tumpang tindih dan urutan
nukleotida dibaca dalam dua kerangka pembacaan yang berbeda.
3. Kode genetik bebas koma. Tidak ada koma atau bentuk tanda baca lainnya di dalam daerah
pengkodean molekul mRNA. Selama penerjemahan, kodon dibaca secara berurutan. 4. Kode
genetik merosot. Semua kecuali dua asam amino ditentukan oleh lebih dari satu kodon.
5. Kode genetik dipesan. Beberapa kodon untuk asam amino tertentu dan kodon untuk asam
amino dengan sifat kimia yang mirip berhubungan erat, biasanya berbeda dengan nukleotida
tunggal.
6. Kode genetik berisi kodon start dan stop. Kodon spesifik digunakan untuk memulai dan
mengakhiri rantai polipeptida.
7. Kode genetik hampir universal. Dengan sedikit pengecualian, kodon memiliki arti yang sama
di semua organisme hidup, dari virus hingga manusia.
TIGA NUKLEOTID PER KODON

Dua puluh asam amino yang berbeda dimasukkan ke dalam polipeptida selama translasi. Jadi,
setidaknya 20 kodon berbeda harus dibentuk dengan empat basa yang tersedia di mRNA. Dua
basa per kodon hanya akan menghasilkan 42 atau 16 kemungkinan kodon — jelas tidak cukup.
Tiga basa per kodon menghasilkan 43 atau 64 kemungkinan kodon — suatu kelebihan yang
nyata.
Pada tahun 1961, Francis Crick dan rekannya menerbitkan bukti kuat pertama yang
mendukung kode triplet (tiga nukleotida per kodon). Crick dan rekan kerja melakukan analisis
genetik dari mutasi yang diinduksi pada lokus rII dari bakteriofag T4 oleh profil kimiawi. Profl
avin adalah agen mutagenik yang menyebabkan penambahan dan penghapusan pasangan
basa tunggal (Bab 13). Mutan fag T4 rII tidak dapat tumbuh dalam sel E. coli galur K12, tetapi
tumbuh seperti fag tipe liar dalam sel E. coli galur B. T4 tipe liar tumbuh sama baiknya pada
kedua galur. Crick dan rekan kerja mengisolasi revertan yang diinduksi profl dari mutasi rII yang
diinduksi profl. Revertant ini terbukti sebagai hasil dari terjadinya mutasi tambahan di situs
terdekat daripada pengembalian mutasi asli. Mutasi situs kedua yang memulihkan fenotipe tipe
liar dalam organisme mutan disebut mutasi penekan karena mutasi tersebut membatalkan, atau
menekan, efek mutasi asli.
Crick dan rekannya beralasan bahwa jika mutasi asli adalah penambahan atau penghapusan
pasangan basa tunggal, maka mutasi penekan harus berupa penghapusan atau penambahan
pasangan basa tunggal, yang masing-masing terjadi di situs atau situs di dekat mutasi asli. Jika
triplet nukleotida sekuensial dalam mRNA menentukan asam amino, maka setiap urutan
nukleotida dapat dikenali atau dibaca selama penerjemahan dengan tiga cara berbeda.
Misalnya, urutan AAAGGGCCCTTT dapat dibaca (1) AAA, GGG, CCC, TTT, (2) A, AAG, GGC,
CCT, TT, atau (3) AA, AGG, GCC, CTT, T. Bingkai pembacaan mRNA adalah rangkaian triplet
nukleotida yang dibaca (diposisikan di situs A ribosom) selama penerjemahan. Penambahan
atau penghapusan pasangan basa tunggal akan mengubah kerangka pembacaan gen dan
mRNA untuk bagian gen yang berada di distal mutasi. Efek ini diilustrasikan pada Gambar
12.21a. Mutasi penekan kemudian diisolasi sebagai mutan tunggal dengan menyaring
keturunan silang balik ke tipe liar. Seperti mutasi asli, mutasi supresor ditemukan menghasilkan
fenotipe mutan rII. Crick dan rekan selanjutnya mengisolasi mutasi penekan yang diinduksi oleh
profl dari mutasi penekan asli, dan seterusnya.
Crick dan rekan kemudian mengklasifikasikan semua mutasi yang terisolasi menjadi dua
kelompok, plus () dan minus () (untuk penambahan dan penghapusan, meskipun mereka tidak
tahu kelompok mana yang mana), berdasarkan alasan bahwa () mutasi akan menekan ( )
mutasi tetapi bukan mutasi lain (), dan sebaliknya (Gambar 12.21). Kemudian, Crick dan rekan
kerjanya membangun rekombinan yang membawa berbagai kombinasi mutasi () dan (). Seperti
mutan tunggal, rekombinan dengan dua () mutasi atau dua () mutasi selalu memiliki fenotipe
mutan. Hasil kritisnya adalah bahwa rekombinan dengan tiga () mutasi (Gambar 12.21b) atau
tiga () mutasi sering menunjukkan fenotipe tipe liar. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan
tiga pasangan basa atau penghapusan tiga pasangan basa meninggalkan bagian distal gen
dengan kerangka pembacaan tipe liar. Hasil ini diharapkan hanya jika setiap kodon
mengandung tiga nukleotida.
Bukti dari studi terjemahan in vitro segera mendukung hasil Crick dan rekannya dan dengan
tegas menetapkan sifat triplet kode. Beberapa dari hasil yang lebih penting adalah sebagai
berikut: (1) Trinukleotida cukup untuk menstimulasi pengikatan spesifik aminoasil-tRNA ke
ribosom. Misalnya, 5-UUU-3 merangsang pengikatan fenilalanyl-tRNAPhe ke ribosom. (2)
Molekul mRNA yang disintesis secara kimiawi yang mengandung urutan dinukleotida berulang
mengarahkan sintesis kopolimer (molekul mirip rantai besar yang terdiri dari dua subunit
berbeda) dengan urutan asam amino bergantian. Misalnya, ketika poli (UG) n digunakan
sebagai mRNA artifisial dalam sistem translasi in vitro, kopolimer berulang (cys-val) m
disintesis. (Subskrip n dan m mengacu pada jumlah nukleotida dan asam amino di masing-
masing polimer.) (3) Sebaliknya, mRNA dengan urutan trinukleotida yang berulang
mengarahkan sintesis campuran tiga homopolimer (inisiasi dilakukan secara acak pada mRNA
tersebut di sistem in vitro). Misalnya, poli (UUG) n mengarahkan sintesis campuran polyleucine,
polycysteine, dan polyvaline. Hasil ini hanya konsisten dengan kode triplet, dengan tiga
kerangka bacaannya yang berbeda. Ketika poli (UUG) n diterjemahkan ke dalam bingkai
pembacaan 1, UUG, UUG, polyleusin dihasilkan, sedangkan terjemahan dalam bingkai
pembacaan 2, UGU, UGU, menghasilkan polisistein, dan terjemahan dalam bingkai pembacaan
3, GUU, GUU, menghasilkan polivalen. Akhirnya, sifat triplet kode itu secara pasti ditetapkan
dengan membandingkan urutan nukleotida gen dan mRNA dengan urutan asam amino dari
produk polipeptida mereka.

MEMUTUSKAN KODE Pemecahan

kode genetik pada tahun 1960-an memakan waktu beberapa tahun dan melibatkan persaingan
yang ketat antara banyak laboratorium penelitian yang berbeda. Informasi baru terkumpul
dengan cepat tetapi terkadang tidak sesuai dengan data sebelumnya. Memang, memecahkan
kode terbukti menjadi tantangan besar.
Menguraikan kode genetik membutuhkan ilmuwan untuk mendapatkan jawaban atas beberapa
pertanyaan. (1) Kodon manakah yang menentukan masing-masing dari 20 asam amino? (2)
Berapa banyak dari 64 kemungkinan kodon triplet yang digunakan? (3) Bagaimana kode diberi
tanda baca? (4) Apakah kodon memiliki arti yang sama pada virus, bakteri, tumbuhan, dan
hewan? Jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini diperoleh terutama dari hasil dua jenis
eksperimen, yang keduanya dilakukan dengan sistem bebas sel. Jenis percobaan pertama
melibatkan penerjemahan molekul mRNA artifisial secara in vitro dan menentukan mana dari 20
asam amino yang dimasukkan ke dalam protein. Pada jenis percobaan kedua, ribosom
diaktifkan dengan mini-mRNA yang panjangnya hanya tiga nukleotida. Kemudian, peneliti
menentukan aminoasil-tRNA mana yang dirangsang untuk mengikat ribosom yang diaktifkan
dengan masing-masing pesan trinukleotida (Gambar 12.22).
Dekade 1960-an — era pemecahan kode genetik — adalah salah satu masa paling menarik
dalam sejarah biologi. Menguraikan kode genetik adalah tugas yang sulit dan melelahkan, dan
kemajuan datang melalui serangkaian terobosan. Kami membahas perkembangan penting ini
dalam A Milestone in Genetics: Cracking the Genetic Code di situs Student Companion.
Dengan menggabungkan hasil percobaan terjemahan in vitro yang dilakukan dengan uji mRNA
sintetik dan pengikatan trinukleotida, Marshall Nirenberg, Severo Ochoa, H.Ghobind Khorana,
Philip Leder, dan rekan mereka menemukan arti dari semua 64 kodon triplet (Tabel 12.1).
Nirenberg dan Khorana berbagi Penghargaan Nobel 1968 di bidang Fisiologi atau Kedokteran
untuk pekerjaan mereka pada kode dengan Robert Holley, yang menentukan urutan nukleotida
lengkap dari yeast alanine tRNA. Ochoa telah menerima Hadiah Nobel 1959 untuk penemuan
RNA polimerase.

KODE INISIASI DAN TERMINASI

Kode genetik juga memberikan tanda baca informasi genetik pada tingkat terjemahan. Baik
pada prokariota dan eukariota, kodon AUG digunakan untuk memulai rantai polipeptida (Tabel
12.1). Dalam kasus yang jarang, GUG digunakan sebagai kodon inisiasi. Dalam kedua kasus
tersebut, kodon inisiasi dikenali oleh inisiator tRNA, tRNAf Met pada prokariota dan tRNAi Met
pada eukariota. Pada prokariota, kodon AUG harus mengikuti urutan nukleotida yang sesuai,
urutan Shine-Delgarno, dalam 5 segmen molekul mRNA yang tidak diterjemahkan untuk
berfungsi sebagai kodon inisiasi translasi. Pada eukariota, kodon harus menjadi AUG pertama
yang ditemui oleh ribosom saat memindai dari ujung 5 molekul mRNA. Pada posisi internal,
AUG dikenali oleh tRNAMet, dan GUG dikenali oleh tRNA valin.
Tiga kodon — UAG, UAA, dan UGA — menentukan terminasi rantai polipeptida (Tabel 12.1).
Kodon ini dikenali oleh faktor pelepasan protein, bukan oleh tRNA. Prokariota mengandung dua
faktor pelepasan, RF-1 dan RF-2. RF-1 menghentikan polipeptida sebagai respons terhadap
kodon UAA dan UAG, sedangkan RF-2 menyebabkan terminasi pada kodon UAA dan UGA.
Eukariota mengandung faktor pelepasan tunggal yang mengenali ketiga kodon terminasi.

KODE DEGENERASI DAN ORDER

Semua asam amino kecuali metionin dan triptofan ditentukan oleh lebih dari satu kodon (Tabel
12.1). Tiga asam amino — leusin, serin, dan arginin — masing-masing ditentukan oleh enam
kodon berbeda. Isoleusin memiliki tiga kodon. Asam amino lainnya masing-masing memiliki dua
atau empat kodon. Terjadinya lebih dari satu kodon per asam amino disebut degenerasi
(meskipun konotasi istilah yang biasa hampir tidak sesuai). Degenerasi dalam kode genetik
tidak terjadi secara acak; sebaliknya, itu sangat teratur. Dalam kebanyakan kasus, banyak
kodon yang menentukan asam amino tertentu berbeda hanya dengan satu basa, basa ketiga
atau 3 dari kodon. Kemerosotan terutama terdiri dari dua jenis. (1) Degenerasi parsial terjadi
ketika basa ketiga dapat berupa salah satu dari dua pirimidin (U atau C) atau, sebagai alternatif,
salah satu dari dua purin (A atau G). Dengan degenerasi parsial, mengubah basa ketiga dari
purin menjadi pirimidin, atau sebaliknya, akan mengubah asam amino yang ditentukan oleh
kodon. (2) Dalam kasus degenerasi sempurna, salah satu dari empat basa dapat berada pada
posisi ketiga dalam kodon, dan kodon akan tetap menetapkan asam amino yang sama.
Misalnya, valine dikodekan oleh GUU, GUC, GUA, dan GUG (Tabel 12.1).
Para ilmuwan berspekulasi bahwa urutan dalam kode genetik telah berevolusi sebagai cara
untuk meminimalkan kematian akibat mutasi. Banyak substitusi basa pada tiga posisi kodon
tidak mengubah asam amino yang ditentukan oleh kodon. Selain itu, asam amino dengan sifat
kimia yang serupa (seperti leusin, isoleusin, dan valin) memiliki kodon yang berbeda satu sama
lain hanya dengan satu basa. Jadi, banyak substitusi pasangan basa tunggal akan
menghasilkan substitusi satu asam amino dengan asam amino lain dengan sifat kimia yang
sangat mirip (misalnya, valin untuk isoleusin). Dalam kebanyakan kasus, substitusi konservatif
jenis ini akan menghasilkan produk gen aktif, yang meminimalkan efek mutasi. Coba
Keterampilan Pemecahan Masalah: Memprediksi Substitusi Asam Amino yang Diinduksi oleh
Mutagen untuk menguji pemahaman Anda tentang kode genetik.

KODE HAMPIR UNIVERSAL

Sejumlah besar informasi sekarang tersedia dari studi in vitro, dari penggantian asam amino
karena mutasi, dan dari urutan asam nukleat dan polipeptida yang berkorelasi, yang
memungkinkan perbandingan arti dari 64 kodon dalam spesies yang berbeda. Semua data ini
menunjukkan bahwa kode genetik hampir universal; artinya, kodon memiliki arti yang sama,
dengan sedikit pengecualian, pada semua spesies.
Pengecualian paling penting untuk universalitas kode terjadi di mitokondria mamalia, ragi, dan
beberapa spesies lainnya. Mitokondria memiliki kromosom dan mesin penyintesis proteinnya
sendiri (Bab 15). Meskipun sistem mitokondria dan sitoplasma serupa, terdapat beberapa
perbedaan. Dalam mitokondria manusia dan mamalia lain, (1) UGA menentukan triptofan
daripada penghentian rantai, (2) AUA adalah kodon metionin, bukan kodon isoleusin, dan (3)
AGA dan AGG adalah kodon pemutusan rantai daripada arginin kodon. 60 kodon lainnya
memiliki arti yang sama pada mitokondria mamalia seperti pada mRNA inti (Tabel 12.1). Ada
juga perbedaan langka dalam arti kodon dalam mitokondria spesies lain dan dalam transkrip inti
beberapa protozoa. Namun, karena pengecualian ini jarang terjadi, kode genetik harus
dianggap hampir universal.
Penerjemahan urutan nukleotida dalam mRNA menjadi urutan yang benar dari asam amino
dalam produk polipeptida memerlukan pengenalan kodon yang akurat oleh aminoasil-tRNA.
Karena degenerasi kode genetik, beberapa tRNA yang berbeda harus mengenali kodon
berbeda yang menentukan asam amino tertentu atau antikodon dari tRNA tertentu harus dapat
berpasangan basa dengan beberapa kodon yang berbeda. Sebenarnya kedua fenomena
tersebut terjadi. Beberapa tRNA ada untuk asam amino tertentu, dan beberapa tRNA mengenali
lebih dari satu kodon.

PENGENALAN KODON OLEH tRNA: HIPOTESIS GELOMBANG

Ikatan hidrogen antara basa di antikodon tRNA dan kodon mRNA mengikuti aturan pasangan
basa yang ketat hanya untuk dua basa pertama kodon. Pasangan basa yang melibatkan basa
ketiga kodon kurang ketat, memungkinkan apa yang disebut Crick sebagai goyangan di situs
ini. Berdasarkan jarak molekuler dan pertimbangan sterik (struktur tiga dimensi), Crick
mengusulkan bahwa goyangan akan memungkinkan beberapa jenis, tetapi tidak semua jenis,
pasangan basa pada basa kodon ketiga selama interaksi kodon-antikodon. Usulannya sejak itu
didukung kuat oleh data eksperimental. Tabel 12.2 menunjukkan pasangan basa yang
diprediksi oleh hipotesis goyangan Crick. Hipotesis goyangan memprediksikan keberadaan
setidaknya dua tRNA untuk setiap asam amino dengan kodon yang menunjukkan degenerasi
sempurna, dan ini terbukti benar.
Hipotesis goyangan juga memprediksi terjadinya tiga tRNA untuk enam kodon serine. Tiga
serine tRNA telah dikarakterisasi: (1) tRNASer1 (antikodon AGG) berikatan dengan kodon UCU
dan UCC, (2) tRNASer2 (antikodon AGU) berikatan dengan kodon UCA dan UCG, dan (3)
tRNASer3 (antikodon UCG) berikatan dengan kodon AGU dan AGC. Kota-kota spesifik ini
diverifikasi oleh ikatan yang distimulasi trinukleotida dari aminoasil-tRNA yang dimurnikan ke
ribosom in vitro.
Akhirnya, beberapa tRNA mengandung basa inosin, yang dibuat dari hipoksantin purin. Inosine
diproduksi oleh modifikasi adenosin pasca-transkripsi. Hipotesis goyangan Crick meramalkan
bahwa ketika inosin hadir di ujung 5 antikodon (posisi goyangan), ia akan berpasangan dengan
urasil, sitosin, atau adenin dalam kodon. Faktanya, alanyl-tRNA yang dimurnikan mengandung
inosin (I) pada posisi 5 antikodon (lihat Gambar 12.12) berikatan dengan ribosom yang
diaktivasi dengan GCU, GCC, atau trinukleotida GCA (Gambar 12.23). Hasil yang sama telah
diperoleh dengan tRNA yang dimurnikan lainnya dengan inosin pada posisi ke-5 antikodon.
Dengan demikian, hipotesis goyangan Crick dengan baik menjelaskan hubungan antara tRNA
dan kodon yang diberi kode genetik yang merosot, tetapi teratur.
MUTASI SUPPRESOR YANG MENGHASILKAN tRNA DENGAN PENGAKUAN KODON YANG
DIUBAH
Bahkan jika kita mengecualikan mitokondria, kode genetiknya tidak sepenuhnya universal.
Variasi kecil dalam pengenalan dan terjemahan kodon didokumentasikan dengan baik. Dalam
E. coli dan ragi, misalnya, beberapa mutasi pada gen tRNA mengubah antikodon dan dengan
demikian kodon dikenali oleh tRNA mutan. Mutasi ini awalnya terdeteksi sebagai mutasi
penekan, substitusi nukleotida yang menekan efek mutasi lain. Mutasi supresor kemudian
terbukti terjadi pada gen tRNA. Banyak dari mutasi penekan ini mengubah antikodon dari tRNA
yang diubah.
Contoh paling terkenal dari mutasi penekan yang mengubah kota spesifik tRNA adalah yang
menekan mutasi penghentian rantai UAG dalam urutan pengkodean gen. Mutasi semacam itu,
yang disebut mutasi amber (setelah salah satu peneliti menemukannya), menghasilkan sintesis
polipeptida yang terpotong. Mutasi yang menghasilkan triplet penghentian rantai dalam gen
kemudian dikenal sebagai mutasi nonsense, berbeda dengan mutasi missense, yang
mengubah triplet sehingga menentukan asam amino yang berbeda. Gen yang mengandung
mutasi missense mengkodekan polipeptida lengkap, tetapi dengan substitusi asam amino
dalam produk gen polipeptida. Mutasi nonsense menghasilkan polipeptida terpotong, dengan
panjang rantai bergantung pada posisi mutasi di dalam gen. Mutasi yang tidak masuk akal
sering kali terjadi akibat substitusi pasangan basa tunggal, seperti yang diilustrasikan pada
Gambar 12.24a. Fragmen polipeptida yang dihasilkan dari gen yang mengandung mutasi
nonsense (Gambar 12.24b) sering kali tidak berfungsi sama sekali. Lihat Solve It: Pengaruh
Substitusi Pasangan Basa di Wilayah Pengkodean Gen HBB.
Penekanan mutasi nonsense telah terbukti sebagai hasil dari mutasi pada gen tRNA yang
menyebabkan tRNA mutan mengenali kodon terminasi (UAG, UAA, atau UGA), meskipun
dengan efisiensi yang bervariasi. TRNA mutan ini disebut sebagai tRNA penekan. Ketika tRNA
penekan amber (UAG) diproduksi oleh mutasi su3 amber pada E. coli diurutkan, ditemukan
memiliki antikodon yang berubah. Mutasi penekan kuning tertentu ini terjadi pada gen tRNATyr2
(salah satu dari dua gen tRNA tirosin pada E. coli). Antikodon dari tipe liar (nonsuppressor)
tRNATyr2 terbukti 5-GUA-3 (di mana G adalah turunan dari guanine). Antikodon dari mutan
(penekan) tRNATyr2 adalah 5-CUA-3. Karena substitusi basa tunggal, antikodon dari penekan
tRNATyr2 pasangan basa dengan kodon kuning 5-UAG-3 (ingat bahwa pasangan basa selalu
melibatkan untaian dengan polaritas berlawanan); yaitu, mRNA:
5-UAG-3 (kodon)
tRNA: 3-AUC-5 (antikodon)
Jadi, penekan tRNA memungkinkan polipeptida lengkap untuk disintesis dari mRNA yang
mengandung kodon terminasi dalam gen (Gambar 12.24c). Polipeptida tersebut akan berfungsi
jika asam amino yang dimasukkan oleh penekan tRNA tidak secara signifikan mengubah sifat
kimia protein. Selain itu, lihat Di Pinggir Tajam: Selenocysteine, Asam Amino ke-21.