Week 14

Pewarnaan Gram

Lucky Caesar Direstiyani

(luckycaesar@eng.ui.ac.id)

Mikrobiologi Lingkungan| Semester Genap 2020/2021

Program Studi Teknik Lingkungan, Fakultas Teknik
Universitas Indonesia

W14 - 3 Juni 2021

1
Sub-CPMK 6
Mampu melakukan pemeriksaan kualitas
mikrobiologi air dan udara (ELO 4 – C4)

Pokok Bahasan/Indikator:
- Konsep dasar pewarnaan gram
- Prosedur pewarnaan gram
- Berbagai contoh gram positive dan gram
negative

W14 - 3 Juni 2021 2

Quick Review | Bonus Point +10

Susun dan jelaskan tahap pelaksanaan pemeriksaan air dengan metode MPN beserta media yang digunakan!

A B C D
W14 - 3 Juni 2021 3
 Pewarnaan Gram
salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi
untuk kepentingan identifikasi dan klasifikasi mikroba

W14 - 3 Juni 2021 4

Pewarnaan Gram
• Metode Pewarnaan Gram pertama kali ditemukan oleh Christian Gram (1884)
• Morfologi mikroskopik mikroba yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap
pewarnaan Gram dapat digunakan sebagai identifikasi awal
• Hasil pewarnaan gram berdasarkan reaksi atau sifat bakteri yang ditentukan oleh
komposisi dinding selnya terhadap kandungan yang berada di dalam pewarna
tersebut.

→ Bakteri Gram Negatif (Berwarna Merah)

→ Bakteri Gram Positif (Berwarna Ungu)
W14 - 3 Juni 2021 5
Dasar Teori Pewarnaan Gram
Teori Salton
Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif.
• Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol.
• Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah
dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

Akibat pencucian dengan alcohol, bakteri gram positif mengalami denaturasi protein pada
dinding selnya
• Protein menjadi keras dan beku
• Pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan
dan bakteri akan tetap berwarna ungu.

W14 - 3 Juni 2021 6

Dasar Teori Pewarnaan Gram
Teori Permeabilitas Dinding Sel
Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel.

Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan
yang terdiri dari 30 lapisan.
• Bakteri gram positif dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50 nm)
• Permeabilitas dinding sel kurang, sehingga kompleks kristal yodium tidak dapat keluar

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1-2 lapisan dan
susunan dinding selnya tidak kompak.
• Bakteri negatif memiliki lapisan peptidoglikogen yang tipis (1-3 nm)
• Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks
kristal yodium
W14 - 3 Juni 2021 7
 Bakteri Gram Positif Vs Bakteri Gram Negatif

W14 - 3 Juni 2021 8

Bakteri Gram Positif Vs Bakteri Gram Negatif

W14 - 3 Juni 2021 9

 Reagent dalam Pewarnaan Gram

1. CRYSTAL VIOLET
• Pewarna utama/primer
• Violet colored, stains all microorganism
2. GRAM IODINE
• Pewarna penguat (Mordant)
• Forms Crystal violet iodine complexes
3. DECOLORIZER
• Acetone + Methanol
• Removes Crystal violet iodine complex from thin peptidoglycan layers
• Dissolves outer layer of Gram negative

W14 - 3 Juni 2021 10

 Reagent dalam Pewarnaan Gram

4. GRAM SAFRANINE
• Warna tandingan (Counterstain)
• Red colored
• Stains thin walled Gram negative

W14 - 3 Juni 2021 11

Langkah Pewarnaan Gram

W14 - 3 Juni 2021 12

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 1 – Tahap Persiapan

• Siapkan preparat yang telah diberi olesan bakteri

• Keringkan dan fiksasi diatas nyala api selama beberapa waktu

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

“Bacteria”

W14 - 3 Juni 2021 13

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 2 – Tambahkan Crystal Violet

• Teteskan larutan crystal violet sebanyak 2 tetes pada olesan bakteri

• Biarkan selama 1 menit, lalu cuci dengan aquades

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

W14 - 3 Juni 2021 14

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 3 – Tambahkan Lugol Iodine

• Tambahkan larutan lugol’s iodine di atas preparat tersebut dan biarkan selama 1 (satu) menit

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

W14 - 3 Juni 2021 15

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 4 – Cuci

• Bilas dengan aquades untuk menghilangkan iodine yang berlebih

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

W14 - 3 Juni 2021 16

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 5 – Decolorize

• Tetesi kembali preparat dengan larutan alkohol aseton

• Diamkan selama 30 detik

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

W14 - 3 Juni 2021 17

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 6 – Cuci Kembali

• Bilas dengan aquades untuk menghilangkan aceton yang berlebih

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

W14 - 3 Juni 2021 18

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 7 – Counterstain

• Preparat ditetesi kembali dengan larutan safranin

• Diamkan selama 30-60 detik

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

W14 - 3 Juni 2021 19

 Prosedur Detail Pewarnaan Gram
Step 7 – Cuci, Keringkan, dan Observasi

• Bilas dengan aquades untuk menghilangkan larutan saffranin yang berlebih

• Keringkan dengan menggunakan tisu
• Tambahkan minyak imersi dan observasi dengan mikroskop

Watch what happens to the “Bacteria” at each step

Gram-Positive Gram-Negative

W14 - 3 Juni 2021 20

 Gram +

Staphylococcus aureus Sarcina lutea Bacillus subtilis Candida albicans

W14 - 3 Juni 2021 21

Gram -

Pseudomonas aeruginosa Escherchia coli

W14 - 3 Juni 2021 22

 Variable Pewarnaan Gram

• Gram variability
• Old cultures
• Decolorize improperly
• Dead and alive bacteria
• Autolytic organisms e.g. Streptococcus
pneumoniae

W14 - 3 Juni 2021 23

 POST-TEST
Jumat, 4 Juni 2021
18.50 – 19.10 WIB

Materi W14:
Penjelasan Kuliah, Materi ppt,
Praktikum Daring
Tipe Soal:
SAQ & MCQ (15-20 soal)

W14 - 3 Juni 2021 43

24
Thank you ~
Lucky Caesar Direstiyani (luckycaesar@eng. ui.ac.id)
W14 - 3 Juni 2021 25