Laporan Tetap Praktikum

MIKROBIOLOGI
ACARA IV
PEWARNAAN GRAM

OLEH :
NAMA : EKA SETIANI
NIM : 200104023
SMESTER/KELAS: VI/A

LABOLATORIUM TERPADU IPA BIOLOGI

FAKULTAS TARBIYAH DAN KEGURUAN (FTK)
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)
MATARAM
2023
 HALAMAN PENGESAHAN
Laporan Tetap Praktikum Mikrobiologi Acara IV ini Disusun Sebagai salah Satu
Syarat Mengikuti Praktikum Selanjutnya.

Mataram, 13 April 2023

Disahkan Oleh

Co-Asisten

(Azma Watun Najah)

Nim : 190104071
 KATA PENGANTAR
Segala puji bagi Allah SWT. Yang telah memberikan kita begitu banyak
nikmat terutama nikmat sehat dan nikmat sempat sehingga penulis bisa
menyelesaikan Laporan Tetap Praktikum Mikrobilogi Acara IV ini dalam waktu
yang telah ditentukan.
Sholawat serta salam tak lupa pula penulis haturkan kejunjungan nabi besar
kita yakni Nabi Muhammad SAW. Yang telah membawa kita dari alam yang gelap
gulita menuju alam yang terang benderang, dengan kata lain minazzulumatiilannur.
Penulis juga mengucapkan banyak terimakasih kepada Co-Asisten yang telah
membimbing penulis dalam menyelesaikan laporan tetap praktikum mikrobiologi
acara II ini. Penulis juga memohon maaf apabila dalam penulisan laporan ini terdapat
kekeliruan dalam penulisan, Oleh sebab itu penulis mengharap kritik serta saran yang
dapat membangun.

Mataram, 06 April 2023

(Eka Setiani)
 DAFTAR ISI

COVER
HALAMAN PENGESAHAN..................................................................................ii
KATA PENGANTAR...............................................................................................iii
DAFTAR ISI.............................................................................................................iv
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................1
A. Latar Belakang...............................................................................................1
B. Rumusan Masalah..........................................................................................1
C. Tujuan............................................................................................................1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA..............................................................................2
BAB III METEDOLOGI........................................................................................4
A. Pelaksanaan....................................................................................................4
B. Alat dan Bahan...............................................................................................4
C. Prosedur Kerja...............................................................................................4
BAB IV PEMBAHASAN........................................................................................6
A. Hasil Pengamatan...........................................................................................6
B. Analisis Prosedur...........................................................................................7
C. Analisis Data .................................................................................................7
D. Analisis Hasil.................................................................................................8
E. Evaluasi..........................................................................................................10
BAB V PENUTUP....................................................................................................11
A. Kesimpulan....................................................................................................11
B. Saran..............................................................................................................11
DAFTAR PUSTAKA
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Pewarnaan Gram adalah teknik pewarnaan yang umum digunakan
dalam mikrobiologi untuk membedakan dan mengidentifikasi jenis-jenis
bakteri. Teknik ini dikembangkan pada tahun 1884 oleh seorang dokter
bernama Hans Christian Gram. Tujuan dari teknik pewarnaan Gram adalah
untuk membedakan antara bakteri Gram-positif dan Gram-negatif, yang
memiliki perbedaan dalam struktur dinding sel mereka.
Proses pewarnaan Gram melibatkan beberapa tahap yaitu pewarnaan
dengan kristal violet, penggunaan larutan lugol, penggunaan larutan alkohol
(ethanol atau aseton), dan pewarnaan dengan safranin. Bakteri Gram-positif
akan tetap berwarna ungu setelah langkah-langkah ini dilakukan, sedangkan
bakteri Gram-negatif akan menjadi berwarna merah atau pink.
Pewarnaan Gram sangat penting dalam mikrobiologi karena dapat
memberikan informasi awal tentang jenis bakteri yang ada dalam sampel. Hal
ini membantu dalam diagnosis penyakit dan penentuan pengobatan yang
tepat. Oleh sebab itu pada praktikum kali ini bertujuan untuk menganalisis
sifat gram bakteri dan cara pengaplikasikan Teknik pewarnaan bakteri secara
gram.
B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana sifat gram bakteri yang diperiksa?
2. Bagaimana mengaplikasikan Teknik pewarnaan bakteri secara gram?
C. Tujuan
1. Untuk menganalisis sifat gram bakteri yang diperiksa.
2. Untuk mengetahui cara mengaplikasikan Teknik pewarnaan bakteri secara
gram.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna
dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat
berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat, sedangkan
sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah
membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol. (Hidayanti, A. S.
N., Sulfiani, S., & Taufiq, N. 2021. Vol 16 No 2 , 46-56.)
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh
dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas,
sedangkan bakteri gram negatif misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri
tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp, karena dinding
selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk
mengidentifikasinya. Pada pewarnaantersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi
sel jaringan akan berwarna hijau. (Naue, D. dkk. 2022. Vol 12 No 1, 19-24.)
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat
warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor
dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan
sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan
berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas
terlihat. (Utami, P. R. Dkk. 2021. Vol. 4 No. 2 : 84-87).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar
belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat
berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat
warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu
diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat
berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan. (Misbach, S. R.
2016. Vol 5, No 2: 59-63)
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut
pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa
yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif.
Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme
diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna.
Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas.
(Tongko, R., & Esa, T. 2009. Vol 16, No 1: 29-31)
 BAB III
METEDOLOGI
A. Pelaksanaan
Hari, Tanggal : Kamis, 13 April 2023
Waktu : 07.30 Wita – selesai
Tempat : Labolatorium Terpadu Ipa Biologi Uin Mataram
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Mikroskop.
b. Kaca benda.
c. Mangkuk pewarna.
d. Pipet.
e. Pinset.
f. Lampu spiritus
g. Botol penyemprot
h. Kertas penghisap
i. Korek api.
2. Bahan
a. Alkohol 95%
b. Aquades steril
c. Biakan murni umur 1x 24 jam
d. Alkohol 70%
e. Lisol
f. Sabun cuci
g. Larutan safranin, iodium
h. Larutan ammonium oksalat kristal violet (Hucker)
C. Prosedur Kerja
1. menyediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api
lampu spiritus.
2. Teteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut.
3. Secara aseptik, ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu
letakkan di atas tetesan aquades tersebut, ratakan perlahan-lahan.
4. mengambil kaca benda lain yang bersih, lalu letakkan di atas kaca benda
sediaan hingga membentuk sudut sebesar 45
5. mengeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis
dan merata. Biarkan mengering.
6. melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala
api lampu spiritus dengan cepat.
7. meletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk
pewarna. Lalu teteskan larutan Ammonium Olesalat Kristal Violet di atas
sediaan tersebut. Tunggulah selama 1 menit
8. membuang kelebihan zat warna tersebut ke dalam mangkuk , lalu
tunggulah dan bilaslah dengan air kran.
9. meneteskan larutan lodium di atas sediaan
10. membuang kelebihan larutan iodium ke dalam mangkuk dan bilaslah
dengan air kran
11. meneteskan alkohol 95% di atas sedisan, biarkan selama 1 menit.
12. membuang sisa alkohol itu ke dalam mangkuk, talu bilasiah dengan air
kran
13. meneteskan larutan Safranin di atas sediaan, biarkan selama30 detik
14. Membuang kelebihan larutan Safranin ke dalam mangkuk bilaslah dengan
air kran
15. mengeringkan sediaan tersebut secara hati-hati dengan kertas penghisap,
lalu periksalah di bawah mikroskop.
 BAB IV
PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
Gambar keterangan
Percobaan 1 pewarnaan gram :
1. Bakteri gram positif
2. Monokakus
3. Ditambahin larutan

Percobaan 2 pewarnaan gram :

1. Bakteri gram positif

Percobaan 3 pewarnaan gram :

1. Bakteri gram positif

B. Analisis Prosedur
Pada praktikum kali ini pertama-tama kami menyediakan kaca benda
yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api lampu spiritus. Lalu meneteskan
setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut. Lalu secara aseptik,
 mengambil inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu diletakkan di atas
tetesan aquades tersebut, ratakan perlahan-lahan. Lalu mengambil kaca benda
lain yang bersih, lalu letakkan di atas kaca benda sediaan hingga membentuk
sudut sebesar 45 mengeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan
menjadi tipis dan merata. Lalu dibiarkan mengering.melakukan fiksasi dengan
cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api lampu spiritus dengan
cepat. Lalu meletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada diatas
mangkuk pewarna. Lalu meneteskan larutan Ammonium Olesalat Kristal
Violet di atas sediaan tersebut. Kemudian ditunggu selama 1 menit, kemudia
membuang kelebihan zat warna tersebut ke dalam mangkuk , lalu tunggulah
dan bilaslah dengan air kran.
Selanjutnya meneteskan larutan lodium di atas sediaan membuang
kelebihan larutan iodium ke dalam mangkuk dan bilaslah dengan air kran
meneteskan alkohol 95% di atas sedisan, biarkan selama 1 menit. membuang
sisa alkohol itu ke dalam mangkuk, talu bilasiah dengan air kran meneteskan
larutan Safranin di atas sediaan, biarkan selama30 detik Membuang kelebihan
larutan Safranin ke dalam mangkuk bilaslah dengan air kran mengeringkan
sediaan tersebut secara hati-hati dengan kertas penghisap, lalu periksalah
di bawah mikroskop
C. Analisis Hasil
Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa
pewarnaan gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat
berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi,
karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal
dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding
sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.
Pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara di
celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam alkohol
70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua
mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan
digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri
pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar
spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose,
supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di uji. Sebelum melakukan
pengolesan bakteri kaca objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai
tanda area untuk melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi. Pada
percobaan kali ini pengolesan di lakukan dua kali.
Kemudian melakukan pengolesan pada kaca objek dengan salah satu
sampel suspensi campuran bakteri, setelah itu di fiksasi di atas api dengan
cara di lewat – lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati.
Fiksasi dalam tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass
tanpa merusak struktur selnya, mempermudah pengecetan,dan sediaan tahan
untuk disimpan jika belum sempat dicat. Kaca objek yang sudah dioleskan
bakteri kemudian di simpan di atas bak warna lalu di teteskan pewarna karbol
gentian violet dan diamkan selama 1 menit.
Karbol gentian violet merupakan campuaran fuchsin fenol, dan dasar
yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Umumnya digunakan
dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam
mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba. Setelah 1 menit lalu di bilas
dengan aquades. Lalu olesan di teteskan pewarna lugol dan diamkan selama 2
menit. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi
memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks
zat lugol akan terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif. Setelah2 menit, lugol di bilas dengan aquades.
Kemudian olesan dicuci dengan alkohol 95% sampai zat warna larut.
Alkohol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk
membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme). Tercuci atau tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka
warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada
pengecatan ini mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi
tidak berwarna.
Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Setelah pemberian alkohol 95%
olesan diberikan atau di teteskan pewarna tandingan berupa karbol fuksin
selama 30 detik.Karbol fuksin ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non
target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin
masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada
bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu. Setelah 30 detik bilas dengan aquades lalu
dikeringkan dengan kertas saring. Setiap akhir pemberian reagen atau
pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan
 menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan
setiap zat warna yang sedang diberikan. Selanjutnya olesan di tetesi
emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai
untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan
melindungi mikroskop. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi
dibandingkan dengan air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih
jelas dibandingkan dengan tanpa minyak emersi. Dari hasil pengamatan
mikroskop dapat teramati dengan ciri bakteri berbentuk monococcus dengan
warna violet yang menandakan bakteri tersebut bakteri gram positif. subfilis
berbentuk basil dengan warna violet yang menandakan bakteri tersebut
bakteri gram positif.
Beberapa perbedaan sifat yang terlihat antara bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif yaitu bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna violet sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri
ini akan berwarna biru atau violet di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini di dasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal di banding
bakteri gram negatif sehingga bakteri gram positif dapat mempertahan warna
ungu
D. Evaluasi
Jawaban :
 BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Pewarnaan Gram adalah salah satu metode pewarnaan yang paling
umum digunakan dalam mikrobiologi untuk membedakan jenis bakteri
berdasarkan sifat pewarnaannya. Metode ini memanfaatkan perbedaan dalam
dinding sel bakteri, di mana bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang
lebih tebal dan kompleks dibandingkan dengan bakteri Gram negatif.
Pada saat pewarnaan Gram dilakukan, sampel bakteri akan diwarnai
dengan kristal violet, kemudian ditetesi dengan larutan iodin, diikuti dengan
penambahan alkohol. Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu karena
dinding selnya mencegah larutan alkohol memasuki sel, sementara bakteri
Gram negatif akan kehilangan warna karena dinding selnya lebih tipis dan
permeabel terhadap alkohol. Akhirnya, bakteri Gram negatif akan diwarnai
dengan safranin sehingga berwarna merah muda, sementara bakteri Gram
positif akan tetap berwarna ungu.
Pewarnaan Gram memungkinkan identifikasi bakteri berdasarkan sifat
pewarnaannya, dan hasilnya dapat digunakan untuk membantu memilih
antibiotik yang paling efektif untuk mengobati infeksi bakteri. Pewarnaan
Gram juga berguna dalam mengidentifikasi jenis bakteri yang terdapat dalam
sampel lingkungan atau makanan yang berpotensi menyebabkan penyakit.
j.
 DAFTAR PUSTAKA
Hidayanti, A. S. N., Sulfiani, S., & Taufiq, N. (2021). Utilization Pemanfaatan
Ekstrak Kulit Ubi Jalar Ungu Sebagai Pengganti Crystal Violet Pada
Pewarnaan Gram. Jurnal Sehat Mandiri, 16(2), 46-56.
Naue, D. A. B., Karneli, K., Syailendra, A., Syafitri, I., Wulandari, S., & Julianti, W.
(2022). Buah Bit (Beta Vulgaris L.) Sebagai Alternatif Safranin Pada
Pewarnaan Gram. Husada Mahakam: Jurnal Kesehatan, 12(1), 19-24.
Utami, P. R., Indrayati, S., & DMK, V. A. W. (2021). Uji Kesesuaian Pewarnaan
Gram Dari Sedimen Urin Dengan Uji Nitrit Pada Suspek Infeksi Saluran Kemih. In
Prosiding Seminar Kesehatan Perintis (Vol. 4, No. 2, Pp. 84-87).
Misbach, S. R. (2016). Pemanfaatan Sari Ubi Jalar Ungu (Ipomoea Batatas Poiret)
Sebagai Zat Pewarna Pada Pewarnaan Staphylococcus Aureus. Jurnal
Teknologi Laboratorium, 5(2),59-63.
Tongko, R., & Esa, T. (2009). Akurasi Tes Bactident Aminopeptida Se Untuk
Mengidentifikasi Bakteri Gram Negatif. Indonesian Journal Of Clinical
Pathology And Medical Laboratory, 16(1), 29-31.