Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368

JURNAL ILMU FARMASI INDO

GLOBAL
ISSN 2249-1023

Optimalisasi Produksi Subtilin oleh Bacillus Subitilis

Pardeep Kaur 1 *, Poorvi Sharma 1, Farough Ahmed 1, Vivek Tembhurkar 2
SRM Clinical Research Services Pvt Ltd, Aurangabad-431005, Maharashtra, India

Institut Biosains MGM, Aurnagabad-431005, Maharashtra, India

Alamat Korespondensi: pardeepkaur.kaur06@gmail.com

ABSTRAK: Dalam industri farmasi, beberapa antibiotik peptida penting diproduksi oleh Bacillus subtilis. Banyak antibiotik penting
diproduksi oleh B. subtilis jenis. Antibiotik adalah biokimiawi yang disekresikan oleh mikroorganisme yang dalam konsentrasi rendah

menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroorganisme lain yaitu antibiotik merupakan “agen antimikroba agen mikroba”.

Penghasil antibiotik tersebar luas di alam, dimana perannya sangat penting dalam mengatur populasi mikroba tanah, air, limbah, dan

kompos. Selama penelitian ini kemampuan produksi antibiotik mikroorganisme dideteksi dengan metode konvensional teknik crowds

plate. Identifikasi dan isolasi antibiotik selanjutnya dilakukan dengan teknik kromatografi kertas dan bioautografi 1 dan subtilin

diidentifikasi untuk menghambat pertumbuhan S.aureus. Untuk produksi maksimum antibiotik, parameter yang sesuai dioptimalkan

secara eksperimental yaitu waktu, suhu, pH, media (sumber karbon dan nitrogen). © 2011 IGJPS. Seluruh hak cipta.

KATA KUNCI: Senyawa Antimikroba; Staphylococcus aureus; Bacillus subtilis; Subtilin.

PENGANTAR

Kebanyakan bakteri menghasilkan senyawa antimikroba seperti antibiotik klasik spektrum luas, yaitu produk metabolisme. asam organik dan

agen litik seperti lisozim. Selain itu, beberapa jenis protein eksotoksin dan bakteriosin, yang merupakan bagian peptida aktif secara biologis

dengan aksi bakterisidal, juga dilepaskan. 2. Anggota genus Bacillus umumnya ditemukan di tanah dan sebagian besar bakteri ini memiliki

kemampuan untuk menghancurkan protein (aktivitas proteolitik). Proporsi yang tinggi dari strain penghasil senyawa antimikroba mungkin

terkait dengan peran ekologis, memainkan tindakan defensif untuk strain ke dalam komunitas mikroba yang mapan 3. Saat diuji melawan Staphylococcus

aureus supernatan kultur menghasilkan zona hambatan. Supernatan selanjutnya diuji untuk identifikasi antibiotik dengan kromatografi kertas

diikuti oleh Bioautografi dan antibiotik dari Bacillus subtilis ditemukan oleh bioautografi dalam karakteristik posisi subtilin.

S.aureus adalah bakteri Gram-positif, bulat (coccus). S.aureus muncul dalam kelompok, seperti tandan buah anggur. Tumbuh dalam makanan,

beberapa strain dapat menghasilkan racun yang menyebabkan penyakit gastro-intestinal akut jika tertelan. Organisme ini dapat tumbuh baik dengan

maupun tanpa oksigen (secara fakultatif anaerobik), dan bersifat katalase-positif dan oksidaenegatif. Hampir semuanya S.aureus strain menghasilkan

enzim koagulase. Waduk utama S.aureus adalah manusia dan hewan. Orang sehat membawa organisme di hidung dan
362
 Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368
tenggorokan (50%), di tangan (5-30%), dan luka. S.aureus juga dapat menjajah permukaan kontak makanan, dan dapat menjadi organisme persisten di

rumah jagal. S.aureus dapat mencemari makanan melalui kontak dengan tangan, bahan, dan permukaan yang terkontaminasi, tetapi juga melalui udara

(batuk).

Pembentukan endospora 4 rhizobacterium Bacillus subtilis - sistem model untuk organisme Gram-positif, mampu menghasilkan

lebih dari dua lusin antibiotik dengan variasi struktur yang menakjubkan 5. Namun, spesies Bacillus penyebab penyakit sekarang mudah

dibedakan dari strain yang membantu seperti Bacillus subtilis. B. subtilis bermanfaat dalam banyak hal, termasuk aplikasi industri. Ini digunakan

untuk menghasilkan berbagai enzim, termasuk amilase, yang membantu dalam mengurangi ukuran tekstil dan modifikasi pati untuk ukuran

kertas. B. subtilis juga memproduksi enzim protease, termasuk subtilisin, yang digunakan dalam deterjen dan industri kulit. Mungkin lebih

khusus, B. subtilis digunakan untuk menghasilkan banyak antibiotik, seperti difficidin, oxydifficidin, basil, bacillomyin B, dan Bacitracin, yang

membantu dalam mengobati infeksi bakteri kulit dan mencegah infeksi pada luka kecil dan luka bakar.

B. subtilis juga digunakan sebagai fungisida. Bakteri menjajah sistem akar, tidak menyisakan ruang untuk organisme penyakit jamur. Ini digunakan pada

benih pertanian sayuran, kedelai, kapas, dan kacang tanah dan pada benih bunga dan hias. Itu juga digunakan untuk menghasilkan racun serangga,

termasuk satu untuk membunuh larva nyamuk malaria. Menurut laporan Undang-Undang Pengendalian Zat Beracun dari Badan Perlindungan

Lingkungan, Bacillus subtilis “Dianggap organisme jinak karena tidak memiliki sifat yang menyebabkan penyakit. Itu tidak dianggap patogenik atau

toksigenik bagi manusia, hewan, atau tumbuhan.

Subtilin: Protein subtilin memiliki efek bakterisidal pada banyak bakteri Gram positif dan Gram negatif tertentu. Penelitian ini dilakukan

dengan tujuan isolasi B. subtilis dari tanah dan untuk menilai efek antibakteri dari "subtilin". Produksi subtilin di

B. subtilis diatur dalam cara yang bergantung pada fase pertumbuhan, dimulai pada fase pertumbuhan eksponensial pertengahan dan meningkat untuk

mencapai tingkat maksimal pada awal fase diam. Subtilin adalah peptida antimikroba tipe I (AMP) atau lantibiotik yang diproduksi oleh

B. subtilis. Lantibiotik adalah antibiotik turunan peptida dengan aktivitas antimikroba tinggi terhadap berbagai bakteri Gram positif, termasuk

bakteri patogen seperti propionibacteria, stafilokokus, clostridia, enterokokus, dan streptokokus. Keluarga AMP ini ditandai dengan adanya

asam amino yang tidak biasa. Subtilin, sebuah lantibiotik pentasiklik 32 asam amino secara struktural terkait dengan nisin biopreservatif yang

banyak digunakan. 6.

BAHAN & METODE

PENYARINGAN PRODUSEN ANTIBIOTIK:

Kemampuan produksi antibiotik mikroorganisme dapat dideteksi dengan teknik pelat ramai konvensional, di mana tanah atau sumber

mikroorganisme lain diencerkan. Pengenceran dipilih sedemikian rupa sehingga menghasilkan 300-400 koloni dan disebarkan pada media

nutrisi. Koloni penghasil antibiotik ditunjukkan dengan area agar-agar di sekitar koloni yang bebas dari pertumbuhan koloni lain. Koloni

tersebut dipilih untuk digunakan lebih lanjut. Piring agar nutrisi disiapkan (komposisi untuk 1000ml (pH: 7,2 sampai 7,4) Ekstrak daging sapi 5

gram, Pepton 5 gram, Natrium Klorida 3 gram, Agar-agar 15). Produsen antibiotik B. subtilis, B. megaterium, B. thurengienesis, Penicillin

crysogenum dan organisme uji Pseudomonas, S.aureus, B. pumilis, Micrococcus luteus ditanam dalam kaldu nutrisi selama 4 hari pada usia 30 Hai

C. Budaya aktif S.aureus disebarkan di piring agar nutrisi untuk mendapatkan pertumbuhan yang rapat dan di piring yang sama kultur aktif B.

subtilis, B. megaterium, B. thurengienesis, dll tempat diinokulasi. Prosedur serupa dilakukan untuk organisme uji lainnya dan piring diinkubasi

pada suhu 30 ° C selama 48 jam dan zona penghambatan yang diamati diukur.

363
 Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368

IDENTIFIKASI ANTIBIOTIK DENGAN BIOAUTOGRAFI:

Kromatografi kertas satu arah yang diikuti oleh Bioautografi telah terbukti berguna untuk membedakan antibiotik yang diproduksi

Basil spesies sehubungan dengan program penyaringan. Untuk tujuan perbandingan dengan antibiotik tak dikenal, Rf nilai telah ditentukan

dengan sejumlah pelarut untuk sebagian besar antibiotik Bacillus yang aktif melawan bakteri gram positif dan beberapa antibiotik polipeptida

yang dihasilkan oleh mikroorganisme lain. Multiplisitas produksi antibiotik jelas mempersulit upaya untuk mengidentifikasi antibiotik dalam

bahan yang tidak difraksinasi. Namun, bahkan dalam keseluruhan kultur kesamaan atau perbedaan antara antibiotik yang diketahui dan yang

tidak teridentifikasi dapat dicatat dengan menggunakan kromatografi. Kromatografi ascending pada kertas Wattman no .1 dikembangkan

dalam toples kaca berukuran 1 cm. campuran pelarut. Komposisi pelarut didasarkan pada pengukuran volume setiap komponen. Pengaruh

perubahan konsentrasi pelarut cukup besar untuk menjamin persiapan campuran segar untuk setiap penggunaan. Sampel terlihat 2 cm di atas

dasar kertas, dan ditempatkan di pelarut. Setelah pelarut dipindahkan ke bagian atas kertas, kromatogram dikeringkan secara menyeluruh.

Antibiotik yang dimigrasi terdeteksi secara bioautografik. Kertas ditempatkan selama satu setengah jam di atas biji nutrient agar plate dengan

organisme uji S.aureus. Plat diinkubasi pada suhu 30 ° C selama 24 jam. Sesuai hasil yang diperoleh dengan prosedur Bioautografi, sistem

pelarut berikut diubah seperti yang disebutkan untuk pemisahan lebih lanjut dan identifikasi antibiotik.

1. Sistem pelarut 1: Untuk 10 ml (7.4: 0.3: 2.5)

t-butil alkohol: asam asetat: air

2. Sistem pelarut 2: Untuk 10 ml (6,5: 0,3: 3,2)

t-butil alkohol: asam asetat: air

3. Sistem pelarut 3: Untuk 10 ml (2.5: 2.5: 0.3: 4.7)

n-butil alkohol: etil alkohol: asam asetat: air

4. Sistem pelarut 4: Untuk 10 ml (5.5: 0.6: 4.0)

t-butil alkohol: asam asetat: air

5. Sistem pelarut 5: Untuk 10 ml (7.0: 0.6: 2.4)

t-butil alkohol: asam asetat: air

6. Sistem pelarut 6: Untuk 10 ml (4.0: 1.0: 5.0)

Fase alkoholik dari n-butil alkohol: asam asetat: air

7. Sistem pelarut 7: Untuk 10 ml (6.0: 1.3: 1.7)

Aseton: asam asetat: air

OPTIMASI KONDISI FERMENTASI UNTUK PRODUSEN ANTIBIOTIK

Untuk mendapatkan produksi antibiotik yang lebih tinggi dari kultur yang tumbuh secara aktif B. subtilis terhadap gram positif S.aureus Parameter

tertentu seperti waktu, suhu, pH, serta media dioptimalkan.

I. Perjalanan waktu bagi produsen antibiotik

Untuk optimasi waktu, 100ml kaldu pati diinokulasi dengan 1ml kultur tumbuh aktif B. subtilis dan kaldu diinkubasi pada suhu 30 ° C.

Dari sini setelah setiap 24 jam 2,0 ml kaldu dikumpulkan secara aseptik, disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 15 menit. Kemudian

pellet dibuang dan supernatan dikumpulkan dalam tabung baru dan aktivitas antibiotik dalam supernatan diperiksa dengan bioassay.

Untuk bioassay, organisme uji S.aureus dioleskan pada permukaan nutrient agar pada sumur diameter 2mm ini dilubangi

364
 Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368
menggunakan penggerek stainless steel steril. Ke sumur ini, 15μl supernatan dituangkan setiap hari di sumur yang berbeda. Pelat diinkubasi

pada suhu 37 ° C selama 24 jam dan diamati zona hambatnya. Diameter zona hambatan dicatat.

[Catatan: Diameter zona hambatan berbanding lurus dengan jumlah antibiotik yang ada dalam supernatan.]

Antibiotika Basil Basil Basil Penisilin

Sr. no subtilis megatarium thuringenesis crysogenum
produsen
Organisme uji

1. S.aureus + + - -
2. M. kecapi - + - -
3. P. aeruginosa + + - -
4. Bacillus pumilis - - - -
5. E. coli - + - -

Tabel 1 Skrining Produsen Antibiotik

(+): zona hambatan (produksi antibiotik)

(-): tidak ada zona hambatan (tidak ada produksi antibiotik)

Pelarut no Sistem pelarut Rasio (dalam 100 ml) Nilai rf

Pelarut 1 t-butil alkohol: asam asetat: air 74: 3: 25 0.41

Pelarut 2 t-butil alkohol: asam asetat: air 6.5: 0.3: 3.2 0,51

Pelarut 3 n-butil alkohol: etil alkohol: asetat 2.5: 2.5: 0.3: 4.7 0,09
asam: air

Pelarut 4 t-butil alkohol: asam asetat: 5.5: 0.6: 4 0.33

air

Pelarut 5 t-butil alkohol: asam asetat: air 7.0: 0.6: 2.4 a) 0,22

b) 0,47

Pelarut 6 Fase alkoholik dari n-butil alkohol: 4.0: 1.0: 5.0 0.67
asam asetat: air

Pelarut 7 aseton: asam asetat: air 6.0: 1.3: 1.7 0.0

Tabel 2 Identifikasi Antibiotik Dengan Kromatografi Kertas dan Bioautografi

II. Pengaruh suhu pada produksi antibiotik:

Untuk optimasi suhu, enam set 20ml kaldu pati diinokulasi dengan 2% kultur tumbuh aktif B. subtilis. Semua labu diinkubasi pada suhu

yang berbeda yaitu 28 ° C, 31 ° C, 34 ° C, 37 ° C, 41 ° C, suhu kamar selama 96 jam (waktu inkubasi optimal). Setelah inkubasi kaldu

disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 15 menit. Kemudian pellet dibuang dan supernatan dikumpulkan dalam tabung segar dan

aktivitas antibiotik dalam supernatan diperiksa dengan bioassay.

365
 Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368

AKU AKU AKU. Pengaruh pH pada produksi antibiotik:

Untuk optimasi pH masing-masing labu 20ml pati kaldu dengan pH yang berbeda yaitu 4, 5, 6,7,8,9 diinokulasi dengan 2% kultur tumbuh aktif. B.

subtilis. Semua labu diinkubasi pada suhu 28 ° C (Suhu optimal) dan 96 jam (Waktu optimal). Setelah inkubasi, kaldu disentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dikumpulkan dalam tabung segar dan aktivitas antibiotik dalam supernatan diperiksa

dengan bioassay.

OPTIMASI MEDIA

Pengaruh sumber karbon dan nitrogen:

Sumber nitrogen 0,5% yaitu pepton dilarutkan dalam aquades dan didistribusikan dalam labu yang berbeda. Untuk masing-masing labu ditambahkan

sumber karbon berbeda 1,0% yaitu ditambahkan tepung terigu, tepung beras, tepung jagung, glukosa dan pati. Demikian pula untuk melihat pengaruh

sumber karbon Nitrogen yang dioptimalkan yaitu tepung jagung dilarutkan dalam akuades dan didistribusikan dalam labu yang berbeda. Untuk setiap

labu ditambahkan sumber nitrogen yang berbeda yaitu ekstrak ragi, ekstrak daging sapi, pepton, tryptone, dan urea dan pH diatur pada 8 (pH

dioptimalkan) dan media diautoklaf. 2% dari B. subtilis diinokulasi ke setiap labu kaldu produksi dan diinkubasi pada suhu 28 ° C (Suhu yang dioptimalkan)

selama 96 jam (Waktu yang dioptimalkan). Setelah inkubasi, kaldu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu kamar.

Supernatan dikumpulkan dalam tabung segar dan aktivitas antibiotik dalam supernatan diperiksa dengan bioassay.

HASIL & PEMBAHASAN

Sr. no Waktu inkubasi (dalam jam) Diameter zona hambatan

(dalam cm)

1. 24 Jam 0,00
2. 48 Jam 0.80
3. 72 Jam 1.00
4. 96 Jam 1.64
5. 120 Jam 1.30
6. 144 Jam 1.00
7. 168 Jam 0.80
8. 192 Jam 0,00

Tabel 3 Kursus Waktu untuk Produksi Antibiotik

366
 Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368

2 2.5

Diameter zona hambatan

diameter zona hambatan

1.5 2
1.5
1
1
(dalam cm)

0,5

(dalam cm)
0,5
0 0
24 48 72 96120144168192 28 ° c 31 ° c 34 ° c 37 ° c 41 ° c

Waktu dalam jam Suhu (° c)

Gambar 1 Kursus Waktu untuk Produksi Antibiotik Gambar 2 Pengaruh Suhu terhadap Produksi Antibiotik

Diameter zona hambatan

Sr. no Suhu inkubasi (dalam ° C)
(dalam cm)

1. 28 ° C 2.0
2. 31 ° C 1.7
3. 34 ° C 1.9
4. 37 ° C 1.9
5. 41 ° C 1.5

Tabel 4 Pengaruh Suhu terhadap Produksi Antibiotik

Sr. no Sumber karbon Diameter zona Sumber nitrogen Diameter zona

inhibisi inhibisi
(dalam cm) (dalam cm)

1. Tepung terigu 1.8 Ekstrak daging sapi 1.80

2. Tepung beras 1.6 Ekstrak ragi 2.00
3. Tepung jagung 2.0 Pepton 3.96
4. Pati 1.4 Tryptone 2.03
5. Glukosa 0.0 Urea 1.93

Tabel 5 Efek optimasi media sumber karbon dan nitrogen

Diameter zona hambatan

Sr. no pH 2
(dalam cm)

1. 4 1.3 1.5
Diameter zona

5 1.7 1
2.
inhibisi

0,5
3. 6 1.6
0
4. 7 1.5
4 5 6 7 8 9
5. 8 1.9
6. 9 1.5
pH
Tabel 6 Pengaruh pH pada produksi antibiotik Gambar 3 Pengaruh pH pada produksi antibiotik

367
 Jurnal Ilmu Farmasi Global Indo, 2011; 1 (4): 362-368

Bacillus subtilis dan Bacillus megatarium ditemukan menghasilkan senyawa antibiotik yang menghambat pertumbuhan S.aureus, P.

aeruginosa. Ini B. subtilis digunakan untuk studi lebih lanjut. Antibiotik tidak mampu menghambat pertumbuhan M. luteus, B. pumilis,

dan E. coli. Dengan mengamati nilai Rf yang diperoleh dengan kromatografi kertas selanjutnya menggunakan sistem pelarut berbeda yang

memiliki pelarut organik pada konsentrasi berbeda dilanjutkan dengan Bioautografi diketahui bahwa antibiotik yang diperoleh adalah Subtilin.

Pengaruh berbagai parameter pada produksi antibiotik dipelajari, yang menunjukkan bahwa produksi antibiotik oleh B. subtilis dimulai setelah

24 jam inkubasi dan mencapai tingkat maksimum setelah 96 jam inkubasi, setelah itu konsentrasi antibiotik berkurang. Setelah 192 jam, tidak

ada antibiotik yang terdeteksi dalam kaldu fermentasi. Oleh karena itu waktu optimal untuk produksi antibiotik adalah 96 jam. Suhu optimal

untuk produksi antibiotik adalah 28 ° C. Pengaruh komposisi medium juga dipelajari dimana produksi antibiotik ditemukan maksimal ketika

fermentasi dilakukan pada pH 8 dan produksi relatif lebih tinggi ketika pepton digunakan sebagai tepung jagung sumber nitrogen sebagai

sumber karbon.

KESIMPULAN

Produksi antibiotik dilakukan dengan menggunakan Basil spesies yaitu B. subtilis dan dengan prosedur skrining ditemukan bahwa hal itu dapat

menghambat pertumbuhan S.aureus. Diameter zona hambat yang diperoleh pada bioassay adalah 5,3 cm. Identifikasi lebih lanjut dan isolasi

antibiotik dilakukan dengan menggunakan teknik kromatografi kertas dan Bioautografi dan diidentifikasi Subtilin untuk menghambat

pertumbuhan Gram positif. S.aureus. Untuk produksi antibiotik yang maksimal, parameter yang sesuai dioptimalkan secara eksperimental yaitu

waktu (96 jam yaitu 4 hari), suhu (28ºC) dan pH (8) bersama dengan optimasi media yaitu sumber karbon dan nitrogen.

REFERENSI
1. Snell, N, Ijichi, K, dan Lewis JC. Identifikasi kromatografi kertas dari antibiotik penghambat polipeptida gram positif. Appl.
Microbiol, 1956; 4: 13-17.
2. Amanda SM, Florencia O, Adriano B. Skrining aktivitas antimikroba di antara bakteri yang diisolasi dari cekungan Amazon. Jurnal Mikrobiologi
Brasil, 2004. 35 (4): 12-19
3. Strahl ED, Dobson KAMI, Lundie LL. Isolasi dan skrining bakteri terkait bintang rapuh dari aktivitas antibakteri. Mikrobiologi
Saat Ini, 2002; 44: 450-459.
4. Moszer I, Jones LM, Moreira S, Fabry C, Danchin A. SubtiList: database referensi untuk Bacillus subtilis genom. Res asam nukleat,
2002; 30: 62–65.
5. Sonenshein AL, Hoch JA, Losick R. Bacillus subtilis dan Kerabat Terdekatnya. Gen ke Sel, 2001. Washington, DC: American Society for
Microbiology Press.
6. Ross RP, Morgan S, Hill C. Pengawetan dan fermentasi: masa lalu, sekarang dan masa depan. Microbiol Makanan Int J, 2002; 79: 3–16.

368