HANDOUT PRAKTIKUM FTS STERIL STERILITY TEST

REVISI

Disusun oleh: Putut Wibisono (098114132) Lia Susanti (098114135)

LABORATORIUM TEKNOLOGI FORMULASI SEDIAAN STERIL FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2012

STERILITY TEST Sterilitas didefinisikan sebagai kondisi bebas dari adanya mikroorganisme hidup. Sterilitas merupakan syarat yang mutlak bagi sediaan injeksi. Suatu sediaan yang berlabel steril, berarti telah melewati persyaratan USP (National Compendial Sterility Test Requirements) untuk tes sterilitas. Tes sterilitas menurut USP merupakan estimasi probabilitas, tidak merupakan hasil yang sebenarnya. Hal ini dikarenakan uji sterilitas merupakan uji yang bersifat destruktif, sehingga tidak semua sediaan diuji sterilitasnya, hanya sebagian saja sehingga hasilnya merupakan hasil sebagian sampel batch. Selain itu kemungkinan untuk terjadinya kontaminasi yang bersifat accidental selama uji sterilitas. Untuk sterilisasi akhir memiliki Sterility Assurance Level (SAL) paling sedikit 10-6. Uji sterilitas dilakukan dengan menginkubasi sampel pada media yang sesuai. Adanya mikroba dibuktikan dengan terjadinya kekeruhan. Media yang digunakan haruslah memiliki komposisi yang sesuai dan memberikan kondisi pertumbuhan mikroba yang optimal yaitu nutrisi yang sesuai, pH, temperatur, waktu inkubasi yang cukup, sel mikroba tunggal yang akan tumbuh dengan progresi geometrik. Sampling Pengambilan sampel untuk lebih dari 500 artikel adalah minimal 20, sedangkan untuk 100-500 artikel adalah tidak kurang dari 10. Untuk large volume parenteral product (volume lebih dari 100 mL per wadah) paling sedikit 2% dari batch. Maksimal sampling untuk 1 lot adalah 40. Persyaratan sampling menurut USP dan European Pharmacopeia (EP) Sterility Test Section ditunjukkan oleh tabel 1.

Tabel 1. Persyaratan sampling menurut USP dan European Pharmacopeia (EP) Sterility Test Section (Akers, 2002). Media Kultur Dua media primer menurut USP dan EP adalah fluid thioglycollate medium (FTM) dan soybean-casein digest (SCD) atau trypticase soy broth (TSB). FTM dapat digunakan untuk mikroba aerob dan anaerob. Untuk produk berminyak, FTM ditambahkan polysorbate 80 sebagai agen emulsifikasi untuk dispersi lipofilik produk di media hidrofilik. Komposisi dan kegunaannya ditunjukkan pada tabel 2.

Tabel 2. Komposisi dan kegunaan FTM (Akers, 2002).

TSB memiliki pH yang sedikit lebih tinggi dibandingkan FTM, dan lebih meningkatkan pertumbuhan mikroba aerobic dibandingkan FTM. Komposisi TSB dan kegunaannya ditunjukkan pada tabel 3.

Tabel 3. Komposisi dan kegunaan TSB (Akers, 2002). Waktu dan Suhu Inkubasi Waktu dan temperatur inkubasi yang dipersyaratkan untuk uji sterilitas menurut USP ditunjukkan pada tabel 4.

Tabel 4. Waktu dan temperatur inkubasi (Akers, 2002). Waktu inkubasi diperlukan yang cukup panjang karena adanya siklus untuk pertumbuhan mikroba, dimana terdapat karakteristik lag time dari kurva pertumbuhan kebanyakan mikroba.

gambar 1. Siklus hidup dan mati bakteri Metode Uji Sterilitas Terdapat 2 metode uji sterilitas yaitu Direct Transfer/Direct Inokulation Method dan Membrane Filtration (MF) Method. A. Direct Transfer/Direct Inokulation Method Merupakan metode sterilitas yang sifatnya konvensional. Terdapat 3 langkah untuk metode ini yaitu: 1. Membuka tutup wadah sampel secara aseptik 2. Menggunakan syringe yang steril untuk inokulasi sampel pada media 3. Injeksi setengah volume sampel di media FTM dan setengahnya di media TSB Produk steril yang digunakan untuk metode ini antara lain: nonfilterable liquids, ointments and oils insoluble in isopropyl myristate, solids to test media, purified cotton, gauze, surgical dressings, sutures, and related articles, sterilized devices. B. Membrane Filtration (MF) Method Metode yang lebih dipilih karena lebih mudah dikerjakan. Langkah dasar metode ini adalah: 1. Unit steril disiapkan dan disterilkan 2. Sampel dilewatkan filter dalam kondisi aseptic 3. Filtrasi dengan pertolongan vacuum 4. Membran dihilangkan secara aseptik dan dipotong setengah 5. Setengah bagian membran ditempatkan pada 100 mL FTM dan setengahnya pada 100 mL TSB. Produk steril yang diuji dengan metode ini antara lain: liquids miscible with aqueous vehicles, liquids immiscible with aqueous vehicles, less than 100 ml per container ointments and oils soluble in isopropyl myristate, prefilled syringes, solids for injection

other than antibiotics, antibiotic solids for injection, antibiotic solids, bulks, and blends, sterile aerosol products, devices with pathways labeled sterile. Pemeriksaan Uji Sterilitas Untuk uji sterilitas perlu dilakukan pengusutan terhadap hal-hal yang akan berpengaruh terhadap kontaminasi sampel. Hal itu meliputi: 1. Identifikasi organisme pada uji sterilitas 2. Mencatat tes laboratorium dan penyimpangannya 3. Mengawasi lingkungan area produksi 4. Mengawasi personel 5. Product presterilization bioburden 6. Review catatan produksi 7. Sejarah manufacturing Uji sterilitas pada antibiotik dan protein Metode ini dimaksukan untuk menghilangkan sifat anti mikroba yang tertinggal setelah proses filtrasi dengan membrane filtrasi. Misalnya, residu penicillin dibilas dengan cairan penisillininase dimaksudkan untuk meng-inaktifkan penicillin tersebut. Sedangkan tes sterilitas protein yaitu memodifikasi protein dengan viskositas tinggi(albumin) memalui membrane filter dan agar tidak memberikan efek samping pada hewan uji lebih dari 1 menit. Pengendalian dalam uji sterilitas Uji sterilitas sangat dimungkinkan dapat dikacaukan oleh banyak hal, misalnya: lingkungan dan kontaminan. Maka dari itu pengendalian pada tahap uji steril sangat diperhatikan untuk menghindarkan ketidakvalidnya suatu data atau hasil dari produk steril yang dihasilkan. Maka pengendalian dilakukan saat pembuatan sediaan hingga pengawasan, meliputi: pengendalian lingkungan produksi (kelembaban, jumlah partikel, kontruksi bangunan pabrik, dll) dan pengendalian teknisi operator atau personil (pemahaman, pelatihan, teknik aseptis, dll). Ada beberapa tipe dari control uji sterilitas sediaan 1. Kontrol positif: yaitu pengujian aktifitas media kultur tanpa sampel sediaan dengan pemberian mikroba setelah dilakukan dalam waktu inkubasi tertentu. Kontrol positif ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri bisa tumbuh di media yang digunakan.

Gambar 2. Mikroba yang digunakan pada Growth Promotion Test (Akers, 2002) 2. Kontrol negatif: yaitu pengujian sterilitas dari media dalam waktu tertentu tanpa sediaan dan tanpa pemberian mikroba setelah di sterilkan. 3. Uji pertumbuhan mikroba: yaitu pengujian terhadap aktifitas pertumbuhan mikrroba pada media yang telah disterilkan selama masa inkubasi tertentu. Dengan syarat ada pengaruh antimikroba pada system, jumlah pemberian mikroba diketahui, dan perlakuan kondisi inkubasi yang sesuai. 4. Kontrol untuk metode membrane filtrasi. Dengan cara membran hanya dialiri dengan pelarut. Validitas dari uji sterilitas Sediaan steril adalah sedian yang bebas dari kontaminan mikroba, namun bukan berarti harus mempunyai daya antimikroba. Dalam validasi uji steril digunakan mikroba konsentrasi kecil, dimaksudkan untuk menghitung daya mikroba setelah diinokulasi dan di inkubasi. Pada kasus ini produk steril dapat bebas dari mikroba dalam range waktu tertentu dilihat dari metode, jenis mikroba, dan konsentrasi yang diberikan. Keterbatasan dalam uji sterilitas Dari aturan USP secara garis besar ada tiga kendala dalam uji sterilitas 1. Sejumlah varian kecil sampel tidak bisa untuk mempresentasikan jumlah sediaan dalam jumlah besar. 2. Ketidakmampuan dari media kultur dalam pertumbuhan mikroba, sehingga data tidak valid. 3. Tidak dapat menghindari kontaminan yang tidak disengaja pada proses produksi. Maka dari itu dilakukan cara untuk meminimalkan masalah yang timbul saat uji sterilitas, misalnya: meningkatkan pengetahuan dan pemahaman tentang proses sterilisasi,

menghindari kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan selama pembuatan dan pengujian, dan pendidikan atau pelatihan personil dalam prosedur pengujian sterilitas. Masalah sampling dan representasi statistik Pada masalah ini terkait dengan probabilitas pengujian sampel terhadap syarat yang di tentukan. Misalnya disyaratkan tidak lebih 0,1% maka dari 1000 sediaan tidak lebih dari 1, dan jika hanya menggunakan 10 sampel apakah keseluruhan sampel dikatakan steril. Masalah faktor pendukung pertumbuhan pada kontaminan mikroba Pada media kultur dapat menjadi faktor pertumbuhan yang baik suatu mikroba yang tidak diinginkan,maka perlu disterilkan dan dikondisikan agar mikroba yang tidak diinginkan tidak tumbuh dengan baik. Masalah kontaminasi dan kebocoran Pertumbuhan mikroba dari media uji harus berasal dari sampel bukan dari kontaminasi lingkungan. Maka dari uji dibutuhkan control positif dan negatif untuk mengetahui apakah pertumbuhna bakteri berasal dari sampel bukan dari kontaminasi. Maka kondisi lingkungan dan personil perlu diperhatikan untuk menhindari kontaminan dari lingkungan. ISOLATION CHAMBERS AND ROBOTIC STERILITY TEST UNITS Seperti sudah dijelaskan sebelumnya penyebab kontaminasi paling besar berasal dari lingkungan dan personil. Pada metode ini sengaja menghilangkan tugas manusia sebagai pekerja digantikan oleh robot atau mesin. Karena pengaruh manusia sangat besar terhadap kontaminasi maka dari itu metode ini sangat meminimalkan unsur manusia dalam proses. Kerugian dari sistem uji sterilitas mesin adalah menambah beban instalasi akan pemeliharaan, kecepatan yang lebih lambat dalam melakukan tes sterilitas, dan kompleksitas dalam pemeliharaan sistem. Validasi sistem uji sterilitas robot melibatkan di sedikitnya lima unsur: 1. Memvalidasi prosedur manual saat ini. 2. Memvalidasi semua operasi mesin, baik hardware dan perangkat lunak 3. Memvalidasi pola aliran udara laminar dalam sistem. 4. Memvalidasi tingkat partikel dalam dan sekitar ruang uji.

5. Memvalidasi desinfeksi sistem. Perasetat asam tidak boleh digunakan sebagai desinfektan dalam sistemmesin karena hal itu menyebabkan masalah korosif. Desinfektan yang dapat diterima untuk robot sistem adalah ampfil, sporicidin, atau hidrogen peroksida 3%.

Gambar 3. Schaeffer Engineering hard-walled isolation barrier system for sterility testing (Akers, 2002) Validation of Barrier Isolation and Associated Sterilization Systems Adalah suatu system kompleksitas dari pembuatan produk dan pengujian produk steril agar didapatkan suatu produk yang baik, meliputi: 1. Design: yaitu penentuan rancangan tentang proses pengkondisian agar didapat suatu produk steril. Misal, tentang konsep Laminar Air flow, dll. 2. Location of the Isolator: penempatan khusus operator di mana tidak disyaratkan pada tempat produksi sediaan. Dimaksudkan untuk keselamatan dari operator. 3. Installation Qualification: harus mencakup rincian keterangan tentang semua aspek mekanik dari sistem, seperti sebagai dimensi, konfigurasi internal, nomor urut peralatan, cetak biru, pesanan pembelian, pasokan listrik, spesifikasi alat, suplai vakum, dan manual peralatan. 4. Operational Qualification: yaitu memverifikasi operasional kerja yang dilakukan operator, sebelum proses produksi berjalan. Dapat dilihat dari kebocoran, kelembaban, aliran udara, temperatur (kesesuaian sistem). 5. Performance Qualification: yaitu memverifikasi aspek fungsional dalam proses produksi oleh operator. Misal kinerja personil apakah sudah aseptis. 6. False-Negative Evaluation Teknik dan Prosedur untuk Menjamin Sterilitas

Karena jaminan sterilitas didasarkan pada fungsi probabilitas, sterilitas tidak pernah dapat dibuktikan kecuali seluruh sediaan dilakukan uji sterilitas. Selain itu, seperti sudah dibahas, uji sterilitas sendiri memiliki keterbatasan tertentu. Oleh karena itu, sterilitas produk tidak bisa diuji dengan jaminan mutlak bahwa setiap produk steril. Namun, jaminan sterilitas produk dapat dicapai dengan proses kerja dan kepatuhan terhadap berbagai prosedur. Ini termasuk (a) alat sterilisasi dan validasi metode sterilisasi dengan menggunakan fisik dan biologis indikator, (b) kontrol dari kondisi lingkungan di mana produk parenteral diproduksi, terutama ketika proses pengolahan aseptik dilakukan, dan (c) pelatihan personil teknik aseptik yang ketat. Alat Sterilisasi Dan Validasi Metode Sterilisasi Jaminan sterilitas produk parenteral tergantung pada proses yang dilakukan untuk mensterilkan produk. Semakin besar kontrol, semakin besar jaminan sterilitas. Proses kontrol sterilitas melibatkan pengetahuan dan manajemen variabel proses seperti suhu, tekanan, konsentrasi, kelembaban, konfigurasi beban, dan filter integritas dan variabel produk seperti komposisi larutan dan viskositas, spesifikasi kemasan, dan konten mikroba. Empat metode dasar yang digunakan untuk mensterilkan sediaan parenteral: 1. Panas, baik basah (uap) dan kering. 2. Gas, terutama etilen oksida. 3. Radiasi, terutama kobalt 60, iradiasi gamma dan berkas elektron. 4. Filtrasi melalui membrane filter. Mekanisme dan teknik dari masing-masing proses harus dipahami dan dikendalikan dengan baik untuk untuk mendapatkan jaminan tambahan terhadap produk steril. Untuk mengetahui tingkat sterilitas suatu proses dan produk dapat digunakan indikator biologis. Metode ini dapat sebagai indikator dilihat dari produk yang dapat menjadi tempat berkempang biak suatu mikroba kontaminan. Selain itu indikator biologis bisa menjadi faktor validasi masa hidup produk steril. Kontrol Lingkungan Suatu tempat produksi dan pengujian produk steril sangat mutlak diatur sedemikian rupa untuk menghindari dari kontaminan lingkungan. Seperti contoh runag kelas 100 yaitu tidak ada lebih dari 100 partikel dengan ukuran 0,5 atau lebih dalam 1ft kubik. Maka ada perlu penanganan khusus untuk mendapatkan suatu syarat tempat produksi sediaan steril: 1. Laminar air flow(LAF)

Yaitu suatu kondisi penghilangan partikel pada lingkungan produksi, dengan metode memberikan semburan udara dalam ruang produksi, namun dengan ketentuan udara yang dialirkan mengalami prakondisi penyaringan yang sangat ketat.

Gambar 4. Vertical laminar air flow bench (Akers, 2002)

Gambar 5. Horizontal laminar air flow bench (Akers, 2002) 2. Design and Maintenance of Aseptic Areas yaitu merancang suatu tempat produksi sediaan steril agar dapat memenuhi persyaratan tempat produksi. Dilihat dari: sirkulasi udara, kelembaban, sirkulasi air, material sediaan, operator, peralatan, kontruksi bangunan, dll. 3. Methods of Evaluating the Environment Yaitu pengujian apakah tempat produksi memenuhi syarat atau tidak. Pengujian dibedakan menjadi 2,yaitu: air sampling dan surface sampling. Air sampling: Slit-Air Sampler : yaitu pengujian aliran udara dengan media agar untuk mengetahui pertumbuhan bakteri. Media agar diletakkan pada lubang sirkulasi udara.

 Liquid Impinger : yaitu menggunakan alat vakum untuk mengambil lembab dari udara kemudian hasil cairan tersenut diinkubasi dalam agar. Electronic Air Particle Counters: menggunakan alat untuk menghitung partikel di udara, namun tidak bisa untuk membedakan partikel yang layak atau tidak dalam lingkungan. Settling Plates : yaitu penggunaan media dalam plat ditempatkan di beberapa titik ruangan, dibuka selama 2-4 jam kemudian diinkubasi. Cara ini paling sederhana, namun satu plate tidak diketahui volume udara yang diwakili. Centrifugal Air Sampler : yaitu mensentrifugasi udara dengan kecepatan tertentu untuk mendapatkan partikel, kemudian hasinya diinkubasi. Sieve Impaction Air Sampler : yaitu penyaringan udara partikel udara diendapkan dalam membrane, kemudian hasil endapan diinkubasi. Surface-Sampling Methods Rodac Plates : yaitu pembuatan agar padat steril kemudian diusapkan pada permukaan dari ruangan yang telah dipilih. Kemudian agar dimasukan dalam media dan diinkubasi. Swab-Rinse Test : yaitu pengambilan cuplikan dari permukaan ruangan dengan kapas steril kemudian diusapkan pada media dan diinkubasi. Training Personel Syarat sediaan steril mutlak bebas dari kontaminan, maka sediaan sangat rentan terhadap kontaminan dari lingkungan dan operator pekerja. Maka pemahaman prosedur kerja aseptis sangat diperlukan untuk menjamin kesterilan dari produk. Dari GMP memberikan aturan dasar pengetahuan kerja secara aseptis: 1. Aturan umum untuk diikuti jika seseorang bekerja di ruang steril 2. Tepat teknik kerja 3. Tepat penggunaan meja kerja LAF atau lingkungan steril lainnya 4. Khusus operasional sangat penting menggunakan prinsi aseptis dalam melakukan uji sterilitas 5. Tepat pembersihan pada akhir tes steril (peralatan, tempat kerja, dll) Alternatif uji sterilitas Sudah dijelaskan diatas bahwa keterbatasan uji sterilitas dari USP, misalnya; sedikit sampel tidak bisa untuk mempresentatifkan kesterilan seluruh produk, perlu dilakukan uji pada seluruh produk. Maka persyaratan ini tidak cocok dilakukan di apotek ataupun pada

rumah sakit karena beberapa keterbatasan yaitu : ruang laboratorium, biaya, waktu, prosedur. Dari masalah tersebut disarankan bahwa syarat uji steril dapat diganti atau dengan syarat alternatif lain yang sesuai. Beberapa metode sederhana dapat digunakan sebagai indikator bahwa produk tersebut steril misanya : penginkubasian sampel pada media dan ditentukan aktivitas mikroba, serta perlakuan sediian difiltrasi dengan Millipore. Pada pengujian sterilitas alternatif ini tentunya dibantu fase eksternal dari sistem untuk menjaga validitas dari hasil uji (negatif palsu). Beberapa faktor yang dapat dikendalikan untuk mencegah kontaminan waktu pengujian : ruangan pendekatan yang sesuai dengan ruang steril, kondisi aseptis, pemahaman pekerja tentang prosedur aseptis, dan penggunaan alat dan bahan yang benar dan steril.

DAFTAR PUSTAKA Akers, M. J., dan Larrimore D. S., 2002, Parenteral Quality Control, Marcel Dekker, New York, pp. 1-109 ---------, 2004, Guidance for Industry, Sterile Drug Products, Produced by Aseptic Processing, Current Good Manufacturing Practice, Pharmaceutical CGMPs

DISKUSI 1. Bagaimana bisa mengetahui apakah media yang digunakan bisa untuk tumbuhnya mikroba? Jawab : dengan melakukan Growth Promotion Test, yaitu dengan cara menambahkan mikroba pada media. Mikroba yang digunakan antara lain: Staphylococcus aereus, Pseudomonas aeroginosa, atau Candida albicans. Dari sini akan diketahui apakah media yang digunakan bisa untuk pertumbuhan mikroba tersebut. 2. Sediaan apa yang bisa digunakan untuk sterility test Direct Transfer/Direct Inocolution Method dan Membrane Filtration Method? Jawab : Direct Transfer/Direct Inocolution Method nonfilterable liquids, ointments and oils insoluble in isopropyl myristate, solids to test media, purified cotton, gauze, surgical dressings, sutures, and related articles, sterilized devices. Membrane Filtration Method liquids miscible with aqueous vehicles, liquids immiscible with aqueous vehicles, less than 100 ml per container ointments and oils soluble in isopropyl myristate, prefilled syringes, solids for injection other than antibiotics, antibiotic solids for injection, antibiotic solids, bulks, and blends, sterile aerosol products, devices with pathways labeled sterile. 3. Apabila didapatkan hasil positif palsu/negative palsu bagaimana penanganannya? Jawab : Mengecek proses sterility test yang digunakan dan mencari letak kesalahan dalam proses sebab positif palsu diperoleh karena terjadi kontaminasi selama pengujian yang dilihat dari perbedaan hasil pada replikasi. Mengecek sensitivitas metode yang digunakan.