Metode

Uji daya hambat enzim -glukosidase.

Pengujian aktivitas daya hambat terhadap enzim -glukosidase dapat dilakukan secara in
vivo dan in vitro. Metode spektrofotometrik banyak digunakan dalam pengujian in vitro
dengan menggunakan pseudo-substrat, seperti p-nitrofenil- -D- glukopiranosida (pNG) dan
enzim -glukosidase bebas, atau juga secara pseudo in vivo menggunakan sel pankreas
penghasil enzim -glukosidase.
Daya hambat terhadap aktivitas -glukosidase dipelajari secara pseudo-substrat, dengan
mengetahui kemampuan sampel untuk menghambat reaksi hidrolisis glukosa pada substrat p-
nitrofenil- -D- glukopiranosida (pNG). Setelah mengalami hidrolisis substrat akan
terhidrolisis menjadi -D- glukosa dan p-nitrofenil yang berwarna kuning (Sugiwati 2005).

Gambar 1. Hidrolisis pNG oleh enzim -glukosidase.

Prinsip uji daya hambat enzim -glukosidase adalah warna kuning yang dihasilkan
merupakan indikator kemampuan inhibitor untuk menghambat reaksi yang terjadi. Semakin
besar kemampuan inhibitor untuk menghambat maka produk yang dihasilkan semakin sedikit
atau warna larutan setelah inkubasi lebih cerah dibandingkan dengan larutan tanpa inhibitor
(Sugiwati 2005).
a) Pembuatan larutan acarbose 1% (b/v) (Glucobay)
Acarbose (Glucobay) memiliki kemampuan untuk menghambat enzim -glukosidase
(antidiabet), sehingga digunakan sebagai kontrol positif. Cara pembuatannya adalah
sebagai berikut : 1 g tablet glucobay diencerkan dengan larutan HCl 2N sebanyak 100
ml (HCl 2N : akuades, 1:1) kemudian disentrifuse dan diambil supernatannya yang
merupakan acarbose 1%.
b) Pembuatan pNG 10 mM 6 ml.
pNG merupakan substrat. Sebanyak 0.0180 g pNG dilarutkan dalam buffer fosfat pH
7 hingga mencapai volume 6 ml. Kemudian akan dibagi dalam 6 konsentrasi yakni
0.1, 0.5, 1, 5, dan 10 ppm.
c) Pembuatan larutan enzim -glukosidase.
Sebanyak 1 mg enzim -glukosidase dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7. Sebelum
digunakan enzim terlebih dahulu diencerkan 25 kali dengan menggunakan buffer
fosfat pH 7.
d) Pembuatan Na2CO3 200 mM 25 ml.
Sebanyak 0.52995 Na2CO3 dilarutkan dengan buffer fosfat pH 7 sehingga mencapai
volume 25 ml dengan menggunakan labu ukur 25 ml.
e) Pembuatan larutan sampel 1%.
Sampel dibuat dalam 5 perbedaan konsentrasi yakni 1, 10, 100, 1000, 10.000 ppm.
Dengan menggunakan pengenceran bertingkat. Sebanyak 10 mg sampel ditambahkan
dengan 1 ml DMSO, dan larutan ini merupakan larutan stok dengan konsentrasi
10.000 ppm, yang selanjutnya akan diencerkan dengan DMSO untuk mendapatkan
konsentrasi 1, 10, 100, dan 1000 ppm
f) Uji daya hambat enzim -glukosidase.
Campuran reaksi terdiri dari 25 l 20 mM p-nitrofenil- -D- glukopiranosida (pNG)
sebagai substrat, 50 l 100 mM buffer fosfat pH 7, 10 l larutan sampel dalam
DMSO dan 25 l larutan enzim. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu
370C selama 30 menit. Setelah diinkubasi tambahkan 100 l Na2CO3 200 mM untuk
menghentikan reaksi enzim. Kemudian dibaca absorbansinya pada spektrofotometer
dengan panjang gelombang 410 nM.
 Hasil

Konsentrasi ppm 0 1 10 100 1000 10000

KPI 1 K(-) 0.054 0.054 0.055 0.054 0.06 0.213
Absorbansi U1 1.01 1.086 1.135 1.123 1.243 1.498
U2 0.999 1.07 1.199 1.076 1.235 1.386
U3 0.952 1.067 0.986 0.999 1.186 1.275
Absorbansi U1 0.956 1.032 1.08 1.069 1.183 1.285
Terkoreksi U2 0.945 1.016 1.144 1.022 1.175 1.173
U3 0.898 1.013 0.931 0.945 1.126 1.062
% inhibisi U1 -7.950 -12.971 -11.820 -23.745 -34.414
U2 -7.513 -21.058 -8.148 -24.339 -24.127
U3 -12.806 -3.675 -5.234 -25.390 -18.263
Rata-rata -9.423 -12.568 -8.401 -24.491 -25.601

(a)

Konsentrasi ppm 0.000 0.100 0.500 1.000 5.000 10.000

GLUCOBAY K(-) 0.053 0.053 0.053 0.052 0.052 0.053
Absorbansi U1 0.736 0.661 0.332 0.258 0.107 0.093
U2 0.865 0.659 0.354 0.249 0.104 0.093
U3 0.711 0.575 0.367 0.203 0.12 0.093
Absorbansi U1 0.683 0.608 0.279 0.206 0.055 0.04
Terkoreksi U2 0.812 0.606 0.301 0.197 0.052 0.04
U3 0.658 0.522 0.314 0.151 0.068 0.04
% inhibisi U1 10.981 59.151 69.839 91.947 94.143
U2 25.369 62.931 75.739 93.596 95.074
U3 20.669 52.280 77.052 89.666 93.921
Rata-rata 19.006 58.120 74.210 91.736 94.379

(b)

Tabel 1. (a) Hasil absorbansi dan % inhibisi sampel (konsentrat protein ikan); (b) Hasil
absorbansi dan % inhibisi acarbose (glucobay)

Dari tabel di atas terlihat bahwa nilai rata-rata % inhibisi sampel (konsentrat protein ikan)
tidak ada aktivitas penghambatan karena nilai % inhibisinya < 0% untuk semua konsentrasi,
sedangkan untuk kontrol positif (acarbose) % inhibisi terendah 19.006% pada konsentrasi
acarbose 0.1 ppm dan tertinggi pada 10 ppm dengan % inhibisi 94.379%.
 GLUCOBAY y = 15.963ln(x) + 63.792
R = 0.9296
120.000

100.000

80.000
% inhibisi

y = 17.674ln(x) + 61.973
60.000 R = 0.9271
40.000
y = 15.021ln(x) + 67.789
20.000 R = 0.9351

0.000
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000
ppm

Gambar 2. Grafik Hubungan antara % inhibisi dengan konsentrasi glucobay

Y a b ln (x) X( IC 50) STDEV

50 15.96 63.79 -0.86404 0.42146
50 17.67 61.97 -0.67742 0.50793
50 15.02 67.78 -1.18375 0.30613
Rata-rata IC 50 0.41184 0.101243

Tabel 2. Nilai IC 50

Dari tabel di atas terliht bahwa, nilai IC 50 adalah 0.41184, artinya bahwa dengan konsentrasi
0.44347 ppm glucobay mampu untuk menghambat 50% aktivitas enzim -glukosidase

Konsentrasi ppm 0 1 10 100 1000 10000

KPI 2 K(-) 0.055 0.056 0.056 0.062 0.058 0.096
Absorbansi U1 1.219 1.133 1.245 1.331 1.197 1.626
U2 1.145 1.352 1.251 1.38 1.397 1.579
U3 1.064 1.111 1.028 0.945 1.216 1.587
Absorbansi U1 1.164 1.077 1.189 1.269 1.139 1.53
Terkoreksi U2 1.09 1.296 1.195 1.318 1.339 1.483
U3 1.009 1.055 0.972 0.883 1.158 1.491
% inhibisi U1 7.474 -2.148 -9.021 2.148 -31.443
U2 -18.899 -9.633 -20.917 -22.844 -36.055
U3 -4.559 3.667 12.488 -14.767 -47.770
Rata-rata

(a)
Konsentrasi ppm 0.000 0.100 0.500 1.000 5.000 10.000
GLUCOBAY K(-) 0.054 0.053 0.054 0.053 0.052 0.054
Absorbansi U1 0.78 0.769 0.308 0.223 0.131 0.083
U2 0.922 0.808 0.445 0.296 0.118 0.111
U3 0.785 0.565 0.33 0.274 0.131 0.095
Absorbansi U1 0.726 0.716 0.254 0.17 0.079 0.029
Terkoreksi U2 0.868 0.755 0.391 0.243 0.066 0.057
U3 0.731 0.512 0.276 0.221 0.079 0.041
% inhibisi U1 1.377 65.014 76.584 89.118 96.006
U2 13.018 54.954 72.005 92.396 93.433
U3 29.959 62.244 69.767 89.193 94.391
Rata-rata 14.785 60.737 72.785 90.236 94.610

(b)

Tabel 3. (a) Hasil absorbansi dan % inhibisi sampel (konsentrat protein ikan); (b) Hasil
absorbansi dan % inhibisi acarbose (glucobay)

Dari tabel di atas terlihat bahwa nilai rata-rata % inhibisi sampel (konsentrat protein ikan)
terendah 2.148% pada konsentrasi 100 ppm dan tertinggi 7.474% pada konsentrasi 1 ppm,
sedangkan untuk kontrol positif (acarbose) % inhibisi terendah 14.755% pada konsentrasi
acarbose 0.1 ppm dan tertinggi pada 10 ppm dengan % inhibisi 94.610%.

glucobay y = 13.73ln(x) + 66.595

R = 0.9707
120.000

100.000

80.000
% inhibisii

y = 17.478ln(x) + 61.958
60.000 R = 0.9354
40.000 y = 18.963ln(x) + 62.145
R = 0.8487
20.000

0.000
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000
ppm

Gambar 3. Grafik Hubungan antara % inhibisi dengan konsentrasi glucobay

 Y a b ln (x) X( IC 50) STDEV
50 13.73 66.59 -1.2083 0.29870
50 17.47 61.95 -0.68403 0.50458
50 18.96 62.14 -0.6403 0.52714
Rata-rata IC 50 0.44347 0.12588

Tabel 4. Nilai IC 50

Dari tabel di atas terliht bahwa, nilai IC 50 adalah 0.44347, artinya bahwa dengan konsentrasi
0.44347 ppm glucobay mampu untuk menghambat 50% aktivitas enzim -glukosidase.