PERCOBAAN 2 : TEKNIK ISOLASI KULTUR MURNI

BAGIAN A. ISOLASI KOLONI DAN KULTUR CAMPURAN

TUJUAN

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu mengetahui cara melakukan proses isolasi
kultur campuran dan mengetahui jenis mikrobia tertentu dari suatu koloni, melakukan
penyimpanan suatu kultur murni mikroorganisme dengan menggunakan teknik tertentu
misalnya teknik penyimpanan jangka pendek, serta dapat menghitung jumlah dan
pengkarakterisasi mikrobia dari suatu koloni. Serta digunakan dalam mengisolasi koloni
secara terpisah pada awalnya terbentuk jumlah inoculum yang tereduksi, sehingga koloni
yang terbentuk lebih terpisah.

PRINSIP

Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya
yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Cara isolasi bakteri dilakukan
dengan metode tuang (pour plate), metode goresan (streak plate), metode miring (slant
culture), dan metode tegak (stab culture).

Praktikum kali ini kami semua menggunakan medium NA (Nutrien Agar). Dimana medium
ini berfungsi sebagai tempat mikroba itu tumbuh. Mikroorganisme yang dibiakkan di
laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium
yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang
akan ditumbuhkan.

Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung
semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu,
dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik.

ALAT DAN BAHAN

Alat : Bahan :

Bunsen Biakan murni Hasil Percobaan A

Batang Gelas L Nutrien Agar

Jarum Inokulasi
CARA KERJA

(Tertulis di jurnal praktikum)

HASIL PENGAMATAN

No Hasil Pengamatan Keterangan

2.
ANALISIS

Pada Percobaan ini digunakan beberapa jeniscara kerja dalam pembuatan jenis inokulasi
biakan bakteri yaitu dengan menggunakan cara streak plate spread plate, dan pour plate. Dan
beberapa penjelasannya antara lain sebagaimana berikut,

1. Metode Tuang (pour plate)

Medium NA steril di siapkan (suhu 45 – 500 C)

Teteskan 1ml akuades steril ke dalam cawan petri steril kosong, usahakan
tetesan di tengah cawan
 Di masukkan satu ose bakteri (dari acara I medium NA makanan) ke dalam
cawan petri, campurkan dengan akuades yang telah diteteskan

Tuang medium NA ke dalam cawan, ratakan

Cawan petri di bungkus, di inkubasi selama 2 hari dalam posisi terbalik

2. Metode goresan (streak plate)

Medium NA steril di siapkan (suhu 45 – 500 C)

Medium di tuang ke dalam cawan petri steril, ratakan, biarkan dingin dan
memadat

Goreskan 1 ose bakteri (dari acara I medium NA makanan) pada agar dalam
cawan petri, tutup cawan di buka secukupnya

Goreskan dengan metode kuadran

Sterilkan jarum ose dengan cara di bakar dengan lampu spiritus setiap akan di
gunakan

Cawan petri di bungkus, diinkubasi selama 2 hari

3. Agar Miring (slant culture)

Siapkan medium agar miring steril dalam tabung reaksi

Goreskan 1 ose bakteri dari kultur murni secara zig zag pada permukaan agar,
di mulai dari ujung tabung sampai akhir medium

Tabung reaksi di tutup dengan kapas atau plastik

 Diinkubasi selama 2 hari

4. Agar Tegak (stab culture)

Siapkan medium agar tegak steril dlaam tabung reaksi

Tusukkan 1 ose bakteri ke dalam agar sepanjang kira kira ¾ bagian

Tabung reaksi di tutup dengan kapas atau plastik

Diinkubasi selama 2 hari

Prinsip biakan murni ialah memisahkan satu jenis (spesies) mikroba (bakteri dan
jamur) dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Teknik
biakan murni, populasi mikroba dialam sekitar kita besar lagi kompleks. Berates-ratus spesies
berbagai mikroba biasanya menghuni bermacammacam bagian tubuh kita. Mereka terdapat
dalam jumlah yang luar biasa besarnya. Sebagai contoh sekali berdin dapat menyebabkan
beribu-ribu mikroorganisme. Alam sekitar kita udara, tanah, air juga duhuni kumpulan
mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mmikroorganisme dalam berbagai habitat,
memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini atau biakan
campuran menjadi spesies-spesies yang berbeda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri
dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari sel indul, pupulasi mikroba merupakan
populasi campuran dari berbagai mikroorganisme atau disebut juga biakan campuran. Teknik
biakan campuran digunakan untuk memisahkan berbagai macam bakteri tersebut.
Pertumbuhan biakan murni adalah memisahkan satu jenis spesies dengan spesies lainnya,
hanya mengambil satu spesies saja. Teknik biakan murni ini biasanya dengan media buatan,
dengan membuat suatu media agar yang diberi nutrisi, dan protein sebagai makanan mikroba
agar mikroba yang ditumbuhkan tetap hidup. Pada percobaan ini dilakukan praktikum tentang
pembuatan biakan murni dengan menggunakan dua metode yaitu metode cawan gores (streak
plate) dan metode cawan totol. Berdasarkan percobaan pada metode cawan gores pada media
NA SP1 tampak bakteri yang tumbuh pada media agar yang digores, dan berwarna putih,
tetapi bakteri tidak tumbuh sesuai dengan yang diharapkan karena pada saat penggoresan
antara first streak, second streak, dan third streak tidak benar melakukannya. Sedangkan pada
media NA SP2 tampak bakteri yang tumbuh pada media ini berwarna putih kekuningan tetapi
hasilnya tidak sesuai yang ada pada modul. Karena salah pada saat pengoresan, sehingga
goresangoresan mikroba yang ditanam tidak jelas pertumbuhan mikrobanya.
Kemudian dilakukan percobaan goresan pada media NA didapatkan hasil pada SP1
mikroba tumbuh, ada tumbuh hifa dan hifa berwarna putih. Dan kemudian pada SP2
didapatkan hasil mikroba juga tumbuh ada hifa dan hifa berwarna putih keabu-abuan. Metode
cawan gores (streak plate). Kesulitan dari metode ini yaitu proses penggoresan yang cukup
lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan keagagalan. Prinsip
metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain,
sehingga mempermudah proses isolasi. Cara mempersiapkan agar cawan, yaitu cairkan media
agar dengan memanaskannya baik-baik dalam air mendidih, kemudian dinginkan hingga
suhu 45oC – 47oC. Pendinginan akan mengurangi pengembunan air jika agar cair didapatkan
dalam cawan-cawan petri. Lalu tuangkan agar yang telah dingin kedalam cawan petri bertutp
steril. Setelah itu, segeralah letakkan tutup cawan ketempatnya semula, angkat cawan dan
miringkan perlahan-lahan dari satu sisi ke sisi lain untuk menyebarkan agar keseluruh bagian
dasar cawan sehingga merata.
Setelah agar cawan siap mikroba disebarkan pada permukaan agar dengan
menggunakan jarum ose yang steril yang telah disiapkan diletakagar dengan menggunakan
jarum ose yang steril yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat, kemudian
menggoreskan jarum ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-
4 kali membentuk garis horizontal disatu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api Bunsen,
setelah kering ose tersebut digunakan untuk mengores-goreskan sebelumnya pada sisi cawan
kedua. Pada metode ini, goresan disisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan
berhimpit, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula
selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain.
Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptic agar tidak terjadi kontaminasi.
Metode gores digunakan untuk media NA, biasanya metode gores ini digunakan
untuk bakteri. Teknik metode ini dengan memindahkan mikroba yang tumbuh dalam media
NA biakan campuran menggunakan jarum ose yang telah pijar diatas lampu Bunsen,
kemudian ambil mikroba dengan ose, kemudian goreskan ke seluruhan pada media agar.
Tunggu sampai 48 jam diinkubasi. Manfaat biakan murni yaitu mendapatkan 1 jenis spesies
dan mempelajari morphology, fisiologi, biokimia, genetika, atau kegiatan apapun dari
mikkroba hanya dapat dilakukan apabila kita telah mempunyai isolate murni. Dalam
melakukan percobaan ini terdapat faktor kesalahan yaitu praktikan yang salah dalam
menggoreskan dan kurangnya ketelitian, sehingga pertumbuhan biakan murni tidak
didapatkan. Dan apabila praktikan langsung menggunakan jarum ose yang masih panas
sehingga membuat mikroba yang akan ditumbuhkan mati.

KESIMPULAN

Teknik penyimpanan mikroorganisme terlebih dahulu dilakukan Isolasi. Isolasi

mikroorganisme dilakukan dengan teknik dilusi atau pengenceran, dimana hasil dari teknik
ini adalah 8 sampel, yaitu 10-1 - 10-8 pengenceran. Pengenceran ini merupakan langkah awal
untuk mendapatkan isolat jamur yang baik. Tahap berikutnya adalah menggunakan teknik
Pour Plate. Teknik ini akan memisahkan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme, dimana dilakukan dengan mencampurkan media agar cair dengan kultur
bakteri hasil dilusi. Pemeliharaan bakteri dapat dilakukan pada agar slants atau biasa disebut
agar miring. Karakteristik mikroorganisme dilakukan melalui pengamatan langsung dibawah
mikroskop. Karakteristik bakteri terdiri atas bentuk, konfigurasi, elevasi, tekstur, konsistensi,
ciri optik dan pigmentasi. Sedangkan karakteristik jamur ditentukan miselium, bentuk,
konfigurasi, garis radial dan pigmentasi.

BAGIAN B. ISOLASI KULTUR MURNI DARI CAWAN PETRI BAGIAN A

TUJUAN

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu mengetahui cara melakukan proses isolasi
dan pemurnian jenis mikrobia tertentu dari suatu koloni, melakukan penyimpanan suatu
kultur murni mikroorganisme dengan menggunakan teknik tertentu misalnya teknik
penyimpanan jangka pendek, serta dapat menghitung jumlah dan pengkarakterisasi mikroba
dari suatu koloni.

PRINSIP

Mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan

pertumbuhannya. Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung sulfur
dan ada pula yang tidak mampu hidup dan seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan
mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan
mikroba. Saat terpisah-pisah mikroba dapat berkembang baik pada permukaan nutrian agar,
tiap jenis koloni diambil dengan jarum penanam steril dan dipindahkan ke agar mirin g.
Setiap biakan agar miring ini menggambarkan pertumbuhan spesies bakteri tunggal dan
disimpan sebagai biakan murni.

ALAT DAN BAHAN

Bunsen Biakan murni (Serratia marcescens dan Escherchia

Cawan Petri Coli, Sarcina lutea)

Jarum Inokulasi Nutrien Agar

Alkohol 95%

CARA KERJA

(Tertulis di jurnal praktikum)

HASIL PENGAMATAN

No Hasil Pengamatan Keterangan

2.
ANALISIS

Jumlah sampel A1 lebih tinggi karena mikroorganisme tersebut dapat survive dan
kebutuhan nutriennya lebih tercukupi daripada sampel lainnya. Pertumbuhan mikroba pada
medium tersebut di pengaruhi oleh faktor lingkungan yaitu temperatur optimum, merupakan
temperatur pada saat pertumbuhan terbaik mikroorganisme. Pada temperatur yang sangat
tinggi akan terjadi denaturasi protein sedangkan pada temperatur yang sangat rendah aktivitas
enzim akan berhenti (Lim, 2006). Suhu akan mempengaruhi pertumbuhan mikroba ,jenis
mikroba dapat survive pada suhu yang berbeda beda pada praktikum ini suhu yang digunakan
dalam inkubator sekitar 40 – 41oC. Aktivitas metabolisme mikroorganisme menghasilkan
sisa buangan seperti asam hasil degradasi karbohidrat, dan alkali hasil pemecahan protein
yang dapat mempengaruhi pH lingkungan. Penurunan dan peningkatan pH akan
mempengaruhi kecepatan reaksi kimia. Hal ini disebabkan karena adanya kerusakan enzim
seluler yang dapat mengganggu pertumbuhan (Fardiaz, 2002). Pada praktikum ini pH
medium tumbuh sekitar 6.5-7 ,pH tersebut bersifat netral tidak terlalu asam dan basa.
Osmosis merupakan pergerakan molekul air (pelarut) melalui membran semipermeabel dari
konsentrasi larutan yang tinggi ke konsentrasi rendah. Pada praktikum ini medium dilusi awal
sampai akhir jumlah pertumbuhan mikroba (jamur dan bakteri) semakin menurun karena jika
nutrisi dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) dan NA (Nutrien Agar) semakin lama
jika diencerkan akan larut ke dalam air akibatnya jika diencerkan terus menerus maka jumlah
mikroorganisme (bakteri dan jamur) yang tumbuh dalam kedua medium tersebut semakin
lama maka semakin berkurang karena nutrisi di dalam medium telah terlarut dalam air.
Pengaruh medium instan dan konvensional yaitu medium instan lebih efektif digunakan
untuk pertumbuhan mikroba (bakteri dan jamur) karena proses pembuatannya sudah
dilakukan oleh pabrik dan dijamin lebih steril namun harganya lebih mahal serta sulit
didapatkan namun medium konvensional tidak lebih efektif digunakan untuk medium
pertumbuhan mikroba karena pembuatannya secara manual dan dapat terkontanminasi
mikroba lain namun harga bahan yang digunakan untuk medium konvensional tergolong
murah. Jumlah bakteri CFU/g yang diperoleh dalam praktikum ini adalah E1 = 24,5.104 ,E2
= 19,2.104 , F1 = 7,9.104, F2 = 4,6.104 dan jumlah jamur yang diperoleh adalah sebesar
Jumlah jamur CFU/g G1 = 16.10- 3 ,G2 = 3,2.10-3, H1 = 0,8.10-3 ,H2 = 6,2.10-3.
Karakteristik bakteri yang didapat berdasarkan bentuk koloni, konfigurasi, elevasi, tekstur,
konsistensi, membran tipis, ciri optik, dan pigmentasi sangat beragam.
KESIMPULAN

BAGIAN C. KARAKTERISTIK BIAKAN MIKROORGANISME DARI BAGIAN A

TUJUAN

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui cara melakukan proses isolasi dan
pemurnian jenis mikrobia tertentu dari suatu koloni, melakukan penyimpanan suatu kultur
murni mikroorganisme dengan menggunakan teknik tertentu misalnya teknik penyimpanan
jangka pendek. Praktikum ini juga bertujuan menentukan biakan mikroorganisme sebagai
salah satu alat bantu untuk mengidentifikasi dan mengklasifikasikan organisme sesuai dengan
kelompok taksonominya.

PRINSIP

Mikroorganisme memiliki perbedaan penampakan makroskopis dalam

perkembangannya apabila ditumbuhkan dalam media yang berbeda-beda. Perbedaan yang
terjadi dikarenakan mikroorganisme memiliki karakteristik kultural. Karakteristik kultural
digunakan sebagai dasar untuk memisahkan mikroorganisme ke dalam kelompok-kelompok
taksonominya. Pada praktikum kali ini, dilakukan pengidentifikasian pada koloni
mikroorganisme yang tumbuh pada media nutrient agar cawan. Saat tumbuh pada medium
yang berbeda, mikroorganismeakan memperlihatkan penampakan mikroskopis yang sangat
berbeda antara medium satu dengan medium lainnya. Perbedaan ini yang disebut dengan
kaakteristik biakan juga. Digunakan sebagai dasar pemisahan mikroorganisme ke dalam
kelompok taksnominya. Karakteristik biakan ini ditentukan dengan menanam organisme pada
medium Agar miring nutrisi. Pola pertumbuhan pada setiap bakteri sangatlah berbeda
tergantung jenis bakteri dan juga jenis medium yang digunakannya.

CARA KERJA

(Tertulis di jurnal praktikum)

HASIL PENGAMATAN

No Hasil Pengamatan Keterangan

2.
ANALISIS

Jumlah sampel A1 lebih tinggi karena mikroorganisme tersebut dapat survive dan
kebutuhan nutriennya lebih tercukupi daripada sampel lainnya. Pertumbuhan mikroba pada
medium tersebut di pengaruhi oleh faktor lingkungan yaitu temperatur optimum, merupakan
temperatur pada saat pertumbuhan terbaik mikroorganisme. Pada temperatur yang sangat
tinggi akan terjadi denaturasi protein sedangkan pada temperatur yang sangat rendah aktivitas
enzim akan berhenti (Lim, 2006). Suhu akan mempengaruhi pertumbuhan mikroba ,jenis
mikroba dapat survive pada suhu yang berbeda beda pada praktikum ini suhu yang digunakan
dalam inkubator sekitar 40 – 41oC. Aktivitas metabolisme mikroorganisme menghasilkan
sisa buangan seperti asam hasil degradasi karbohidrat, dan alkali hasil pemecahan protein
yang dapat mempengaruhi pH lingkungan. Penurunan dan peningkatan pH akan
mempengaruhi kecepatan reaksi kimia. Hal ini disebabkan karena adanya kerusakan enzim
seluler yang dapat mengganggu pertumbuhan (Fardiaz, 2002). Pada praktikum ini pH
medium tumbuh sekitar 6.5-7 ,pH tersebut bersifat netral tidak terlalu asam dan basa.
Osmosis merupakan pergerakan molekul air (pelarut) melalui membran semipermeabel dari
konsentrasi larutan yang tinggi ke konsentrasi rendah. Pada praktikum ini medium dilusi awal
sampai akhir jumlah pertumbuhan mikroba (jamur dan bakteri) semakin menurun karena jika
nutrisi dalam medium PDA (Potato Dextrose Agar) dan NA (Nutrien Agar) semakin lama
jika diencerkan akan larut ke dalam air akibatnya jika diencerkan terus menerus maka jumlah
mikroorganisme (bakteri dan jamur) yang tumbuh dalam kedua medium tersebut semakin
lama maka semakin berkurang karena nutrisi di dalam medium telah terlarut dalam air.
Pengaruh medium instan dan konvensional yaitu medium instan lebih efektif digunakan
untuk pertumbuhan mikroba (bakteri dan jamur) karena proses pembuatannya sudah
dilakukan oleh pabrik dan dijamin lebih steril namun harganya lebih mahal serta sulit
didapatkan namun medium konvensional tidak lebih efektif digunakan untuk medium
pertumbuhan mikroba karena pembuatannya secara manual dan dapat terkontanminasi
mikroba lain namun harga bahan yang digunakan untuk medium konvensional tergolong
murah. Jumlah bakteri CFU/g yang diperoleh dalam praktikum ini adalah E1 = 24,5.104 ,E2
= 19,2.104 , F1 = 7,9.104, F2 = 4,6.104 dan jumlah jamur yang diperoleh adalah sebesar
Jumlah jamur CFU/g G1 = 16.10- 3 ,G2 = 3,2.10-3, H1 = 0,8.10-3 ,H2 = 6,2.10-3.
Karakteristik bakteri yang didapat berdasarkan bentuk koloni, konfigurasi, elevasi, tekstur,
konsistensi, membran tipis, ciri optik, dan pigmentasi sangat beragam.

KESIMPULAN