Pemeriksaan HBsAg metode ELISA

Hari/tanggal : Kamis, September 2019

I. Tujuan

Untuk menentukan secara kuantitatif adanya Hepatitis B Surface Antigen (HBSAg)

di dalam serum atau plasma pasien

II. Metode

Metode yang digunakan yaitu ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay)

III.Prinsip

Antibody ganda “sandwich” imunosai yang menggunakan antibodi anti-HBsAg

spesifik: antibodi monklonal HBsAg yang berada di dasar sumur mikrotiter dan antibodi
poliklonal HBsAg ditambahkan dengan Horseradish Peroxidase (HRP) sebagai larutan
konjugat. Selama pemeriksaan, adanya HBsAg dalam spesimen akan bereaksi dengan
antibodi-antibodi tersebut untuk membentuk kompleks imun “antibodi-HBsAg-
antibodi- HRP”. Setelah materi yang tidak terikat tercuci selama pemeriksaan, substrat
ditambahkan untuk menunjukkan hasil tes. Munculnya warna biru di sumur mikrotiter
mengindikasikan HBsAg reaktif. Tidak adanya warna menunjukkan hasil non reaktif di
spesimen.

IV. Dasar teori

Penyakit hepatitis B disebabkan oleh infeksi virus hepatitis B (VHB). Virus ini
menyerang sel hati dengan melekat pada reseptor spesifik di membran hepatosit dan
melakukan penetrasi ke dalam sitoplasma hepar. Perjalanan klinis dan diagnosis infeksi
VHB ditandai dengan pemeriksaan serologi terhadap antigen dan antibodi yang
terbentuk dan beredar di sirkulasi. Penanda serologi yang pertama kali dapat dideteksi
yaitu HBsAg yang muncul 2 minggu sebelum timbul gejala. (Rina, dkk., 2006)

Deteksi HBsAg dapat dilakukan dengan beberapa metode pemeriksaan, yaitu

serologi dan Polymerase Chain Reaction(PCR). Uji serologi antara lain menggunakan
metode Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme Linked Immunoassay (ELISA), Enzyme
Linked Flouroscent Assay (ELFA), Immunochromatography Test (ICT) atau rapid test,
Radio Immunoassay (RIA), dan Chemiluminescent Microparticle Immunoassay
(CMIA). Sedangkan untuk mendeteksi DNA virus dapat digunakan PCR. (Rina, dkk.,
2006)

ELISA adalah suatu singkatan bahasa Inggris yang disebut dengan : (Enzyme-
linked immunosorbent assay) atau penetapan kadar immunosorben taut-enzim yang
merupakan suatu uji serologis. Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun
1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Menggunakan teknik ELISA dalam bidang
imunologi untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu
sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang
berfungsi sebagai pelapor/signal. Selanjutnya digunakan sebagai uji kualitatif untuk
mengetahui keberadaan suatu antibodi/antigen dengan menggunakan antibodi/antigen
spesifik. Teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur
kadar antibodi/antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa
spektrofotometer dan dengan cara menentukan jumlah penambahan kadar
antibodi/antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standard antara kadar antibody atau
antigen yang dapat dihitung berdasarkan absorbansinya.( Ichwan, 2014)
ELISA dianggap pemeriksaan yang memiliki spesifitas dan sensitifitas yang
tinggi yang mampu menunjang diagnosa klinis hepatitis B. ELISA ( EIA ) dibagi
menjadi dua macam yaitu homogenous EIA dan heterogenous EIA. Homogenous EIA
berguna untuk pemeriksaan bahan obat-obatan, hormon dan lain-lain. Sedangkan
heterogenous EIA berguna untuk pemeriksaan bahan yang memiliki berat molekul besar
misalnya antigen dan antibodi. Pemeriksaan parameter petanda serologis hepatitis B
termasuk dalam kelompok kedua yaitu heterogenous EIA.
Ada tiga tahapan penting dalam uji ELISA yaitu :
1. Pelapisan ( coating ) dengan antigen atau antibodi pada plate ( Phase padat ).
Pelapisan dengan dengan antigen untuk penentuan antibodi untuk penentuan antigen.
2. Penambahan bahan yang ditentukan ( diperiksa ), misalnya serum, plasma, saliva
dan cairan tubuh yang lain.
3. Penambahan detektor yang berfungsi untuk mendeteksi ikatan Ag – Ab yang terjadi.
Ada dua detektor yang digunakan yaitu :
a. Penambahan konjugat yaitu antigen atau antibodi yang
berlabel enzim, misalnya Horse Radish Peroxidase ( HRPO). Alkaline
Phosphatase,Urease,Glukose-Oxidase(GOP) dan lain-lain.
b. Penambahan substrat yang berfungsi memberi perubahan
warna pada reaksi. Misalnya TMB (Tetra Methyl Benzidine, O-
Toluidine, OPD, ABTS dan lain-lain.
ELISA sendiri terdiri dari beberapa macam metode diantaranya ELISA
kompetitif, ELISA double sandwich antigen atau antibodi dan indirect ELISA yang
ketiganya memiliki prinsip dasar reaksi yang sama yaitu reaksi Ag - Ab. (Faizal, 2011)
V. Alat dan bahan

a. Alat c. Reagen
1. Sumur mikrotiter 1. Enzym Conjugate
2. Mikropipet 2. Positif Control
3. Tip 3. Negatif Control
4. Inkubator 4. Sampel dilluent
5. Elisa reader 5. Color A dan B
6. Elisa washer 6. Stop Solution
b. Sampel 7. Wash Buffer
1. Sampel serum pasien

VI. Cara Kerja

a. Pembuatan Wash Buffer
1. Wash buffer pekat dicampurkan dengan aquadest perbandingan (1:19)
2. Campuran yang sudah jadi disimpan pada suhu ruang selama seminggu
b. Prosedur Pemeriksaan
1. Semua reagen dan specimen dikondisikan pada suhu ruang
2. Siapkan nomor yang dibutuhkan untuk sumur, yang terdiri dari 1 sumur blanko,
2 sumur control positif, 2 sumur untuk control negatif dan 1 sumur untuk setiap
specimen. Tulis nomor seri untuk control dan specimen pada kolom.
3. Spesimen diluents ditambahkan sebanyak 20µl pada masing-masing sumur
4. Spesimen, control negative, control positif ditambahkan sebanyak 100µl sesuai
dengan kolom data. (sediakan 1 sumur untuk blanko)
5. Kemudian dihomogenkan
6. Plate diinkubasi pada incubator suhu 37o C ± 1 jam
7. Enzym conjugate ditambahkan pada setiap sumur ± 50µl
8. Plate diinkubasi pada incubator suhu 37o C ± 30 menit
 9. Setiap sumur dicuci dengan wash buffer dengan prosedur :
 Pencucian yang dilakukan harus sesuai dengan petunjuk apabila ada
pencucian yang tidak sempurna maka akan mempengaruhi hasil.
 Semua isi sumur dimasukkan pada labu cuci. Kemudian ditambhakan wash
buffer 350/lebih.
 Pastikan tidak ada cairan di dalam tip dan setelah pemipetan terakhir.
10. Color A & B dimasukkan pada setiap sumur sebanyak 50µl
11. Plate diinkubasi pada waterbath/incubator 37o ± 30 menit
12. Hentikan reaksi dengan penambahan 50µl stopping solotion disetiap sumur
13. Absorbansi setiap sumur dibaca pada λ 450nm & λ 630nm
14. Perhitungan
 Single wave length (λ450nm)
OD = OD450 – ODBC450
= sampel – control

 Dual wave length (λ630nm)

OD = OD450/630
VII. Interpretasi hasil
Hasil pemeriksaan valid jika :
1. Nilai OD blanko kurang dari 0.100 ( sumur dari kontrol blanko hanya berisi
kromogen dan stop solution)
2. Nilai OD kontro negatif harus sama atau kurang dari () 0.100. Dieliminasi kontrol
negatif dengan nilai OD lebih besar dari () 0.100. Jika 2 nilai keluar dari batas,
pemeriksaan invalid dan harus di ulangi.
3. Nilai OD kontrol positif sama atau lebih besar () 0.500. Jika nilai OD kurang dari
0.500, pemeriksaan invalid dan harus di ulangi.
Perhitungan kontrol :
Nilai cut-off :
CO= NCx . 2,1
NCx : nilai absorbansi rata-rata kontrol negative (jika NCx  0.05 , NCx harus dihitung
0.05)
Interpretasi hasil :
1. Spesimen dengan absorbansi kurang dari (<) nilai cut-off dinyatakan negatif.
2. Spesimen dengan nilai absorbansi lebih besar atau sama dengan () nilai cut-off
dinyatakan positif.

VIII. Hasil pengamatan

Contoh
Identitas sampel :
 Jenis sampel : serum
 Gambar sumur mikrotiter

12

11

A B C D E F G H

Hasil pemeriksaan HBsAg Elisa

Sumur Nama sampel Kode Hasil

sampel/Jenis pemeriksaan
kelamin
A12 Blanko - 0.134
B12 Kontrol positif - 3.227
C12 Kontrol positif - 2.996
D12 Kontrol negative - 0.601
E12 Kontrol negative - 0.47
F12 Ni Nyoman Lasia 11/P 3.697
G12
H12
H11 Suhaili 33/L 3.631
G11
F11
E11 Indra Pradani Sulaiman 2.161

Pembacaan absorbansi dilakukan pada single wavelength yaitu 450nm sehingga :

 Nilai OD kontrol positif

a. OD = OD450 – ODBC450 b. OD = OD450 – ODBC450

= 3.227 – 0.134 = 2.996 – 0.134
= 3.093 = 2.862

 Nilai OD kontrol negatif

a. OD = OD450 – ODBC450 b. OD = OD450 – ODBC450
= 3.227 – 0.134 = 2.996 – 0.134
= 3.093 = 2.862

Pada perhitungan di atas, nilai OD kontrol positif lebis besar dari 0.500 yang
berarti pemeriksaan valid. Namun nilai OD kontrol negatif dan blanko lebih besar dari
0.100, hasil tersebut belum bisa dikatakan invalid karena kemungkinan terjadi
kontaminasi pada saat pencucian dengan Elisa washer sehingga pemeriksaan tidak
diulang dan dianggap valid. Berikut merupakan perhitungan kontrol :
 Cut-off
NCx =

CO = NCx . 2,1
= 0.5355 . 2,1
= 1.12455
Berdasarkan nilai cut-off , nilai sampel yang diperiksa dari F12 sampai E11 melebihi
nilai cut-off sehingga sampel tersebut dinyatakan positif atau reaktif terdapat HBsAg.

IX. Kesimpulan
Berdasarkan pemeriksaan HBsAg metode Elisa terhadap sampel ……. Didapatkan
hasil positif terdapat HBsAg.

X. Daftar pustaka

Ichwan. 2014. Teknik Elisa Pemeriksaan Kuantitatif Mannan Binding Lectin (MBL)
Pada Plasma Darah. Online.
http://openwetware.org/images/archive/a/aa/20140115131831!
Teknik_Elisa_(_Ichwan_Alamsyah_Lubis_).pdf
Rina, dkk., 2006. Faktor Risiko Hepatitis B pada Tenaga Kesehatan Kota Pekanbaru.
Online.
http://journal.fk.unpad.ac.id/index.php/mkb/article/viewFile/245/pdf_107

Faizal. 2011. Perbandingan Prevalensi Hbsag Positif Pada Penderita Yang

Memeriksakan Diri Di Rumah Sakit Islam Gondang Legi Malang Dengan
Metode Elisa. Malang; Akademi Analis Kesehatan Malang