Pada pewarnaan gram bakteri digunakan kristal violet sebagai cat utama yang diberikan

paling awal pada bakteri. Fungsi cat utama kristal violet yaitu memberi warna primer pada
bakteri. Setelah itu, pemberian larutan mordan lugol iodine dimaksudkan untuk meningkatkan
afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi
lebih kuat. Setelah penambahan larutan lugol iodine, zat warna akan lebih jelas terlihat dan zat
warna lebih sulit dilarutkan (Xu et al., 2017)

Pada sel bakteri gram negatif, larutan peluntur alkohol aseton dapat meningkatkan
porositas dinding sel dengan melarutkan lipid lapisan luar. Jadi, kompleks kristal violet dapat
lebih mudah dihilangkan dari lapisan peptidoglikan yang tidak terikat dengan kuat. Sehingga
larutan alkohol asetat membuat sel-sel menjadi kehilangan warna atau tidak berwarna. Sel
bakteri gram negatif yang mengalami kehilangan warna dapat menyerap pewarna tandingan.
Sedangkan Gram-positif mempertahankan warna ungu dari kristal violet sebagai pewarna
primer (Rahayu dan Muhammad, 2017)

Penambahan cat tandingan safranin tidak menyebabkan perubahan warna pada bakteri
gram positif, karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding
sel. Namun, pada bakteri gram negatif, penambahan safranin menyebabkan sel bakteri
berwarna merah karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium telah larut oleh pelarut
alkohol aseton. Sehingga dinding sel bakteri gram negatif mengikat zat warna safranin yang
berwarna merah. Fungsi zat warna safranin hanyalah sebagai pembeda (kontras) terhadap zat
warna kristal violet (Hidayat dan Fatri, 2012)

Staphylococcus aureus Dewi, 2013 Pseudomonas Prihanto dkk., 2018

Berdasarkan Tabel 1.1 diperoleh hasil perwarnaan bakteri yang diamati melalui
mikroskop dengan perbesaran 1000x. Perwarnaan gram dilakukan terhadap bakteri
Pseudomonas dan Staphylococcus aureus. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil bahwa
bakteri Pseudomonas berbentuk batang. Setelah dilakukan proses pewarnaan, didapatkan
warna merah. Sehingga bakteri Pseudomonas termasuk dalam bakteri gram negatif. Hasil
tersebut sesuai dengan gambar referensi serta teori Suyono dan Farid (2011) bahwa bakteri
Pseudomonas memiliki karakteristik berbentuk batang (rods) atau kokus (coccus), aerob
obligat, dan merupakan bakteri gram negatif. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil
bahwa bakteri Staphylococcus aureus berbentuk bulat. Setelah dilakukan proses pewarnaan,
didapatkan warna ungu. Sehingga bakteri Staphylococcus aureus termasuk dalam bakteri gram
positif. Hasil tersebut sesuai dengan gambar referensi serta teori Lutpiatina (2017) bahwa
bakteri Staphylococcus aureus berbentuk coccus atau bulat bergerombol dan berwarna ungu
atau tergolong bakteri gram positif.

Bakteri gram positif mempertahankan zat warna kristal violet sehingga warnanya
tampak ungu tua. Sedangkan bakteri gram negatif kehilangan kristal violet ketika dicuci dengan
alkohol dan ketika diberi pewarna tandingan safranin tampak bewarna merah. Perbedaan warna
tersebut terjadi karena perbedaan ketebalan dinding peptidoglikan bakteri. Bakteri gram negatif
memiliki peptidoglikan lebih tipis dibandingkan dengan bakteri gram positif (Rahmi dkk.,
2015). Dinding sel bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi
dibandingkan dinding sel bakteri Gram positif. Lipida tersebut akan larut dalam larutan
peluntur alkohol aseton yang digunakan sebagai larutan pemucat, sehingga pori-pori dinding
sel membesar dan meningkatkan daya larut kompleks kristal violet pada dinding sel bakteri
gram negatif. Perbedaan ketebalan dinding ini mengakibatkan perbedaan kemampuan afinitas
dengan pewarna gram (Harris et al., 2002).