Journal Reading

HUBUNGAN MEROKOK DAN KEHAMILAN EKTOPIK:

MENGAPA NIKOTIN BURUK BAGI TUBA FALLOPII

Oleh:
Adeana Sartika
Ardina Kamillia
Aulia Oktariani
Dwi Ambar Wati
Mira Astuti
Rahmatul Mufidah
Wiwit Asari

Pembimbing :
dr. Eddy R. Pangaribuan, Sp.OG (K)
dr. Rika Effendy, Sp.OG

KEPANITERAAN KLINIK SENIOR

BAGIAN OBSTETRI DAN GINEKOLOGI
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS RIAU
PEKANBARU
2021
Hubungan Merokok dan Kehamilan Ektopik: Mengapa Nikotin Buruk bagi
Tuba Fallopii

Andrew W. Horne1*, Jeremy K. Brown1, Junko Nio-Kobayashi1,2, Hazirah B. Z.

Abidin1, Zety E. H. A. Adin1,Lyndsey Boswell1, Stewart Burgess3, Kai-Fai Lee4,
W. Colin Duncan1*

1
MRC Centre for Reproductive Health, The Queen’s Medical Research Institute,
The University of Edinburgh, Edinburgh, United Kingdom,
2
Laboratory of Histology and Cytology, Hokkaido University Graduate School of
Medicine, Sapporo, Japan,
3
Moredun Research Institute, Pentlands Science Park, Penicuik, United Kingdom,
4
Department of Obstetrics and Gynaecology, Li Ka Shing Faculty of Medicine,
The University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong, China

Abstrak

Studi epidemiologi menunjukkan bahwa merokok merupakan faktor risiko utama

untuk terjadinya kehamilan ektopik tuba namun alasannya masih belum jelas.
Pada penelitian ini menjelaskan efek rokok pada ekspresi gen tuba Fallopii. Sel
epitel tuba fallopi (OE-E6 / E7) dan eksplan tuba fallopi manusia dari wanita tidak
hamil (n = 6) yang terpapar konsentrasi kotinin yang relevan secara fisiologis,
prinsip metabolit nikotin, dan perubahan gen ekspresi wajah dianalisis
menggunakan array Illumina Human HT-12. Gen sensitif terhadap kotinin
diidentifikasi melalui proses ini kemudian dilokalisasi dan dikuantifikasi dalam
biopsi tuba fallopi dari wanita perokok tidak hamil (n = 10) dan wanita bukan
perokok (n = 11) menggunakan pemeriksaan imunohistokimia dan TaqMan RT-
PCR. Prinsip kontinin yaitu menginduksi perubahan dalam ekspresi gen yang
dideteksi oleh analisis array pada kedua eksplan dan garis sel secara signifikan
menurunkan regulasi (P, 0,05) dari gen pro-apoptosis BAD. Oleh karena itu,
penulis menilai efek merokok pada peristiwa pergantian sel manusia yang
dikumpulkan secara retrospektif. Berbagai data yang dikumpulkan secara
konsisten didapatkan bahwa merokok dikaitkan dengan penurunan kadar transkrip
BAD (P, 0,01) dan peningkatan kadar transkrip BCL2 (P, 0,05) pada biopsi tuba
fallopi. Imunolabel spesifik BAD dan BCL2 terlokalisasi pada epitel tuba Fallopii.
Meskipun tidak ada perbedaan signifikan lainnya dalam tingkat apoptosis atau
protein terkait siklus sel yang diamati, merokok terkait dengan perubahan
signifikan dalam morfologi epitel tuba fallopi (P, 0,05).

Kesimpulan: Merokok dapat mengubah pergantian sel epitel tuba dan terkait
dengan perubahan struktural, serta fungsional, yang mungkin berkontribusi pada
perkembangan kehamilan ektopik.

PENDAHULUAN
Kehamilan ektopik terjadi pada 1–2% dari semua kehamilan di Eropa dan
Amerika Serikat1. Di dunia Barat, hal itu menjadi komplikasi dari kehamilan dini
yang paling umum yang mengancam jiwa1,2.
Lebih dari 98% kehamilan ektopik terjadi di tuba fallopii tetapi etiologi
implantasi tuba sebagian besar tidak diketahui 3. Namun demikian, observasi
deskriptif mendukung hipotesis bahwa implantasi tuba mungkin disebabkan oleh
retensi embrio di dalam tuba fallopi karena gangguan transportasi tuba dan
perubahan pada lingkungan mikro tuba memungkinkan implantasi dini terjadi.
Pengangkutan embrio melalui tuba fallopii dikontrol dengan kombinasi
kontraktilitas otot polos dan pergerakan siliaris 4,5. Faktor-faktor yang mengatur
dan mempertahankan keadaan normal lingkungan mikro tuba sebagian besar tidak
diketahui.
Studi epidemiologi menunjukkan bahwa merokok adalah faktor risiko
utama untuk kehamilan ektopik tuba (disesuaikan OR 1,7-3.9)6. Penelitian pada
hewan dan manusia telah menunjukkan efek terhadap fungsi tuba fallopi akibat
paparan asap7,8. Terlepas dari temuan ini, mekanisme yang tepat yang digunakan
merokok menyebabkan kehamilan ektopik masih belum pasti.
 Peneliti terbaru melaporkan bahwa kotinin (zat metabolit aktif dari nikotin)
meningkatkan ekspresi prokineticin PROKR1 di tuba fallopi, pengatur
kontraktilitas otot polos dan sebuah gen yang dianggap penting untuk implantasi
intrauterine9. Kami mengemukakan bahwa merokok melemahkan ekspresi
PROKR1 yang mengakibatkan perubahan fungsi tuba fallopii dan memberikan
penjelasan yang mungkin terhadap hubungan antara merokok dan kehamilan
ektopik tuba. Dalam studi ini, kami mengambil temuan ini dengan menyelidiki
bagaimana merokok mengubah ekspresi gen global dan fungsi sel epitel tuba.

Bahan dan Metode

1. Pengumpulan Tuba Fallopi dan Serum Manusia

Persetujuan etis untuk penelitian ini diperoleh dari Komite Etik Penelitian
Lothian (04 / S1103 / 20), dan persetujuan tertulis diperoleh dari semua wanita
yang berpartisipasi dalam penelitian ini. Sampel serum (10 ml) dan biopsi tuba
fallopi (2–3 cm) dari regio ampulla tuba fallopii yang dikumpulkan dari peserta
pada saat histerektomi untuk kondisi ginekologi jinak. Wanita berusia antara 18
dan 45 tahun. Semua biopsi dikumpulkan pada fase pertengahan luteal dari siklus
menstruasi, dan fase siklus kemudian dikonfirmasi oleh kadar estradiol dan
progesteron yang diukur dalam sampel serum seperti yang dijelaskan
sebelumnya10. Riwayat merokok diperoleh dari semua pasien. Pada bagian
pertama dari studi biopsi dari non-perokok (n = 3) dibawa ke laboratorium dalam
fosfat buffered saline (PBS) untuk kultur eksplan.9 Pada bagian kedua dari studi
biopsi (n = 21) dibagi menjadi bagian yang setara dan i) direndam dalam
RNAlater (Ambion, Texas, USA) pada 4⁰C semalam dan kemudian dibekukan
pada 80⁰C untuk ekstraksi RNA, atau ii) tetap dalam formalin 4% dengan buffer
netral semalaman pada 4⁰C diikuti dengan penyimpanan dalam etanol 70%, dan
selanjutnya ditanamkan dalam lilin parafin untuk pewarnaan imunohistokimia.
Sampel serum disimpan pada 20⁰C sampai analisis. Nomogram Altman
menunjukkan bahwa ukuran sampel 8 di setiap kelompok akan memiliki kekuatan
80% pada tingkat signifikansi 5% untuk menunjukkan perbedaan standar deviasi $
1,4 antara dua kelompok, jika ada.

Gambar 1. Diagram yang membandingkan data array di masing-masing dari empat

kelompok analitik. Dalam garis sel OE-E6 / 7, penambahan 40 ng / ml cotinine ('Sel Rendah')
mengubah ekspresi 946 gen (meningkatkan 585 gen dan mengurangi ekspresi 361 gen). Dari 676
gen (361 meningkat dan 315 berkurang) diubah dengan penambahan 400 ng / ml cotinine ('High
Cell'), 135 dibagikan dengan pengobatan 'Low Cell'. Pada eksplan Tuba Falopii, penambahan 40
ng / ml cotinine ('Jaringan Rendah') mengubah ekspresi 596 gen (137 meningkat dan 459
berkurang). Perawatan eksplan dengan 400 ng / ml cotinine ('Jaringan Tinggi') mengubah 2.419
gen (meningkatkan 313 dan mengurangi 2106), 265 di antaranya digunakan bersama dengan
perawatan 'Jaringan Rendah'. Oleh karena itu, efek kotinin dalam tuba Fallopii terutama untuk
menghambat ekspresi gen. Ketika membandingkan efek kotinin dalam sel OE-E6 / 7 bila
dibandingkan dengan eksplan Tuba Falopii, gen umum diidentifikasi. Ada 16 gen yang diubah
kelompok 'Jaringan Rendah' dibagi dengan kelompok 'Sel Rendah' dan 27 gen yang dibagikan
dengan kelompok 'Sel Tinggi'. Ada 111 gen yang mengubah ekspresi yang sama antara kelompok
'Jaringan Tinggi' dan 'Sel Rendah' dan 54 dengan kelompok 'Sel Tinggi'. Hanya ada satu gen yang
diatur ke atas dan satu gen yang diatur ke bawah yang sama untuk semua kelompok. doi: 10.1371 /
journal.pone.0089400.g001
2. Pengukuran Konsentrasi Serum Kotinine
Konsentrasi serum kotinin diukur menggunakan kit ELISA kotinin langsung
(Immunalysis, Pomona, CA), sesuai dengan instruksi pabrik. Analisa data ELISA
dihubungkan dengan riwayat merokok yang diberikan oleh para peserta.
Hubungan yang sangat kuat diamati antara konsentrasi kotinin serum dan status
merokok pasien yang dilaporkan sendiri9. Semua perokok memiliki konsentrasi
serum kotinin lebih dari 160 ng / ml sedangkan konsentrasi dalam serum non-
perokok tidak melebihi 12 ng / ml, menegaskan bahwa kotinin adalah biomarker
yang baik untuk merokok. Pada non-perokok memiliki kadar serum cotinine
kurang dari 40 ng / ml9 . Kami menggunakan potongan ini untuk membagi sampel
menjadi dua kelompok:
a) non-perokok (cotinine, <40 ng / ml) (n = 11) dan
b) perokok (kotinin .>40 ng / ml) (n = 10)

Gambar 2. Analisis TaqMan RT-PCR kelimpahan transkrip BAD dan BCL2 pada TUBA
FALOPII dari perokok dan bukan perokok. Ekspresi relatif dari BAD (A) dan BCL2 (B) di
TUBA FALOPII non-perokok (batang bening: n = 11) dan perokok (batang terisi: n = 10).
Perbedaan yang diamati signifikan pada * P, 0,05, ** P, 0,01. Ekspresi gen terkait dengan
pengendalian internal G6PDH.

doi: 10.1371 / journal.pone.0089400.g002

3. Paparan Garis Sel Epitel Tuba Fallopi (OE-E6 / E7) terhadap Kotinin
Sel OE-E6 / E7 [11] dipertahankan dalam media DMEM / F12 yang
dilengkapi dengan 10% serum sapi (media pertumbuhan) dalam 5% CO2 pada
37⁰C. Sel ditanam dengan jumlah 500.000 disatukan dalam wadah yang terbagi
menjadi 12 bagian dan diinkubasi selama 24 jam. Media pertumbuhan kemudian
dihilangkan dan sel dicuci satu kali dengan PBS, setelah itu DMEM / F12 bebas
serum (media pemeliharaan) ditambahkan dan sel-sel dipertahankan semalaman.
Sel-sel tersebut kemudian dipaparkan dengan 40 ng / ml cotinine (n = 3) (Sigma-
Aldrich, Dorset, UK), yang mewakili konsentrasi kotinin dalam serum perokok
pasif, dan 400 ng / ml (n = 3), konsentrasi rata-rata ditemukan dalam serum
perokok aktif12. Semua sel, termasuk kontrol, (n = 3) diperlakukan dengan jumlah
yang setara dengan etanol (0,16% v / v) untuk mengontrol pengencer kotinin. Sel
diperlakukan selama 8 jam (waktu yang dibutuhkan untuk perubahan ekspresi gen
untuk diamati dalam penelitian kami sebelumnya)9 dan kemudian media diangkat
dan sel dipanen menjadi 300 ml buffer RLT (Qiagen, West Sussex, UK) yang
mengandung 10 ml / ml b-mercaptoethanol dan disimpan pada -80⁰C sampai
ekstraksi RNA. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga (dan ulangan
dikumpulkan). RNA diekstraksi menggunakan easy kit RNA (Qiagen, West
Sussex, UK), sesuai dengan petunjuk pabrik yang menyertakan langkah
perawatan DNase. Konsentrasi RNA kemudian diuji kualitasnya dan dihitung
menggunakan Spektrofotometer Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
Gambar 3. Imunohistokimia. A) BAD (coklat) diekspresikan di epitel (E), paling menonjol ke
arah lumen (L), dari Tuba Falopii dan bukan di stroma (S). B) immunolabelling BCL2 (coklat)
menunjukkan pewarnaan epitel yang dominan dengan pewarnaan sel sesekali di stroma. C)
Immunolabelling BCL2 dengan daya yang lebih tinggi menunjukkan tidak adanya pewarnaan pada
sel epitel bersilia (panah hitam) dengan pewarnaan pada sel interspaced tanpa silia yang jelas
(panah merah). D) Pemindaian EM yang menyoroti dua populasi sel epitel dengan dan tanpa silia.
E) Sel apoptosis (coklat) diidentifikasi dengan immunolabelling untuk caspase 3. Tanda panah
menunjukkan sel apoptosis di epitel tuba. F) Tampilan daya yang lebih tinggi menunjukkan sel
yang diwarnai untuk caspase 3 yang dibelah (panah) di persimpangan epitel dan stroma. G) Sel
diwarnai dengan penanda proliferasi Ki-67 (coklat). H) Tampilan daya yang lebih tinggi
menunjukkan sel yang diwarnai untuk Ki-67 (panah) di epitel tuba. I) Gambar representatif dari
bagian TUBA FALOPII dari perokok yang mengalami immunostained untuk BAD yang
menunjukkan tonjolan halus apikal atau 'perdarahan epitel' (panah). J) Bagian Tuba Falopii
immunostained untuk BAD dengan sel epitel bersilia tanpa 'lepuh epitel' permukaan.

4. Paparan Eksplan Tuba Fallopii Manusia Terhadap Kotinin

Kultur eksplan tuba fallopi dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya 9.
Eksplan dipaparkan dengan 0 ng / ml (n = 3), 40 ng / ml (n = 3) atau 400 ng / ml
cotinine (n = 3) dan diolah sekali lagi dengan jumlah yang setara dengan etanol
untuk mengontrol pengencer kotinin. Perlakuan dilakukan pada eksplan duplikat
yang kemudian dikumpulkan selama 8 jam, pada saat media kultur diangkat
kemudian jaringan ditempatkan dalam 300 ml reagen Trizol (Invitrogen, Paisley,
UK) dan dibekukan pada -80⁰C sampai ekstraksi RNA. RNA diekstraksi
menggunakan Trizol (Invitrogen) sesuai dengan instruksi. Setelah ekstraksi RNA
dilakukan perawatan DNAase dilanjutkan dengan pembersihan sampel
menggunakan easy kit RNA (Qiagen, West Sussex, Inggris). Setelah dilakukan
ekstraksi, konsentrasi RNA dihitung seperti yang dijelaskan di atas.

Gambar 4. Penilaian kematian sel di Tuba Fallopii. A) Frekuensi sel imunopositif dalam
Tuba Fallopii bukan perokok (batang bening: n = 11) dan perokok (batang terisi: n = 10).
Ekspresi relatif transkrip CASP3 (B) dan CASP9 (C) dalam Tuba Fallopii perokok dan bukan
perokok dan (D) korelasi satu sama lain dalam sampel Tuba Fallopii tunggal. Perbedaan yang
diamati signifikan pada *P, 0,05. Ekspresi gen terkait dengan pengendalian internal G6PDH.
doi: 10.1371 / journal.pone.0089400.g004

5. Analisis Microarray pada Sel OE-E6 / 7 dan Eksplan Tuba Fallopii

yang Terpapar Kotin
Pengaruh kotinin pada sel dan ekspresi gen tuba diperiksa menggunakan
mikroarray Illumina Human HT-12. Analisis array dilakukan di GeneSpring GX
12.0 (Agilent Technologies). Data mentah diproses sebelumnya untuk
menghilangkan variabilitas seluruh sampel dalam array. Untuk meminimalkan
variabilitas non-biologis di seluruh susunan, data mentah diubah log2 dan
kemudian dikuantilkan normalisasi. Proses filter selanjutnya dari data yang
dinormalisasi, dilakukan untuk menghapus transkrip invarian berdasarkan tanda
kualitas dan nilai ekspresi yang dinormalisasi. Peta panas dibuat berdasarkan rata-
rata fold change untuk setiap gen dalam susunan untuk memvisualisasikan tingkat
korelasi antara sampel individu dan kelompok perlakuan dan menunjukkan bahwa
tingkat korelasi yang tinggi antara sampel dan kelompok perlakuan. Protokol
prosedur eksperimental, metode analisis dan data microarray tersedia sebagai
informasi tambahan dalam database ArrayExpress yang sesuai dengan MIAME
dari European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress).
Diferensial analisis ekspresi gen dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya13.
Singkatnya, setelah penilaian eksplorasi, analisis statistik yang ketat dieksploitasi
untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda. Empat kelompok
perlakuan [Sel Rendah (40 ng / ml OE-E6 / 7: n = 3), Sel Tinggi (400 ng / ml OE-
E6 / 7: n = 3), Jaringan Rendah (40 ng / ml eksplan: n = 3), Jaringan Tinggi (400
ng / ml eksplan: n = 3)] dibandingkan dengan masing-masing pengencer (etanol)
hanya sampel kontrol (n = 3 per kelompok) menggunakan perbandingan uji-T
berpasangan dengan titik potong P yaitu 0,05 dan titik potong perubahan lipatan >
1.1. Gen yang diidentifikasi dengan metode ini dibandingkan dengan masing-
masing dari empat kelompok analitik dan setiap kecocokan gen
didokumentasikan.

6. RT-PCR Kuantitatif untuk Ekspresi Gen Tuba Fallopii

Messenger RNA diekstraksi dari sampel tuba fallopi seperti yang dijelaskan
sebelumnya10 dan ditranskripsikan terbalik menjadi cDNA menggunakan
hexamers acak. Real time PCR kuantitatif (QRT-PCR) dilakukan pada sistem
deteksi urutan siklus panas ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems)
menggunakan primer yang telah divalidasi sebelumnya (Eurogentec Ltd.,
Southampton, UK). Ekspresi gen terkait dengan kontrol internal G6PDH (Applied
Biosystems). Kontrol negatif termasuk Taq polymerase, RT negatif (mengandung
template hRNA tetapi tidak ada enzim RT) dan air RT (mengandung RT tetapi
tidak ada template RNA). Semua sampel dianalisis dalam rangkap dua dan
perbandingan relatif dibuat dengan cDNA korpus luteum manusia14. Semua
analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Prism (GraphPad SoTuba
Falopii ware, La Jolla, USA). Uji-T berpasangan digunakan jika data terdistribusi
normal dengan standar deviasi serupa, jika tidak, uji non-parametrik Mann-
Whitney digunakan. Perbedaan dianggap signifikan bila P, 0,05.

Gambar 5. Penilaian perubahan proliferasi dan morfologi sel pada Tuba Falopii perokok. A)
Frekuensi sel positif Ki67 di TUBA FALOPII non-perokok (batang bening: n = 11) dan perokok
(batang terisi: n = 10). B) Ekspresi Relatif Transkrip Cyclin D1 dalam TUBA FALOPII perokok
dan non perokok Ekspresi CCND1 dalam TUBA FALOPII perokok dan bukan perokok. C)
Analisis histoscore derajat 'lepuh epitel' pada non-perokok dibandingkan dengan perokok.
Perbedaan yang diamati signifikan pada * P, 0,05. Ekspresi gen terkait dengan pengendalian
internal G6PDH. doi: 10.1371 / journal.pone.0089400.g005

7. Imunohistokimia dari Tuba Fallopii

Lilin parafin garam formal (FFPE) dipasang pada slide bermuatan Snow
Coat X-tra (Surgipath Europe, Peterborough, UK), dikeringkan dalam xylene,
direhidrasi dan dikenai antigen dengan dipanaskan selama 20 menit dalam 10 mM
natrium sitrat (pH 6.0), sebelum memblokir endogen peroksidase dengan hidrogen
peroksidase 3% (Sigma, Dorset, UK). Blok avidin-biotin (Vector Laboratories,
Peterborough, Inggris) dan blok protein (Dako, Ely, UK) dilakukan semalam
sebelum inkubasi dengan antibodi primer (Tabel S2 di Berkas S1). Kontrol negatif
termasuk inkubasi dengan konsentrasi imunoglobulin non-spesifik yang setara
serta antibodi primer yang dihilangkan. Kemudian diinkubasi dengan antibodi
sekunder terbiotinilasi dan ABC-Elite (Vector Laboratories). Imunolabel positif
divisualisasikan menggunakan 3,3-diaminobenzidine (ImmPACT DAB: Vector
Laboratories). Kemudian dilakukan counterstain dengan menggunakan Mayer's
Haematoxylin dan dipasang dengan penutup kaca No. 1.5 menggunakan Pertex
(Cellpath PLC, Hemel Hempstead, UK).

8. Analisis Immunostaining
Gambaran histologis ditangkap menggunakan Olympus Provis Mikroskop
BX2 (Olympus America Inc. Center Valley, PA, USA) yang dilengkapi dengan
kamera Microcam Canon E0S 30D (Canon Inc Kantor Pusat, Tokyo, Jepang).
Leukemia sel B / limfoma 2 (BCL2) dan agonis kematian sel BCL2 (BAD)
intensitas imunolabel epitel, dan tingkat lepuh permukaan pada bagian yang
diwarnai untuk BAD, dinilai dengan skala empat poin oleh dua pengamat yang
buta identitas jaringan, dengan korelasi yang sangat baik, dan rata-rata. Analisis
statistik dilakukan dengan menggunakan uji Mannwhitney. Untuk penilaian
jumlah pembelahan caspase 3 dan sel positif Ki-67, lima bidang diidentifikasi dan
ditangkap menggunakan teknik pengambilan sampel acak. Menggunakan Image J
(http: //rsbweb.nih.gov/ij) perangkat lunak dengan ambang jumlah sel dan jumlah
sel yang diwarnai yang dhitung. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan
uji Mann Whitney.

9. Pemindaian Mikroskopi Elektron

Bagian-bagian yang mewakili dari biopsi tuba fallopi yang disimpan dalam
formalin buffer netral didehidrasi melalui serangkaian larutan etanol (50 hingga
100% v / v). Pemindaian electron Mikroskop dilakukan seperti yang dijelaskan
sebelumnya15. Secara singkat, spesimen dikeringkan titik kritis dari cairan CO2
dan dipasang pada potongan aluminium berlapis karbon, dan dilapisi dengan
karbon yang diuapkan menggunakan unit pelapis vakum Edwards 306. Sampel
kemudian diperiksa dengan menggunakan Cambridge mikroskop electron
Stereoscan.
Hasil

Analisis Microarray Pemberian kotinin pada Sel dan Eksplan

Data Microarray tersedia sebagai informasi tambahan dalam database
ArrayExpress sesuai MIAME Institut Bioinformatika Eropa;
http://www.wbi.ac.uk/arrayexpress situs web; nomor aksesi E-MTAB-12390.
Setelah melakukan analisis eksploratif menggunakan data microarray, didapatkan
statistik ketat untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda.
Kemudian dilakukan perbandingan secara berpasangan antara eksplan tuba
fallopii dan epitel tuba fallopii yang terpapar pada tiap konsentrasi kotinin dan
sampel kontrol dengan titik potong nilai-p sebesar 0.05 dan rasio fold change
sebesar >1.1, dengan perbedaan up-down regulated ekspresi gen sebesar 10%.
Hasil gen yang diidentifikasi dengan metode tersebut kemudian dibandingkan
masing-masing dari empat kelompok analitik dan setiap gen yang sesuai akan
dicatat (ringkasan dari Gambar 1). Namun hanya terdapat satu gen up-regulated
dan satu gen down-regulated dari semua kelompok. Gen down-regulated yang
difokuskan adalah BAD pro apaptosis dan gen up-regulated adalah NCL yang
berhubungan dengan siklus sel. Oleh karena itu, efek kotinin secara in vitro pada
sel dan jaringan berhubungan dengan siklus pergantian sel. Kami kemudian
menggunakan temuan ini sebagai langkah awal untuk menilai efek merokok pada
siklus pergantian sel pada biopsi tuba Fallopii yang dikumpulkan secara
retrosprektif dari kelompok perokok dan non-perokok, dengan memfokuskan pada
jalur BAD/BCL2.

Ekspresi BAD Berkurang secara Signifikan pada Tuba Fallopii Perokok dan
Ekspresi BCL2 Meningkat ketika dibandingkan dengan Non-Perokok.
Ekspresi NCL tidak mengalami perubahan pada tuba fallopii perokok jika
dibandingkan dengan non-perokok (data tidak ditampilkan). Namun didapatkan
ekspresi mRNA BAD yang lebih rendah (sekitar 1.5 fold; P<0.01) dan ekspresi
BCL2 yang lebih tinggi (sekitar 1.5 fold; P<0.05) pada tuba fallopii perokok
dibandingkan non-perokok (Gambar 2). Data tersebut menunjukkan adanya
hubungan antara ekspresi, cotinine serum BAD dan BCL2 tuba Fallopii pada
perokok.

BAD dan BCL2 terlokalisasi pada Epitel Tuba Fallopii

Epitel daerah ampula tuba fallopii manusia ditemukan mengekspresikan
BAD dan gen pro-survival BCL2 berdasarkan imunohistokimia (Gambar 3A-C).
Walaupun BAD diekspresikan pada sitoplasma semua sel epitel, namun BCL 2
hanya diekspresikan oleh beberapa sel epitel saja. Analisa menunjukkan ketiadaan
ekspresi gen tersebut dalam sel bersilia (Gambar 3B) dan ditemukan dalam sel
non-silia yang permukannya seperti bula (Gambar 3C). Perbedaan jenis sel pada
epitel tuba fallopii dapat dilihat dengan jelas menggunakan EM.

Caspase dan Kematian Sel pada Tuba Fallopii Perokok dibandingkan Non-
Perokok
Untuk menyelidiki efek dari perubahan ekspresi BAD dan BCL2 pada tuba
fallopii, kami melakukan immunolocalize caspase 3 untuk mengidentifikasi sel
apaptosis di jaringan (Gambar 3E-F). Sel yang mengekspresikan caspase 3 dapat
diidentifikasi dengan baik pada perokok maupun non-perokok, meskipun
jumlahnya lebih sedikit ditemukan pada perokok, hal tersebut tidak mencapai
statistik yang signifikan (Gambar 4A). Begitu pula dengan penurunan ekspresi
CASP3 dan CASP9 (Gambar 4B-C) juga tidak mencapai statistik yang signifikan
meskipun terdapat korelasi (r = 0.5; P 0.05; Gambar 4D). Secara keseluruhan
menunjukkan bahwa mungki terdapat tren yang tidak signifikan untuk
mengurangi kematian sel epitel tuba fallopii pada perokok.

Proliferasi Sel Epitel Tuba Fallopi Pada Perokok Dibandingkan Dengan

Bukan Perokok
Kami menilai proliferasi sel menggunakan imunolokalisasi Ki-67 (Gambar
3G dan H). Pada epitel tuba terdapat pembelahan sel dari perokok dan bukan
perokok. Meskipun ada lebih banyak sel yang berkembang biak di TUBA
FALLOPI perokok, hal ini tidak mencapai signifikansi statistik (Gambar 5A).
Selain itu peningkatan CCND1 (Gambar 5B) tidak signifikan. Namun secara
keseluruhan, hal ini menunjukkan bahwa mungkin ada kecenderungan
peningkatan proliferasi sel di epitel tuba perokok. Bersama dengan data tentang
kematian sel, ada sugesti yang kuat bahwa merokok dapat mempengaruhi
pergantian sel epitel tuba fallopi. Oleh karena itu kami menilai apakah ini terkait
dengan perubahan struktural tuba fallopii.

Bukti Ketidakteraturan Permukaan Sel Di Epitel Tubal Perokok

Imunolabel pada bagian tuba fallopi dengan fitur epitel yang disorot BAD
kurang terlihat pada bagian kontrol negatif. Beberapa sel epitel, dan area epitel,
memiliki pewarnaan BAD apikal yang lebih jelas di beberapa bagian daripada di
bagian lain (Gambar 3I dan J). Kami menyebut tonjolan seluler epitel ini sebagai
“epitel lepuh” dan penilaian untuk derajat “epitel lepuh” pada skala empat titik
menunjukkan bahwa secara signifikan mereka lebih tinggi di tuba fallopii perokok
dibandingkan dengan tuba fallopi bukan perokok (Gambar 5C). Hal ini
menunjukkan bahwa kemungkinan perubahan dalam pembelahan sel yang terkait
dengan merokok dapat mengubah struktur tuba dan bahkan fungsinya.

Diskusi

Studi array in vitro, menunjukkan bahwa paparan kotinin tampaknya

mempengaruhi ekspresi gen yang terlibat dalam pembelahan sel epitel. Kami
kemudian menunjukkan bahwa biopsi tuba fallopi dari perokok menunjukkan
bukti profil anti-apoptosis (mengurangi BAD, meningkatkan BCL2), tren
peningkatan proliferasi seluler dan penurunan kematian sel, dan perubahan
struktural dalam struktur permukaan sel epitel. Hasil ini menunjukkan bahwa
merokok dapat mengubah pembelahan sel epitel di tuba fallopii, dan perubahan
struktural yang dihasilkan dapat membantu menjelaskan hubungan antara
merokok dan kehamilan ektopik tuba. Merokok juga dikaitkan dengan efek
merugikan lainnya pada reproduksi manusia, selain kehamilan ektopik tuba,
seperti infertilitas dan aborsi spontan, membuat hal ini merupakan temuan penting
dalam konteks kesehatan reproduksi yang lebih luas.
 Hasil ini masuk akal secara biologis. Di luar saluran reproduksi, nikotin
dalam asap rokok terkenal pro-residu, menghambat apoptosis dan mengaktifkan
jalur kelangsungan hidup dalam konteks patologi lain, seperti kanker paru-paru .
Pada mukosa lidah tikus, ekspresi BAD tidak berubah setelah terpapar asap rokok
sedangkan BCL2 diekspresikan berlebih. Selain ekspresi berlebihan BCL2 dalam
menanggapi asap rokok juga telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya dalam
konteks kanker kepala dan leher . Temuan serupa dalam sel mulut dan pernapasan
dan tuba fallopi menunjukkan keterlibatan produk rokok yang bersirkulasi
daripada efek topikal murni. Karena produk ini mungkin berupa kotinin, akan
menarik untuk mempelajari apakah terapi penggantian nikotin dikaitkan dengan
kehamilan ektopik tuba.
Berbeda dengan pengamatan kami di tuba fallopi, Hu et al melaporkan
bahwa ekstrak asap rokok memiliki efek sebaliknya pada sel otot polos saluran
napas manusia yaitu meningkatkan ekspresi BAD dan menurunkan ekspresi
BCL2. Salah satu penjelasan potensial adalah efek topikal dari konstituen lain dari
asap atau perubahan terkait dalam fungsi gen p53 yang secara transkripsi
meningkatkan ekspresi BAD dengan mengikat elemen responsif p53. Selain itu
aktivitas apoptosis dan aktivitas pro-residu dari BAD dan BCL2 masing-masing
sangat ditentukan oleh status fosforilasi dan residu yang diinduksi nikotin dapat
terjadi melalui fosforilasi multisite BAD dan fosforilasi BCL2.
Peningkatan BCL2 yang diamati juga bertanggung jawab atas penurunan
transkripsi BAD. Penghentian BCL2 menginduksi apoptosis p53 pada sel kanker
kolorektal.26 Oleh karena itu, kemungkinan besar kebiasaan merokok meningkat
eksprei BCL2 dan ini secara tidak langsung menyebabkan penurunan ekspresi
BAD melalui penekanan p53. Apapun mekanismenya, dalam berbagai jenis sel
sudah pasti merokok mempengaruhi maturasi sel. Salah satu efek merokok pada
tuba fallopi mungkin adalah perubahan jumlah kematian sel dan proliferasi sel.
Penilaian efek merokok yang dapat menyebabkan disregulasi ekspresi BAD
dan BCL2 pada kematian sel dan proliferasi sel di tuba fallopi. Secara keseluruhan
kami tidak menemukan hasil yang secara jelas signifikan. Namun merokok
dikaitkan dengan penurunan kematian sel yang dinilai oleh pembelahan caspase-3
immunolabelling serta ekspresi CASP9 dan CASP3. Sebaliknya ketika proliferasi
sel dinilai dengan Ki-67 immunolabel dan ekspresi CCDN1. Mungkin saja teknik
yang digunakan tidak cukup sensitif untuk mengetahui efek yang jelas dari
disregulasi BAD dan BCL2. Namun, jika digabungkan tampaknya ada pergantian
sel epitel di tuba fallopi akibat merokok. Hal ini didukung oleh pengamatan kami
tentang perubahan struktural epitel pada perokok dengan immunostaining BAD.
Perokok menunjukkan lebih banyak blebbing pada epitel daripada yang tidak
merokok. Blebbing tidak terlihat pada sel epitel bersilia, yang mungkin
menunjukkan bahwa perokok mengalami penurunan silia dan sel yang bersilia.
Kelangsungan hidup sel gen BCL2 tampaknya diatur secara eksklusif ekspresinya
dalam sel epitel yang tidak bersilia dan dapat dijelaskan dengan penurunan relatif
dari jumlah sel bersilia. Namun, studi kohort retrospektif baru-baru ini
mengatakan efek merokok pada epitel bersilia dan siliogenesis pada tuba fallopi
tidak menunjukkan adanya perubahan yang signifikan dalam jumlah sel bersilia
atau faktor transkripsi yang terlibat di dalam siliogenesis.27
Perubahan relatif pada BAD dan BCL2 dapat menjadikan tempat yang baik
untuk perlekatan embrio di tuba fallopi. Selama implantasi intrauterin, epitel
endometrium dan sel stroma mencegah apoptosis dan proliferasi yang disebut
proses desidualisasi, membentuk tempat yang baik untuk perlekatan dan invasi
embrio.28 Penelitian baru-baru ini telah menyarankan bahwa rahim praimplantasi
bergantung pada sinyal reseptor transmembran dari family notch (khususnya
Notch1) untuk menghambat apoptosis dan mengatur perkembangan siklus sel.28
Oleh karena itu mungkin saja penurunan ekspresi BAD dan peningkatan ekspresi
BCL2 di tuba fallopi sebagai akibat dari merokok mempengaruhi lingkungan
mikro tuba untuk implantasi akibat disregulasi apoptosis dan proliferasi sel
sebagai faktor penting untuk embrio.
Kami telah mendemonstrasikan efek struktural molekuler dari merokok di
tuba fallopi yang dapat mempengaruhi fungsinya. Terlepas dari mekanisme
perubahan ini, pengamatan kami menunjukkan bahwa merokok tampaknya
menjadikan tempat yang baik untuk kelangsungan hidup dan antiapoptosis di tuba
fallopii. Ini merupakan penggabungan efek yang dilaporkan sebelumnya pada
reseptor prokinetisin9 yang menjelaskan hubungan antara merokok dan kehamilan
ektopik. Kami telah menjelaskan bahwa mekanisme ini memungkinkan kebiasaan
merokok dapat mengubah motilitas tuba dan meningkatkan perubahan tuba
menjadi tempat yang mendukung untuk implantasi ektopik.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Sivalingam VN, Duncan WC, Kirk E, Shephard LA, Horne AW (2011).

Diagnosis and management of ectopic pregnancy. J Fam Plann Reprod Health
Care 37: 231–240.
2. Jurkovic D, Wilkinson H (2011) Diagnosis and management of ectopic
pregnancy. BMJ 342: d3397.
3. Shaw JL, Dey SK, Critchley HO, Horne AW (2010) Current knowledge of
the aetiology of human tubal ectopic pregnancy. Hum Reprod Update 16:
432–444.
4. Jansen RP (1984) Endocrine response in the fallopian tube. Endocr Rev 5:
525–551.
5. Lindblom B, Hamberger L, Ljung B (1980) Contractile patterns of isolated
oviductal smooth muscle under different hormonal conditions. Fertil Steril
33:283–287.
6. Farquhar CM (2005) Ectopic pregnancy. Lancet 366: 583–591.
7. Magers T, Talbot P, DiCarlantonio G, Knoll M, Demers D, et al. (1995)
Cigarette smoke inhalation affects the reproductive system of female
hamsters. Reprod Toxicol 9: 513–525.
8. Neri A, Eckerling B (1969) Influence of smoking and adrenaline
(epinephrine) on the uterotubal insufflation test (Rubin test). Fertil Steril 20:
818–828.
9. Shaw JL, Oliver E, Lee KF, Entrican G, Jabbour HN, et al. (2010) Cotinine
exposure increases Fallopian tube PROKR1 expression via nicotinic
AChRalpha-7: a potential mechanism explaining the link between smoking
and tubal ectopic pregnancy. Am J Pathol 177: 2509–2515.
10. Duncan WC, McDonald SE, Dickinson RE, Shaw JL, Lourenco PC, et al.
(2010) Expression of the repulsive SLIT/ROBO pathway in the human
endometrium and Fallopian tube. Mol Hum Reprod 16: 950–959.
11. Lee YL, Lee KF, Xu JS, Wang YL, Tsao SW, et al. (2001) Establishment and
characterization of an immortalized human oviductal cell line. Mol Reprod
Dev 59: 400–409.
12. Eskenazi B, Trupin LS (1995) Passive and active maternal smoking during
pregnancy, as measured by serum continine, and postnatal smoke exposure.
II. Effects on neurodeveloment at age 5 years. Am J Epidemiol 142: S19-S29.
13. Duncan WC, Shaw JL, Burgess S, McDonald SE, Critchley HO, et al. (2011)
Ectopic pregnancy as a model to identify endometrial genes and signaling
pathways important in decidualization and regulated by local trophoblast.
PLoSOne 6: e23595.
14. Dickinson RE, Fegan KS, Ren X, Hillier SG, Duncan WC (2011)
Glucocorticoid regulation of SLIT/ROBO tumour suppressor genes in the
ovarian surface epithelium and ovarian cancer cells. PLoS One 6: e27792.
15. Horne AW, White JO, Lalani el N, Mobberley MA, Margara RA, et al. (2002)
Analysis of epitopes on endometrial epithelium by scanning immunoelectron
microscopy. Biochem Biophys Res Commun 292: 102–108.
16. Stillman RJ, Rosenberg MJ, Sachs BP (1986) Smoking and reproduction.
Fertil Steril 46: 545–566.
17. Heusch WL, Maneckjee R (1998) Signalling pathways involved in nicotine
regulation of apoptosis of human lung cancer cells. Carcinogenesis 19: 551–
556.
18. Assis GF, Ceolin DS, Marques ME, Salvadori DM, Ribeiro DA (2005)
Cigarette smoke affects apoptosis in rat tongue mucosa: role of bcl-2 gene
family. J Mol Histol 36: 483–489.
19. Gallo O, Bianchi S, Porfirio B (1995) Bcl-2 overexpression and smoking
history in head and neck cancer. J Natl Cancer Inst 87: 1024–1025.
20. Hu W, ZXie J, Zhao J, Xu Y, Yang WB, et al. (2009) Involvement of Bcl-2
family in apoptosis and signal pathways induced by cigarette smoke extract in
the human airway smooth muscle cells. DNA Cell Biol 28: 13–22.
21. Campling GB, El-Deiry WS (2003) Clinical implication of p53 mutation in
lung cancer. Mol Biotechnol 24: 141–156.
22. Jiang P, Du W, Heese K, Wu M (2006) The Bad guy cooperates with good
cop p53: Bad is transcriptionally up-regulated by p53 and forms a Bad/p53
complex at the mitochondria to induce apoptosis. Mol Cell Biol 26: 9071–
9082.
23. Chattopadhyay A, Chiang CW, Yang E (2001) BAD/BCL-[X(L)]
heterodimerization leads to bypass of G0/G1 arrest. Oncogene 20: 4507–
4518.
24. Jin Z, Gao F, Flagg T, Deng X (2004) Nicotine induces multi-site
phosphorylation of Bad in association with suppression of apoptosis. J Biol
Chem 279: 23837–23844.
25. Mai H, May WS, Gao F, Jin Z, Deng X (2003) A functional role for nicotine
in Bcl2 phosphorylation and suppression of apoptosis. J Biol Chem 278:
1886– 1891.
26. Jiang M, Milner J (2003) Bcl-2 constitutively suppresses p53-dependent
apoptosis in colorectal cancer cells. Genes Dev 17: 832–837.
27. Pier B, Kazanjian A, Gillette L, Strenge K, Burney RO (2013) Effect of
cigarette smoking on human oviductal ciliation and ciliogenesis. Fertil Steril
99: 199–205.
28. Lala PK, Graham CH (1990) Mechanisms of trophoblast invasiveness and
their control: the role of proteases and protease inhibitors. Cancer Metastasis
Rev 9: 369–379.