Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Teknologi Enzim Industri
Dosen Pengampu: Shinta Maharani, S.TP., M.Sc.
Disusun Oleh:
Kelompok 1
Annisa Jihan Hasheena (1401965)
Armand Dimas Cantona (1401583)
Dessy Chintya Ernande (1405974)
Lani Meita Indah Furi (1401071)
Nadya Nanda Mutiara (1405514)
Nur Walimah Utami (1403422)
ABSTRAK
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam
suatu reaksi kimia organik, salah satu enzim yaitu enzim amilase yang mampu
mengkatalis proses hidrolisa pati untuk menghasilkan molekul lebih sederhana seperti
glukosa, maltosa, & dekstrin. Untuk mendapatkan ekstrak enzim amilase kasar, dapat
dilakukan melalui proses penyaringan kecambah kacang-kacangan. Misal, kandungan
enzim amilase yang tinggi terkandung pada kecambah kacang hijau. Jurnal ini akan
membahas tentang pengaruh perbandingan berat kecambah dan pelarut yang digunakan
dalam ekstraksi enzim amilase dengan menggunakan metode Dinitrosalicylic (DNS),
DNS yakni suatu senyawa yang mampu menyerap radiasi gelombang elektromagnetik
pada 540 nm dengan kuat. Hasil yang didapat dari persamaan y = bx + a, dengan
ditunjukkan x = 0,0299. Itu menunjukkan sebagai gula tereduksi.
Kata Kunci: Enzim Amilase, Ekstraksi, DNS, Buffer, dan Aktivitas Enzim.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------ABSTRACT
Enzymes are biomolecules such as proteins that function as a catalyst in a
chemical reaction of organic, one of the enzymes is amylase that capable of catalyzing
the hydrolysis of starch to produce simpler molecules such as glucose, maltose, &
dextrin. To get rough amylase enzyme extract, it can be done through the sprouts beans
screening process. For example, a high content of amylase enzymes that contained in
mung bean sprouts. This journal will discuss the influence of the sprouts weight ratio
and solvents used in the extraction of enzyme using Dinitrosalicylic (DNS) methods,
DNS is a compound that is capable of absorbing electromagnetic wave radiation at .
540 nm strongly. The results obtained that the equation of y = bx + a, with the indicated
x = 0,0299. It shows the reducing sugar.
Keywords: Enzyme Amylase, Extraction, DNS, Buffer, & Enzyme Activity.
PENDAHULUAN
Pemanfaatan enzim banyak diaplikasikan secara luas terutama dalam proses
pengolahan pangan komersial. Sebagian besar kebutuhan enzim masih dipenuhi dengan
jalan impor. Hal tersebut tidak menguntungkan dari segi devisa dan pengembangan
bioteknologi di Indonesia. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk
menghasilkan enzim sehingga kebutuhan dalam negeri dapat diatasi.
Sumber enzim dapat diperoleh dari tanaman, hewan dan mikroorganisme. Salah
satu enzim pemecah pati adalah enzim -amilase. Amilase merupakan enzim yang
penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase merupakan enzim yang
mengkatalisis reaksi hidrolisis pati menjadi gulagula sederhana. Amilase mengubah
karbohidrat yang merupakan polisakarida menjadi maltosa (alfa dan beta) ataupun
glukosa (gluko amilase). Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman,
binatang dan mikroorganisme. Saat ini sejumlah enzim amilase telah diproduksi secara
komersial. Penggunaan mikroba dianggap lebih prosepektif karena mudah tumbuh,
cepat menghasilkan dan kondisi lingkungan dapat dikendalikan (Nur Hidayat, 2008).
Produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon. Contohcontoh
sumber karbon molase, tepung jagung, tepung tapioka, dan sebagainya. Dalam produksi
enzim amilase dengan menggunakan mikroba, pengendalian terhadap faktor lingkungan
adalah sangat penting karena dalam produksinya, mikroba dipengaruhi berbagai hal,
seperti suhu dan lama inkubasi, pH awal, jumlah inokulum dan faktor yang berpengaruh
lainnya yang dapat diperoleh melalui eksperimen. Jenis mikroba juga berpengaruh
terhadap jumlah enzim yang dihasilkan. Enzim ini sangat berperan dalam industri
pembuatan roti dan sirup. Enzim amilase banyak terdapat pada kecambah kacangkacangan. Enzim -amilase dalam biji dibentuk pada waktu awal perkecambahan oleh
asam giberilik. Asam giberilik adalah suatu senyawa organik yang sangat penting dalam
proses perkecambahan suatu biji karena bersifat sebagai pengontrol perkecambahan
tersebut.
Pemilihan kacang hijau sebagai sumber enzim -amilase karena dalam bentuk
kecambah mengandung tokoferol (pro vitamin E) 936,4 ppm, fenolik 11,3 ppm.
Senyawa tersebut merupakan antioksidan yang sangat penting terhadap kesehatan
terutama balita. Senyawa fenolik dengan antioksidan lainnya pada konsentrasi rendah
dapat melindungi bahan pangan tersebut dari kerusakan oksidatif. Selain itu, kacang
hijau memiliki kelebihan dari segi ekonomis dan agronomis dibandingkan dengan
tanaman kacang-kacangan lainnya.
Keberhasilan isolasi dan pengujian aktivitas enzim sangat tergantung pada
macam serta kondisi sumber enzim, letak enzim, kecermatan kerja, bahan dan cara
ekstraksi yang dipergunakan serta pengertian sifat-sifat enzim tersebut Enzim -amilase
termasuk ekstraselular, sehingga mengekstraknya relatif mudah.
Uji aktivitas -amilase dengan asam dinitro salisilat (DNS) didasarkan pada
prinsip reaksi reduksi oksidasi. DNS (asam 3,5-dinitrosalisilat) merupakan senyawa
aroma yang akan bereaksi dengan gula pereduksi maupun komponen pereduksi lainnya.
Metode DNS digunakan untuk menentukan total gula pereduksi dalam sampel yang
mengandung karbohidrat. Dalam metode DNS digunakan alat spektrofotometer untuk
mengukur nilai absorbansi sampel (Lehninger AL, 1997). DNS berfungsi sebagai
oksidator akan tereduksi membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat. Reaksi ini berjalan
dengan suasana basa yang apabila terdapat gula pereduksi pada sampe maka larutan
DNS yang awalnya berwarna kuning akan bereaksi dengan gula pereduksi.
Metode DNS atau metode TRS (Total Raducing Sugar) bertujuan untuk
menentukan kandungan gula pereduksi yang tersisa dari hasil fermentasi sehingga dapat
diketahui kadar alkohol yang terbentuk. Glukosa merupakan gula pereduksi karena
memiliki gugus aldehida sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil. Pada
metode ini, gugus aldehida pada glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat
menjadi gugus karboksil dan menghasilkan asam 3-amino-5-nitrosalisilat, reaksi ini
berlangsung pada kondisi basa dan suhu tinggi sekitar 90-100C. Senyawa ini memiliki
serapan maksimum pada 510 nm bila diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer.
Reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) merupakan suatu reagen yang digunakan
untuk mendeteksi adanya gula pereduksi dalam sampel disakarida maltosa hasil dari
hidrolisis substrat pati oleh enzim amilase. Penentuan aktivitas enzim amilase
ditentukan dari banyaknya gula pereduksi yang terbentuk hasil hidrolisis pati oleh
enzim
dengan menggunakan analisa gula pereduksi yaitu mereaksikan gula pereduksi dengan
reagen DNS (3,5 dinitroaliclic acid) dimana pada suasana basa, gula pereduksi
akan
mereduksi
DNS
menjadi Asam
3-amino-5-dinitrosalisilat
yang
dapat
banyak
amino-5-dinitrosalisilat
gula
yang
pereduksi
terbentuk.
maka
Adanya
semakin
banyak
senyawa
yang
Asam
3-
terbentuk
tersebut ditandai dengan adanya perubahan warna kuning menjadi merah jingga.
Adanya
perubahan warna
tersebut
menandakan
bahwa
telah
terjadi
reaksi
enzimatis yaitu dengan adanya enzim amilase yang mampu merombak pati
menjadi
gula
pereduksi.
Semakin
banyak gula
pereduksi
yang
terbentuk
fisikanya terlalu kecil, atau tersedia dalam konsentrasi yang terlalu rendah. Dalam hal
semacam itu, seringkali ekstraksi adalah satu-satunya proses yang dapat digunakan atau
yang mungkin paling ekonomis.
Teknik ekstraksi sangat berguna untuk pemisahan secara cepat dan bersih, baik
untuk zat organik atau anorganik, untuk analisis makro maupun mikro. Selain untuk
kepentingan analisis kimia, ekstraksi juga banyak digunakan untuk pekerjaan preparatif
dalam bidang kimia organik, biokimia, dan anorganik di laboratorium. Tujuan ekstraksi
ialah memisahkan suatu komponen dari campurannya dengan menggunakan pelarut.
METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu
Praktikum ekstraksi enzim amilase dari kecambah kacang hijau ini
dilaksanakan pada Kamis, 14 April 2016 bertempat di Laboratorium Prodi
Pendidikan Teknologi Agroindustri Lantai 4 Gedung Baru FPTK UPI.
C. Metode Percobaan
Pembuatan Kurva Standar Maltosa
1.
1.1.
2.
2.1.
3. Pembuatan NaOH 2M
3.1.
Cara Pembuatan
Melarutkan 8 gram NaOH dalam 100ml aquades
4.1.
Cara Pengukuran
Pertama, memasukkan 1 ml larutan maltosa pada setiap
konsentrasi dan 1 ml reagen DNS dalam tabung reaksi (pengujian
dilakukan
duplo
untuk
setiap
konsentrasi).
Lalu,
melakukan
Cara Pembuatan
Mencampurkan 14,8 ml asam asetat 0,2 M (11,55 ml asam asetat
dilarutkan dalam 1000 ml aquades) dengan 35,2 ml Na-asetat 0,2 M (16,4 gr
Na asetat dilarutkan dalam 1000 ml aquadest).
3.1.
Cara Pengujian
Pertama, melakukan penimbangan 2,5 gram kecambah kacang hijau
lalu menghancurkannya menggunakan mortar. Lalu, menambahkan sedikit
demi sedikit pelarut untuk ekstraksi sampai volume yang sesuai dengan
perbandingan yang dipakai pada kecambah kacang hijau yang telah
dihancurkan. Buffer yang dipakai dalam keadaan dingin. Kemudian,
melakukan penyaringan enzim dengan kain saring dan dengan pengulangan
penyaringan menggunakan kertas saring. Setelah itu, mensentrifugasi
ekstrak enzim menggunakan sentrifuse 4000 rpm selama 15 menit. Lalu,
menyimpan ekstrak enzim amilase dalam almari pendingin sebelum dipakai.
4.1.
Cara Pengujian
Pertama, memasukkan 200 l substrat amilum 1%, 500 l larutan
buffer pH 5 (50 mM) dan 200 l aquades dalam tabung reaksi. Kemudian,
melakukan pre-inkubasi selama 10 menit pada suhu 60oC di dalam
waterbath. Setelah melakukan pre-inkubasi, kemudian menambahkan
larutan DNS sebanyak 1 ml dan 100 l ekstrak enzim kasar. Lalu,
melakukan penghomogenan larutan menggunakan vortex selama 5 detik.
Setelah homogen, larutan mengalami pemasan pada air mendidih selama 5
menit dan pendinginan menggunakan air es selama 5 menit. Lalu larutan
kembali dihomogenkan menggunakan vortex. Setelah homogen, lalu
melakukan peneraan absorbansi larutan pada panjang gelombang 540 nm
dan mencatat hasilnya.
Cara Pengujian
Pertama, memasukkan 200 l substrat amilum 1%, 500 l larutan
buffer pH 5 (50 mM) dan 200 l aquades dalam tabung reaksi. Kemudian,
melakukan pre-inkubasi selama 10 menit pada suhu 60oC di dalam
waterbath. Setelah melakukan pre-inkubasi, kemudian menambahkan 100
l ekstrak enzim kasar. Lalu, menginkubasi kembali selama 10 menit
pada suhu 60oC. Setelah inkubasi kedua, lalu menambahkan larutan DNS
sebanyak 1 ml. Lalu, melakukan penghomogenan larutan menggunakan
vortex selama 5 detik. Setelah homogen, larutan mengalami pemasan pada
air mendidih selama 5 menit dan pendinginan menggunakan air es selama 5
menit. Lalu larutan kembali dihomogenkan menggunakan vortex. Setelah
homogen, lalu melakukan peneraan absorbansi larutan pada panjang
gelombang 540 nm dan mencatat hasilnya.
Absorbansi
0
0,0615
0,2200
0,3865
0,5570
0,7375
0,9200
Variasi Perbandingan
(duplo)
Blanko
1:8
Absorbansi
Menit ke-0
0,028
-0,018
1:6
-0,013
-0,031
1 : 10
-0,034
-0,011
1 : 12
-0,038
-0,046
*data yang digunakan yaitu : 0,052 dan 0,056
Menit ke-10
0, 373
0,009
-0,041
-0,053
-0,036
0,052*
0,056*
-0,038
-0,045
Amilase adalah golongan glikosida hidrolase, enzim pengurai pati ini dapat
dipilah ke dalam dua kelompok yang secara khas menghidrolisis ikatan (1) 1,6 antar
rantai-rantai dan (2) memutus ikatan 1,4 antar satuan glukosa pada rantai lurus. Pati
mentah, tidak rusak (tidak tergelatinisasi) dan tidak rentan terhadap aktivitas -amilase.
Sebaliknya, -amilase dapat menyerang granul pati utuh secara perlahan-lahan.
Prinsip penggunaan gradien pH dalam proses ekstraksi umumnya menggunakan
larutan buffer, yakni campuran ampholyte (polyamino acid dengan perbedaan sifat
muatan). Pada percobaan ekstraksi amilase dari kecambah kacang hijau digunakan
larutan buffer asetat pH 5 dengan suhu dingin (terkontrol) guna mencegah kemungkinan
aktifitas enzim sebelum pengamatan. Selanjutnya, metode DNS memungkinkan
pengukuran aktifitas enzim berdasar pada warna komplementer yang terabsorbsi
(terserap di dalam larutan) pada panjang gelombang 540 nm. Besarnya nilai absorbansi
secara teoritis berbanding lurus dengan penggunaan variasi waktu kontak enzim
(aktivitas enzim amilase dengan pengukuran jumlah gula reduksi yang dihasilkan).
Selanjutnya, perhitungan konsentrasi amilase yang terkandung dalam bahan
direpresentasikan oleh absorbansi dan disubstitusikan pada persamaan Kurva Standar
Maltosa. Persamaan Konsentrasi Standar Maltosa yang diperoleh adalah y = 3,9732x 0,0649 (dengan nilai Regresi 0,9885).
( A sa )
b
mol
xV larutan ( ml )
mmol
( A sa ) ( 0,054(0,0649) )
=
=0,0299 mg / ml
b
3,9732
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Anam, Khairul. 2010. Produksi Enzim Amilase pdf. IPB.
Anggrahani, Sri. 2009. Pengaruh Lama Pengecambahan Terhadap Kandungan ATo koferol dan
Senyawa
Proksimat
Kecambah
Kacang
Hijau. Jurnal
Nur.
2008.
Amilase.
[online]
the
LAMPIRAN
1. LAMPIRAN PERHITUNGAN
Kadar Gula Reduksi Awal/menit ke-0 (mg/ml)
Gk=
( Aka)
b
Gk=
00,064
3,973
Gk=0
Gs=
( Asa)
b
0,054 = 3.973x - 0.064
0,054 + 0,064 = 3,973x
0,118 = 3,973x
X = 0,0299
Jadi, kadar gula reduksi akhir
Gh=GsGk
Gh=0,02990=0,0299
Konsent
rasi
0
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0.24
RataRata
Absorb
ansi
0
0.0615
0.22
0.3865
0.557
0.738
0.92
mg
mol
x 10 x 1000
x 1 ml
ml
mmol
mg
10 menit x 0,1 ml x 342
ml
0,0299
299
= 0,8743
342
2. KURVA STANDAR MALTOSA
1
0.8
0.6
0.4
Linear ()
0.2
0
0
0.2
0.4
3. LAMPIRAN GAMBAR
LEMBAR KONTRIBUSI
Nama Anggota
Kontribusi
Lampiran-Lampiran