A.

Topik: Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri dan Pewarnaan Secara

Gram
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk :
1. mengamati morfologi koloni bakteri
2. memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram
3. untuk menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa
C. Dasar Teori

Mikroorganisme membutuhkan suatu medium atau substrat untuk

pertumbuhannya (Hastuti, 2012). Medium tersebut ialah bahan yang digunakan
untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Meskipun
persyaratan nutrien mikroorganisme amat beragam, namun sebagai makhluk
hidup mereka mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi karbon,
energi, mineral dan faktor tumbuh. Bagi organisme bersel tunggal, air sangat
dibutuhkan karena air merupakan komponen utama protoplasma (70-85%
protoplasma terdiri dari air) serta sebagai media untuk masuknya nutrien ke
dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun ekresi dari dalam sel. Disamping itu, air
juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi enzimatik didalam sel.
Sumber Nitrogen dapat diperoleh dari senyawa organik juga dapat berasal dari
unsur logam seperti natrium, kalium, kalsium, magnesium, mangan, besi, seng,
tembaga, fosfor, dan kobalt. Bakteri membutuhkannya dalam jumlah yang sedikit
(Hadioetomo, 1990).

Faktor tumbuh ialah komponen seluler esensial yang tidak dapat disintesis
sendiri oleh suatu organisme dari sumber dasar karbon dan nitrogennya.
Komponen sel yang dimaksud dapat berupa asam amino atau vitamin. Bagi
banyak heterotrof, kebutuhan akan faktor tumbuh sudah dapat dipenuhi oleh
ekstrak daging atau kaldu nutrien. Namun pada beberapa patogen (fastidious)
diperlukan medium yang lebih rumit seperti agar darah untuk penyediaan fakror
tumbuh yang diperlukan. Keasaman (pH) medium juga dibutuhkan bagi
pertumbuhan organisme terutama kerja enzim. Sebagian besar bakteri tumbuh
paling baik pada sekitar pH 7 (Hadioetomo, 1990).

Berdasarkan komposisi kimiawinya dikenal medium sintetik dan medium

nonsintetik atau kompleks. Komposisi kimiawi medium sintetik diketahui dengan
pasti dan terbuat dari bahan-bahan kimia yang kemurniannya tinggi atau
ditentukan dengan tepat. Sedangkan untuk komposisi medium non sintetik tidak
diketahui dengan tepat, contohnya ialah bahan-bahan yang terdapat dalam kaldu
nutrien, yaitu ekstrak daging dan pepton, mempunyai komposisi kimiawi yang
tidak pasti.

Kaldu nutrrien merupakan medium yang sangat umum digunakan dalam

bakteriologi (dapat menunjang pertumbuhan ) maka medium ini disebut juga
medium serbaguna. Sedangkan medium yang mengandung zat-zat kimia tertentu
yang dapat menghambat pertumbuhan satu kelompok bakteri atau lebih tanpa
mengahambat pertumbuhann organisme yang diinginkan disebut medium selektif.
Selain itu juga terdapat medium diferensial yaitu medium yang mengandung zat-
zat kimia tertentu yang memungkinkan pengamat untuk dapat membedakan
berbagai tipe bakteri (Hadioetomo, 1990).

Berdasarkan tekstur fisiknya, medium dibedakan menjadi medium cair,

medium setengah padat dan medium padat. Medium cair yang sering digunakan
adalah kaldu nutrien atau kaldu glukosa yang dapat dipergunakan untuk berbagai
keperluan seperti pembiakan organisme dalam jumlah besar, penelaahan
fermentasi, dan berbagai macam uji. Sedangkan untuk medium setengah padat
dan medium padat dapat dibuat dengan menambahkan bahan pemadat (agar-agar)
pada medium kaldu sesuai dengan konsentasi yang dibutuhkan (Hadioetomo,
1990).

Sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses untuk mematikan

organisme yang terdapat pada atau dalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang
umum digunakan dalam sterilisasi yaitu, penggunaan panas, penggunaan bahan
kimia, dan penyaringan filtasi. Pemilihan metode disesuaikan dengan bahan yang
akan disterilkan. Sterilisasi basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau
sterilisator uap yang mudah diangkat (portabele) dengan menggunakan uap air
jenuh bertekanan suhu 121 C selam 15 menit.

Panas lembab sangat efektif meskipun suhu yang digunakan tidak terlalu
tinggi, karena uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan,
dilepaskan panas sebnyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 121 C. Panas
ini mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan
mematikannya.

Bakteri memiliki bentuk dan struktur yang berbeda. Bentuk dan struktur
ini yang disebut dengan morfologi bakteri. Setiap bakteri memiliki bentuk yang
berbeda. Ini juga dipengaruhi oleh kondisi tempat hidupnya. Bakteri dapat hidup
di setiap tempat misalnya ; udara, diantara rambut, di sela-sela gigi , didalam
tanah dan sebagainya (Hastuti, 2012).

Pada umumnya ada tiga bentuk bakteri yang berbeda yaitu, bentuk kokus
atau bulat, basil atau silinder (batang), dan spiral atau melengkung melingkar
(Volk & Wheeler, 1988).

1 Kokus bentuknya seperti buah beri kecil.bakteri ini terdapat dalam

beberapa pola atau pengelompokan yang berbeda dan oleh karen itu dapat
dijadikan ciri setiap marga yang berbeda. Beberapa kokus secara khas
hidup sendiri-sendiri, sedangkan yang lainnya dapat dijumpai berpasangn,
kubus atau rantai panjang, bergantung caranya membelah diri dan
berlekatan satu sama yang lain.
Kokus yang senantiasa membelah dalam satu bidang namun tidak
memisahkan diri, sering membentuk rantai kokus, ini merupakan
bentuk khas Strepcoccus.
Kokus yang membelah dalam tiga bidang tegak lurus satu sama
lain membentuk paket kubus, cara ini dijumpai pada merga
Sarcina.
Kokus yang membelah dalam dua bidang untuk membentuk
gugusan yang tidak teratur diklasifikasikan dalam marga
Staphylococcus atau marga Micrococcus.
2 Basil adalah bakteri yang bentuknya menyerupai batang atau silinder.
Basil memiliki ukuran yang beraneka ragam, beberapa diantaranya
menyerupai rokok sigaret. Bentuk lainnya adalah basil berebantuk
gelendong dengan ujung-ujung yang meruncing lebih menyerupai cerutu.
Beberapa basil panjang dan lebarnya sama dan bentuknya lonjong, basil-
bail ini menyerupai kokus sehingga disebut koko-basil.
 3 Bentuk Spiral
a Vibrio adalah batang yang melengkung menyerupai koma. Kadang-
kadang vibrio tumbuh sebagai benang-benang membelit atau
membentuk S.
b Spiril adalah spiral atau lilitan yang sebenarnya, seperti kotrek
(pembuka gabus). Tubuh selnya kokoh.
c Spirochaeta berbentuk spiral tetapi bedanya dengan spiril dalam hal
kemampuannya melenturkan dan melekuk-lekukkan tubuhnya sambil
bergerak.

Gambar. 1 a. Bentuk Kokus, b. Bentuk Basil, dan c. Bentuk Spiral

Untuk mengidentifikasi suatu bakteri dapat diamati dari bentuk koloni, warna
koloni, tepi koloni, elevasi koloni, serta tipe pertumbuhannya pada medium
miring.

1 Bentuk Koloni
Bentuk koloni yang umunya ditemukan yaitu bundar, bundar dengan
tepian kerang, bundar dengan tepian timbul, keriput, konsentris, tak
beraturan dan menyebar, berbenang-benang, bentuk l, bundar dengan
tepian menyebar, filiform, rizoid, atau kompleks.
2 Bentuk Tepi Koloni
Bentuk tepian koloni bakteri umunya yaitu licin, berombak, berlekuk,
takberaturan, siliat, bercabang, seperti wol, seperti benang, atau seperti
ikal rambut.
3 Elevasi Koloni
Selain dapat diamati dan diidentifikasi dari bentuk, warna, dan tepian
koloninya, pengamatan koloni juga dapat di lakukan pada elevasi
koloninya. Beberapa elevasi dari koloni bakteri yaitu, datar, timbul,
 cembung, seperti tetesan, seperti tombol, berbukit-bukit, tumbuh kedalam
medium, atau seperti kawah.
4 Tipe Pertumbuhan pada Medium Agar Miring
Tipe pertumbuhan koloni bakteri pada medium agar miring juga dapat
digunakan untuk mengidentifikasi jenis bakteri. Menurut Fardiaz dalam
Hatuti (2012) ada beberapa tipe koloni bakteri pada medium agar miring
yaitu bentuk serupa pedang, bentuk berduri, bentuk serupa tasbih, bentuk
titik-titik, bentuk berupa batang, dan bentuk serupa akar.

Medium agar padat miring merupakan medium nutrien cair yang ditambah
agar sebagai pemadatnya dan dibirakan mengeras pada posisi miring. Pada
medium agar padat miring, bakteri Eschercia coli, bentuknya spreadling dengan
elevasi low convex, tidak berbau, berwarna krem dan pertumbuhannya sedikit saja
namun membentuk koloni. Pada Bacillus subtilis pertumbuhannya tipis dan
merata tanpa koloni dengan elevasi low convex berbentuk echinulate, tidak berbau
dan berwarna krem (Anitamuina, 2013).

Bakteri dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif. Pembagian kelompok ini didasarkan teknik pewarnaan diderensial yang
disebut pewarnaan gram. Kedua kelompok ini berbeda terutama dalam dinding
selnya(Volk & Wheeler, 1988).

1. Bakteri Gram Positif

Dinding sel organisme gram positif cukup tebal (20-80 nm) dan terdiri atas
60-100 % peptidoglikan. Semua sel gram positif memiliki pi]olimer lurus asam
N-asetilmuramat dan N-asetilglukosamin, namun ada varian dalam panjang
dann komposisi jembatan peptida yang mengaitkan silang tetrapeptida dari satu
asam N-asetilmuramat dengan polimer yang ada disampingnya. Beberapa
organisme gram positif juga mengandung substansi dinding sel yang disebut
asam teikoat yang dikaitkan pada asam muramat dari lapisan peptidoglikan.
Asam teikoat berwujud dalam dalam dua bentuk utama, yaitu asam teikoat
ribito, dan asam teikoat gliserol. Disamping asam teikoat yang terikat pada
peptidoglikan (yang tidak terdapat pada semua bakteri gram positif), semua
bakteri gram positif mengandung asam teikoat yang terikat pada membran sel.
2. Bakteri Gram Negatif
 Dinding sel bakteri gram negatif mempunyai susunan kimia yang lebih
rumit dari pada bakteri gram positif. Sebagai contoh, dinding sel gram negatif
mengandung lebih sedikit peptidoglikan (10-20% bobot kering dinding sel),
tetapi diluar lapisan peptidoglikan, ada struktur membran kedua yang
tersusun dari protein fosfolipida dan lipopolisakarida (asam lemak yang
dirangkai dengan polisakarida. Komponen lipopolisakarida dinding sel bakteri
ini sangat penting karena toksisitasnya pada hewan. Bakteri yang temasuk
gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella sp, Shigella sp, E. Coli, dan
lain-lain.

Baik pada bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif, dinding sel
tidak meyerap cukup zat warna dasar yang umum. Pewarnaan sel bakteri secara
gram merupakan salah satu proseedur yang penting dan paling banyak digunakan
dalam klasifikasi bakteri (Hastuti, 2012). Adapun hasil perubahan warna bakteri
oleh pewarnaan gram yaitu ,

1. Bakteri gram positif, akan berwarna ungu pada akhir pewarnaan.

2. Bakteri gram negatif, akan berwarna merah pada akhir pewarnaan.

D. Alat dan Bahan

Alat:

1. Inkubator
2. Loupe
3. Colony Counter
4. Mikroskop
5. Kaca benda
6. Mangkuk pewarna
7. Kawat penyangga
8. Pipet
9. Pinset
10. Lampu spiritus
11. Botol penyemprot

Bahan

1. 2 medium lempeng NA
2. Aquades steril
3. Biakan murni bakteri umur 1 24 jam
4. Larutan amonium Oksalat Kristal Violet
5. Kertas penghisap
6. Korek api
7. Alkohol 95%
8. Lisol
9. Sabun cuci
10. Larutan Safranin
11. Larutan Iodium

E. Cara Kerja
1 Pengamatan Morfologi Bakteri
 Membawa 3 cawan petri berisi medium lempeng ke tempat sampah, lalu membuka
tutup cawan petri di tiga posisi, yaitu atas (sejajar dengan kepala), tengah (sejajar
dada) dan bawah (diatas tanah) selama 5 menit, kemudian menutup kembali

Menginkubasi ketiga biakan pada medium lempeng tersebut pada suhu 37C

Setelah biakan berumur 2x24 jam, dilakukan pengamatan terhadap koloni bakteri
yang tumbuh pada medium lempeng tersebut

Menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh. koloni bakteri ditandai dengan
bentuk seperti lendir, tetesan mentega, tetesan sari buah

Memilih dua macam koloni bakteri yang tumbuh

Melakukan pengamatan morfologi koloni dari dua macam koloni bakteri yang
meliputi warna koloni, bentuk koloni, tepi koloni, elevasi, kepekatan koloni,
mengkilat atau suram, dan diameter

Melakukan pengamatan seperti yang disebut di atas pada masing-masing koloni

bakteri

2 Pembuatan Biakan Murni

 Menyediakan 3 medium miring

Memilih dua macam koloni bakteri yang berrasal dari koloni campuran (sama dengan
koloni yang diamati pada pengamatan morfologi koloni bakteri)

Menuliskan nomor koloni yang dipilih pada medium lempeng dan medium miring
yang telah tersedia

secara aseptik menginokulasikan bakteri itu pada medium miring denan arah zig-zag
menggunakan jarum inokulasi dari bagian bawah menuju ke atas (tiap medium hanya
diinokulasikan dengan 1 macam koloni bakteri. jangan sampai jarum inokulasi menusuk
medium

menginkubasi biakan tersebut pada suhu 37C

melakukan pengamatan setelah biakan berumur 2x24 jam

mencatat bentuk koloni bakteri yang tumbuh pada mediium miring

3 Pewarnaan Gram
Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu dilewatkan di atas nyala api lampu spiritus

Meneteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut

Secara aseptik mengambil inokulum bakteri yang akan diperiksaa, lalu diletakkan di
atas tetesan aquades steril tersebut. Kemudian diratakan perlahan-lahan dan ditunggu
hingga mnegering

Melakukan fiksasi dengan cara melewatkan medium tersebut di atas nyala api lampu
spiritus dengan cepat.

Meletakkan sediaan di atas kawat penyeangga yang berada di atas mangkuk pewarna.
Lalu meneteskan larutan Amonium Oksalat Kristal Violet di atas sediaan tersebut.
DItunggu selama 1 menit

Membuang kelebihan zat warna tersebut ke dalam mangkuk dan membilas sediaan
dengan air kran

Meneteskan larutan iodium di atas sediaan, lalu menunggu selama 2 menit

Membuang kelebihan larutan iodium ke dalam mangkuk, lalu dibilas dengan air kran

Meneteskan alkohol 95% di atas sediaan, lalu membiarkan selama 1 menit.

Membuang sisa alkohol ke dalam mangkuk dan membilas sediaan dengan air kran

Meneteskan larutan safranin di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 30 detik

Membuang kelebihan larutan safranin ke dalam mangkuk, lalu dibilas dengan air kran

Mengeringkan dengan hati-hati menggunakan kertas penghisap lalu diamati di bawah

mikroskop
 Jika teknik pewarnaan berhasil, maka sel-sel bakteri yang bersifat gram positif
akan berwarna ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang bersifat gram negative
akan berwarna merah muda atau merah.

G. Analisis Data

Praktikum ini bertujuan untuk mengamati morfologi bakteri yang ada di

sekitar kampus. Pengambilan bakteri dilakukan di tempat sampah samping Garaha
Cakrawala. Disediakan 3 cawan petri yang telah berisi medium. Bakteri diambil
pada 3 posisi, yaitu bagian atas (sejajar kepala), tengah (sejajar dada), dan bawah
(tepat di atas tanah) yang dilakukan selama 5 menit. Cara pengambilannya adalah
dengan meletakkan cawan petri pada masing-masing posisi dalam waktu yang
bersamaan. Setelah 5 menit, cawan petri ditutup kembali dan dibawa ke
laboratorium untuk diinkubasi selama 2 x 24 jam.
 Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan mengambil 2 koloni yang
berbeda pada masing-masing cawan petri. Pengamatan pertama dilakukan
pengamatan morfologi bakteri secara langsung dan pewarnaan gram. Pengamatan
kedua dilakukan pengamatan koloni dan pertumbuhan bakteri dalam medium
miring.

Pengamatan pertama, bakteri dari masing-masing cawan petri diamati

bentuk morfologinya yang meliputi warna koloni, bentuk koloni, tepi koloni,
elevasi koloni, diameter koloni, kepekatan koloni, dan jumlah koloni. Pada cawan
petri atas, tengah dan bawah, koloni 1 berwarna putih tulang, bentuk koloni
bundar dengan tepian kerang, tepi koloni berombak, elevasi koloni dilihat dari sisi
samping seperti tombol. Diameter koloni pada cawan petri atas berukuran 0.4 cm,
pada cawan petri tengah berukuran 0.8 cm, sedangkan pada cawan petri bawah
berukuran 0.3 cm. Pada ketiga cawan petri, koloni bakteri bersifat pekat yaitu saat
bakteri diambil dengan jarum oase menunjukkan adanya serat seperti benang.
Jumlah koloni bakteri pada cawan atas sebanyak 16 koloni, pada cawan petri
tengah sebanyak 4, dan pada cawan petri bawah sebanyak 7 koloni.

Koloni 2 pada cawan petri atas, tengah dan bawah, putih transparan,
bentuk koloni bundar dengan tepian timbul, tepi koloni licin, elevasi koloni dilihat
dari sisi samping adalah datar. Diameter koloni pada cawan petri atas berukuran
0.4 cm, pada cawan petri tengah berukuran 0.3 cm, sedangkan pada cawan petri
bawah berukuran 0.1 cm. Pada ketiga cawan petri, koloni bakteri bersifat tidak
pekat yaitu saat bakteri diambil dengan jarum oase tidak menunjukkan adanya
serat seperti benang. Jumlah koloni bakteri pada cawan atas sebanyak 6 koloni,
pada cawan petri tengah sebanyak 10, dan pada cawan petri bawah sebanyak 35
koloni.

Selanjutnya pada 2 koloni tersebut dilakukan pewarnaan gram. Masing-

masing koloni diambil dan diletakkan di atas kaca benda. Sebelumnya, kaca benda
disterilisasi dengan lakohol 95% dan dipanaskan sebentar di atas spirtus. Reagen
yang digunakan untuk pewarnaan secara berurutan yaitu Amonium oksalat Kristal
violet, Iodium, Alkohol 95%, safranin. Masing-masing reagen diteteskan pada
kaca benda yang telah berisi bakteri dalam selang waktu yang berbeda.
Selanjutnya diamati di atas mikroskop perubaha warnanya. Pada koloni 1 dan 2,
setelah pewarnaan warna berubah menjadi merah. Perubahan warna merah
tersebut menunjukkan bahwa koloni bakteri 1 dan koloni bakteri 2 merupakan
bakteri gram negative.

Pengamatan kedua yaitu pengamatan bakteri pada medium miring. 3

koloni bakteri pada salah satu cawan petri diinokulasi terlebih dahulu pada
medium miring dan didiamkan selama 2 x 24 jam. 2 koloni merupakan koloni
yang sama pada pengamatan pertama, sedangkan 1 koloni merupakan koloni lain.
Cara inokulasi (penanaman bakteri) adalah dengan mengambil bakteri dari cawan
petri dengan jarum oase dan memindahkannya pada medium miring. Penanaman
bakteri pada bidang miring dilakukan dengan pola zig-zag. Inokulasi dilakukan di
dalam LAF (Laminar Air Flow). Semua peralatan untuk inokulasi harus dalam
keadaan steril yaitu dipanaskan terlebih dahulu.

Setelah 2 hari, bakteri pada medium miring diamati. Tipe pertumbuhan

koloni 1 pada medium miring adalah enchinulate, pertumbuhan koloni 2 pada
medium miring belum bisa ditemukan, sedangkan pertumbuhan koloni 3 bertipe
spreading.

H. Pembahasan

Bakteri dapat diperoleh hampir disetiap tempat, misalnya: di udara, di

antara helaian rambut, disela-sela gigi, di dalam tanah dan sebagainya. Untuk
mempelajari morfologi kolobi bakteri, kita perl menangkap dan munumbuhkan
pada medium lempeng terlebih dahulu. Pada umumnya koloni bakteri yang
tertangkap pada medium lempeng ini akan tumbuh setelah lebih kurang 1x24 jam.
Bakteri yang akan kita pelajar lebih lanjut sebaikanya juga buat biakan murni
(Hastuti, 2012).

Bakteri yang ditumbuhkan dalam medium agar akan membentuk suatu

penampakan berupa koloni. Koloni bakteri ini merupakan sekelompok masa sel
yang dapat dilihat dengan mata langsung. Satu koloni bakteri yang berada di
dalam cawan petri/dalam medium agar adalah sama dan dianggap semua sel yang
berada dalam satu koloni tersebut adalah keturunan (progeny) satu
mikroorganisme dan karena itu mewakili sebagai biakan murni (Kusnadi, dkk,
2003). Menurut Kusnadi, dkk (2003) penampakan koloni bakteri dalam media
lempeng agar menunjukkan bentuk dan ukuran koloni yang khas, dapat dilihat
dari bentuk keseluruhan penampakan koloni, tepi dan permukaan koloni.

Dalam melakukan pengamatan morfologi koloni harus dengan baik

mengamati sifat-sifat suatu koloni. Yang disebut dengan sifat-sifat suatu koloni
ialah sifat-sifat yang ada sangkutpautnya dengan bentuk, susunan, permukaan,
pengkilatan, dan sebagainya. Pengamatan sifat-sifat ini dapat dilakukan dengan
pandangan biasa tanpa menggunakan mikroskop. Supaya sifat-sifaat tersebut
tampak jelas, bakteri perlu ditumbuhkan pada medium padat (Dwidjoseputro,
2005). Sebagaimana dalam praktikum yang telah dilakukan, praktikan pada
awalnya menangkap bakteri di lingkungan tepatnya di tempat sampah belakang
Gedung Graha Cakrawala Universitas Negeri Malang, pada ketinggian (posisi)
tempat yang berbeda, dalam tempat yang sama. Setelah itu disimpan dalam
inkubator selama 2x24 jam diamati sifat-sifat suatu koloni yang sama, yang
berhasil ditemukan pada ketiga ketinggian (posisi) tempat yang bebeda.

Pada cawan petri atas, tengah dan bawah, koloni 1 berwarna putih tulang,
bentuk koloni bundar dengan tepian kerang, tepi koloni berombak, elevasi koloni
dilihat dari sisi samping seperti tombol. Dwidjoseputro (2005) menjelaskan
bahwa, besar ke kecilnya koloni dapat hanya serupa suatu titik, adapula yang
sampai menutup permukaan medium dari hasil pengamatan morfologi koloni satu
maka di dapatkan diameter koloni pada cawan petri atas berukuran 0.4 cm, pada
cawan petri tengah berukuran 0.8 cm, sedangkan pada cawan petri bawah
berukuran 0.3 cm. Sehingga, jika dibandingkan diantara ketiganya koloni 1 dapat
tumbuh dengan baik pada cawan petri yang di letakan pada posisi tengah (setinggi
dada) praktikan. Dakurni (2014) menjelaskan, beberapa faktor yang berpengaruh
terhadap pertumbuhan mikroba yang didalamnya termasuk bakteri ialah: (1)
Konsentrasi nutrient, makin banyak bahan nutrisi yang diperlukan makin cepat
pertumbuhan mikroba; (2) pH (keasaman dan kebasaan), beberapa mikroba
mempunyai sifat pH yang berbeda-beda untuk menunjang pertumbuhannya; (3)
konsentrasi air, untuk pertumbuhan mikroba memerlukan konsentrasi yang cukup
dan sangat spesifik; (4) bahan alami, bahan alami tertentu bersifat antimikrobia,
yaitu sifat menghambat pertumbuhan mikrobia, misalnya golongan rempah-
rempah; (5) suhu, mikrobia mempunyai sifat spesifi terhadap suhu untuk
pertumbuhannya; dan (6) tekanan osmosis, mempengaruhi kestabilan dari dinding
dan membrane sel mikroba.

Dwidjoseputro (2005) menjelaskan, dalam hal bentuk ada koloni bulat,

ada yang memanjang, ada yang tepiannya rata, dan ada tepiannya yang tidak rata,
dalam hal kenaikan permukaan, ada koloni yang rata saja dengan permukaan
medium, ada pula yang timbul, yaitu menjulang tebal di permukaan medium,
dalam hal halus kasarnya permukaan ada koloni yang permukaanya halus, ada
yang permukaannya kasar (tidak rata), dalam hal wajah permukaan ada koloni
yang permukaannya mengkilat, ada yang permukaannya suram, dalam hal warna
kebanyakan koloni bakteri itu berwarna keputihan atau kekuning-kuningan, dan
dalam hal kepekatan ada koloni yang lunak seperti lender, ada yang lunak seperti
mentega, ada yang keras dan kering. Setelah dilakukan pengamatan morfologi
bakteri koloni 1 didapatkan koloni berwarna putih tulang, bentuk koloni bundar
dengan tepian kerang, tepi koloni berombak, elevasi koloni dilihat dari sisi
samping seperti tombol.

Berdasarkan hasil analisis data, pada koloni bakteri yang kedua

menunjukkan ciri-ciri morfologi sebagai berikut, warna koloni putih transparan,
bentuk koloni bundar dengan tepian timbul, tepi koloni licin, elevasi koloni datar,
diameter koloni rata-rata 0,26 cm, dan bersifat tidak pekat karena tidak
menunjukkan adanya serat seperti benang saat koloni bakteri diambil dnegan
jarum oase. Jumlah koloni 2 pada ketiga cawan petri adalah 51 koloni.
Penghitungan jumlah koloni ini menggunkan colony counter. Jumlah koloni 2
bakteri ini sangat banyak jika dibandingkan dengan koloni 1. Hal ini
menunjukkan bahwa pertumbuhan koloni 2 adalah cepat. Menurut Irianto (2006)
proses pertumbuhan yang optimal jika berdasarkan syarat yaitu dengan
tersedianya makanan dan energi yang cukup serta keadaan lingkungan (pH, suhu).
Selain itu juga pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti
substrat pertumbuhan yaitu menggunakan medium agar pada prektikum ini, pH,
temperatur, dan bahan kimia (Dwidjoseputro, 1990).

Praktikum selanjutnya adalah pewarnaan gram. Dalam mengidentifikasi

suatu bakteri tidak hanya dengan mengamati morfologi bakteri, tetapi juga bisa
dengan pemeriksaan mikroskopis seperti pewarnaan gram. Gram digunakan
untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk membedakan bakteri gram
positif dan gram negatif. Jika suatu bakteri diwarnai dengan teknik pewarnaan
gram menunjukkan hasil pewarnaan merah maka bakteri tersebut adalah bakteri
gram negatif, sedangkan jika diperoleh bakteri berwarna ungu maka bakteri
tersebut adalah gram positif (Kusnadi, 2003).

Pelczar, (2008) menjelaskan, pewarnaan gram didasarkan pada struktur

dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram negatif mengandung lipid, lemak,
atau substansi seperti lemak dalam presentase lebih tinggi daripada yang
dikandung bakteri gram prositif. Bukti-bukti percobaan menyarankan bahwa
selama prosedur pewarnaan, perlakuan dengan etanol (alkohol) terhadap bakteri
gram negatif menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya
rembes atau permeabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu Kristal-
yodium (UK-Y), yang telah memasuki dinding sel selama waktu langkah awal
dalam proses pewarnaan, dapat dapat diekstraksi. Karena itu organisme bakteri
gram negative kehilangan warna tersebut. Karena kadungan lipidnya yang lebih
rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan
etanol.

Perlakuan dengan melewatkan diatas api dengan perlahan-lahan supaya

bakteri itu benar-benar melekat pada kaca benda, dan dengan demikian tidak akan
terhapus apabila sediaan dicuci. Pencucian dengan alcohol berguna mengilangkan
zat warna yang berlebihan. Suatu sediaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat
warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alcohol,
kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna
merah. Jika sediaan itu dicuci dengan air, maka jika zat warna tambahan (merah)
bertahan hingga zat warna asli (ungu) tidak tampak, dalam hal ini sediaan bakteri
dinamakan dengan bakteri gram negative Dwidjoseputro (2005). Komposisi
dinding sel gram negative: lebih kompleks (terdapat membrane luar yang
melindungi peptidoglikan), struktur membran luar mirip membran sel dalam,
membran luar terdiri dari fosfolipid (lapisan dalam) dan lipopolisakarida (bagian
luar), membran sel terdiri atas dua lapis fosfolipid, da nada lipopolisakarida, porin
(kanal).

Hastuti (2012) menyatakan bahwa pewarnaan sel bakteri secara gram

merupakan salah satu prosedur yang penting dan paling banyak digunakan dalam
klasifikasi bakteri. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri
tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini disebut pewarnaan
diferensial. Namun, dalam praktikum yang telah dilaksanakan tidak dilakukan
identifikasi untuk menyusun klasifikasi koloni yang di amati, hanya melakukan
pengamatan morfologi, pewarnaan gram, dan pengamatan bakteri pada medium
miring.

Berdasarkan hasil analisis data menunjukkan bahwa pewarnaan koloni

bakteri 1 dan bakteri 2 adalah berwarna merah. Berarti koloni bakteri1 dan koloni
bakteri 2 termasuk dalam bakteri gram negatif. Warna merah tersebut disebabkan
kompleks zat warna kristal violet-yodium yang sebelumnya diberikan larut ketika
pemberian larutan alkohol 90% sehingga saat diberi safranin akan memberi
warna merah pada membran sel bakteri (Lay (1994) dalam Fitri dan Yasmin,
2011).

Praktikum yang selanjutnya dilakukan adalah pengamatan kedua yaitu

pengamatan bakteri pada medium miring. Setelah dilakukan sterilisai pada tabung
reaksi yang telah berisi medium miring dan disimpan di dalam kulkas selama,
dilakuakn inokulasi (penanaman bakteri), adalah dengan mengambil bakteri dari
cawan petri dengan jarum oase dan memindahkannya pada medium miring.
Andaikata medium dan alat-alat yang kita pergunakan dalam inokulasi itu tidak
steril, niscayalah kita tidak akan mungkin memperoleh piaraan bakteri yang kita
inginkan, maka langkah-langkah pertama yang harus kita ambil sebelum kita
melakukan inokulasi ialah mengusahakan sterilnya medium serta alat-alat
perlengkapannya. Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom,
sebelum digunakan lebih dahulu ujung kawat dipijarkan, sedangkan sisanya
sampai tangkai cukup dilewatkan pada nyala api saja. Setelah dingin kembali,
ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemeriaaraan itu
dipanasi juga setelah sumbatannya diambil. Setelah pengambilan inoculum (yaitu
sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti
semula (Dwidjoseputro, 2005).

Penanaman bakteri pada bidang miring dilakukan dengan pola zig-zag

dengan bantuan jarum oase yang dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow).
Setelah 2 hari, bakteri pada medium miring diamati. Dwidjoseputro (2005)
menjelaskan, sifat-sifat koloni pada agar-agar miting berkisar pada bentuk dan
tepi koloni. Tipe pertumbuhan koloni 1 pada medium miring adalah enchinulate.

Berdasarkan hasil analisis data tipe pertumbuhan koloni 2 bakteri pada

medium miring belum bisa ditentukan/ditemukan. Dari data pengamatan juga
terlihat bentuk koloni 2 setelah 2 hari diinkubasi menunjukkan bentuk yang tidak
beraturan dan terlihat seperti titik-titik koloni bakteri. Hal ini disebabkan saat
inokulasi bakteri terjadi kesalahan, yaitu saat menanam bakteri dengan pola zig-
zag tangan praktikan gemetar sehingga menyebabkan pertumbuhan koloni 2 tidak
bisa teramati.

Pengamatan tentang karakteristik morfologi koloni bakteri perlu

dilakukan, agar mempermudah dalam proses identifikasi jenis bakteri. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Lay (1994) dalam Fitri dan Yasmin (2011), bahwa
berdasarkan ciri morfologi koloni bakteri dan biakan murni maka dapat dilakukan
proses identifikasi jenis-jenis mikroorganisme, namun untuk memperoleh hasil
identifikasi yang sempurna maka harus dilanjutkan dengan uji biokimia.

I. Diskusi
Bahan Diskusi Pembuatan Medium Padat
1 Sarat-sarat apakah yang harus dipenuhi dalam pembuatan medium untuk
menumbuhkan mikroba? Jelaskan!
Jawab:
Sarat yang harus dipenuhi dalam pembuatan medium antara lain
sebagai berikut:
Mengandung semua zat yang mudah digunakan oleh mikroba.
Tidak mengandung zat penghambat pertumbuhan.
 Mempunyai tekanan osmose dan tekanan muka.
Mempunyai derajat keasaman (pH) yang sesuai
Dalam keadaam seteril.
Sarat tersebut harus dipenuhi agar mikroba dapat tumbuh pada medium yang
akan digunakan. Dengan adanya nutrisi yang dibutuhkan dan dengan keadaan
medium yang sesuai dengan lingkungan asilnya, mikroba diharapkan dapat
tumbuh dengan baik.

2 Mengapa medium yang telah disterilisasi harus diinkubasikan dahulu sebelum

digunakan? Jelaskan!
Medium yang sudah disterilisasi harus diinkubasikan dahulu
sebelum digunakan adalah untuk menjaga dan menyesuaikan suhu yang ada
pada medium agar sama dengan suhu lingkungan ketika bakteri dapat
tumbuh. Proses inkubasi ini dilakukan selama 72 jam. Selain itu, inkubasi
juga dilakukan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang tidak
digunakan.

Bahan Diskusi Biakan Murni Bakteri

1 Faktor-faktor apakah yang mempengaruhi jumlah dan jumlah macam bakteri
pada suatu tempat?
Jawab:
Faktor yang mempengaruhi jumlah dan jumlah macam bakteri pada
suatu tempat antara lain sebagai berikut.
Faktor nutrisi
Karbon
Karbon merupakan kebutuhan dasar yang dibutuhkan oleh
bakteri. Karbon tersebut dapat berasal sari karbon dioksida atau
senyawa organik. Karbon dimanfaatkan sebagai penghasil
metabolit organik esensial dan sebagai sumber pertumbuhan.
Bakteri yang berbeda memanaatkan karbon untuk kebutuhan yang
berbeda pula.
Faktor pertumbuhan
Sejumlah bakteri heterorofik tidak dapat tumbuh dari
suplai satu atau lebih faktor pertumbuhan. Hal ini menandakan
bahwa fsktor pertumbuhan merupakan salah satu faktor yang
mempengaruhi keberadaan dan jumlah bakteri di suatu tempat.
 Ion anorganik
Sejumlah kecil ion anorganik dibutuhkan oleh bakteri
dalam jumlah yang kecil. Ion organik tersebut tersusun atas
Nitrogen, Sulfur, Fosfor, Kalium, Magnesium, dan Kalisium
Oksigen
Kebutuhan oksigen pada bakteri mencerminkan
mekanisme yang digunakan untuk memenuhi kebutuhan
energinya.
Karbon dioksida
Karbon dioksida secara normal dihasilkan oleh
katabolisme senyawa organik, oleh karena itu dinamakan sebagai
faktor pembatas.
Faktor fisik
Temperatur
Setiap bakteri memiliki temperatur optimal yang dapat
membuat pertumbuhan bakteri semakin cepat. Bakteri memiliki
rentang temperatur yang menyababkan mereka dapat tumbuh.
Temperature optimal biasanya mencerminkan lingkungan normal
mikroorganisme.
Konsentrasi ion hydrogen (pH)
Bakteri membutuhkan pH yang berbeda untuk setiap
jenisnya. Perbedaan ini disebabkan oleh proses metabolisme yang
terjadi di dalam sel.
Kondisi omotik
Konsentrasi larutan yang aktif secara osmotic di dalam sel
bakteri umumnya lebih tinggi dari konsentrasi di luar sel.
Sebagiam besar bakreri yang mengalami kerusakan dinding
selnya akan mengalami kerusakan dinding sel, tidak toleran
terhadap pertumbuhan osmotic dan akan mengembangkan sistem
transport kompleks dan alat pengatur sensor-osmotik dan
memelihara keadaan osmotic konsentrat dalam sel.
Potensial reduksi-oksidasi
Mikroba memiliki derajat sensitifitas tertentu terhadap
potensial reduksi-oksidasi dari medium pertumbuhannya.
Potensial oksidasi-reduksi dari suatu substrat merupakan nilai
 kemudahan substrat tersebut dalam mengeluarkan dan
mendapatkan elektron.

2 Apakah kegunaan biakan murni bakteri?

Biakan murni bakteri digunakan untuk mempermudah pengamatan
dan supaya kita mendapatkan satu spesies saja dalam satu piaraan. Biakan
murni biasanya ditumbuhkan pada medium agar, hal ini diharapkan mikroba
tersebut dapat tumbuh agak berjauhan dari sesamanya dan setiap selnya
berhimpun membentuk koloni.

Diskusi Pewarnaan secara Gram

1 Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri gram
positif dan gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi dalam proses
pewarnaan gram!
Jawab:
Perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan pada bakteri gram positif dan
negative terletak pada struktur dan komposisi dinding selnya. Bakteri Gram
Positif mampu mempertahankan zat warna utama dalam pewarnaan Gram
(Kristal Violet) sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan
dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian besar
Peptidoglikan yang mampu mengikat zat warna dan tidak rusak saat dicuci
dengan alcohol. Sementara itu, bakteri Gram Negatif memiliki komposisi
dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga pada saat
pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat warna utama terutama saat
dicuci dengan alkohol (lipid rusak saat dicuci dengan alkohol), akibatnya
kelompok bakteri ini memberikan kenampakan warna merah (warna dari zat
warna ke dua yaitu safranin) di akhir kegiatan pewarnaan Gram.
J. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum dan pembahasan yang telah dilakukan, dapat diambil

kesimpulan sebagai berikut:

1. Koloni 1 berwarna putih tulang, bentuk koloni bundar dengan tepian

kerang, tepi koloni berombak, elevasi koloni dilihat dari sisi samping
seperti tombol. Rerata diameter koloninya adalah 05 cm. Koloni bakteri 1
bersifat pekat.
2. Koloni bakteri yang kedua berwarna koloni putih transparan, berbentuk
koloni bundar dengan tepian timbul, memiliki tepi koloni licin, elevasi
koloni datar, diameter koloni rata-rata 0,26 cm, dan bersifat tidak pekat.
3. Koloni bakteri 1 dan 2 berwarna merah setelah diwarnai dengan
pewarnaan Gram. Hal ini menunjukkan bahwa koloni 1 dan 2 termasuk
bakteri Gram negative.

Daftar Rujukan

Anitamunia. 2013. Morfologi Koloni Bakteri (online),

anitamuina.wordpress.com/2013/02/13/morfologi-koloni-bakteri/
Dwidjoseputro. 1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan.
Fitri, Lenni dan Yasmin, Yekki. 2011. Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni
Bakteri Kitinolitik. Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi,
3(2): 20-25.
Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :
Gramedia
Hastuti, Utami Sri. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang: UMMPress.
Irianto, K. 2006. Mikrobiologi: Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid 2.
Bandung: CV. Yrama Widya.
Kusnadi, dkk. 2003. Common TextBook Mikrobiologi. Bandung: JICA-IMSTEP,
DGHE, dan FPMIPA UPI
Lay, W. B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja
Grafindo Persada.
Pelczar, Michael J. & E.C.S. Chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1.
Jakarta: UI Press.
Volk, Wesley A & Wheeler, Margaret F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta:
Erlangga