Isolasi dan Inokulasi 1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme dapat ditemukan disemua tempat yakni di tanah,

udara, air, makanan, limbah, bahkan permukaan tubuh. Singkatnya, setiap

area dari lingkungan kita penuh dengan mikroba. Ilmu mikrobiologi

memisahkan populasi yang beraneka ragam tersebut menjadi spesies

individu yang dapat dipelajari.

Mikroorganisme tertentu dapat menyebabkan kerusakan pada

makanan dan beberapa di antaranya (yang disebut pathogen) juga dapat

menyebabkan keracunan makanan. Mikroorganisme yang lain

menguntungkan dan dapat digunakan untuk mengubah karakteristik

makanan sebagai bagian dari pemrosesan makanan (misalnya fermentasi

sebagai salah satu tahap dalam pembuatan sosis, yoghurt, dan keju) dan

untuk memperpanjang masa simpan produk-produk tertentu.

Pemanfaatan mikroorganisme dalam bidang teknologi semakin banyak

digunakan misalnya dalam menghasilkan berbagai produk seperti bahan

pangan, industri, pertanian, obat-obatan, dan lain sebagainya. Untuk itu

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 2

perlunya isolasi maupun inokulasi untuk mendapatkan mikroorganisme

tersebut.

B. Tujuan

Tujuan dari percobaan ini adalah untuk dapat memisahkan mikroba

dari campurannya sehingga didapat kultur murni.

C. Manfaat

Manfaat dari percobaan ini adalah mahasiswa dapat memisahkan

mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikrobiologi merupakan cabang dari ilmu biologi yang mempelajari

mikroorganisme. Praktikum Mikrobiologi diberikan dengan tujuan untuk

mendukung secara langsung materi kajian dalam perkuliahan dan

memberi bekal pengalaman serta keterampilan dasar bagi mahasiswa

tentang teknik- teknik dasar yang banyak digunakan di bidang

Mikrobiologi (Dharma, 2015).

Medium yang digunakan pada penelitian yaitu medium Nutrient Agar

(Merck), medium Nutrient Broth (Merck), dan medium Endo Agar

(Merck). Bahan medium ditimbang dan dilarutkan dalam akuades menurut

komposisi dari masingmasing medium, lalu dipanaskan di atas hotplate.

Selanjutnya semua medium disterilkan di dalam autoklaf dengan tekanan 2

atm pada suhu 120o C selama 15- 20 menit (Nur dkk, 2015).

Media yang umum digunakan untuk menganalisis mikroba pada produk

makanan termasuk yang diacu dalam metode SNI 2332.7.2009 (BSN,

2009) adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Masalah yang dihadapi dalam

penggunaan PDA sebagai media untuk menghitung jumlah kapang adalah

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 4

adanya pertumbuhan yang melebar hingga memenuhi cawan petri dan

menghambat pertumbuhan kapang lain. Akibatnya, selain menyulitkan

penghitungan koloni, jumlah yang terhitung juga tidak akurat karena

adanya koloni yang terhambat pertumbuhannya (Indriati dkk., 2010).

Secara alami, mikroba di alam ditemukan dalam populasi campuran.

Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan isolasi yang diawali

dengan pengenceran bertingkat. Proses isolasi mikroba adalah memisahkan

mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai

mikroba untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat

mikroba lainnya (Puspitasari dkk., 2012).

Tujuan pengenceran adalah supaya diperoleh isolat yang tidak begitu

padat dan mewakili semua jenis bakteri yang terdapat pada sampel.

Sampel diinokulasi dengan metode agar tuang, diambil sebanyak 1 ml untuk

diinokulasi pada media NA dalam cawan petri + 15 ml secara aseptik

kemudian diinkubasi pada suhu 370C di dalam inkubator selama 2 x 24

jam. Isolat bakteri menujukan ciri morfologi yang berbeda-beda seperti

warna dan bentuk koloni (Pastra dkk., 2012).

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 5

Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan

untuk mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini

adalah membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi

tidak memerlukan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan

dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan.

Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni

tunggal (Akhdiya, 2013).

Staphylococcus aureus (S. aureus) merupakan bakteri gram positif

yang tergolong sebagai bakteri pathogen. Hal tersebut karena S. aureus

mampu menghasilkan enterotoksin ketika bakteri ini tumbuh pada makanan

yang mengandung karbohidrat dan protein. Keracunan makanan oleh S.

aureus dapat terjadi jika menelan makanan yang tercemar enterotoksin

(Retnowati dkk., 2011).

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 6

B. Uraian Bahan

1. Agar (Ditjen POM, 1979 : 74)

Nama resmi : AGAR

Nama lain : Agar-agar

Pemerian : Tidak berbau atau bau lemah, berasa musilago pada

lidah.

Kelarutan : Tidak larut dalam air dingin, dan larut dalam

air mendidih.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

Kegunaan : Sebagai bahan pemadat medium.

2. Akuades (Ditjen POM, 1979 : 96)

Nama resmi : AQUA DESTILLATA

Nama lain : Air suling

RM / BM : H2O / 18,02 g/mol

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau,

tidak berasa.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 7

Kegunaan : Sebagai sumber nutrien mikroba dan pelarut medium.

3. Alkohol ( Ditjen POM, 1979: 65)

Nama resmi : AETHANOLUM

Nama lain : Etanol, Alkohol

RM/BM : C2H6O / 46,07 g/mol

Pemerian : Cairan mudah menguap, jernih, tidak berwarna,

baukh as d an m e nye babkan r as a terbakar pad a

lidah.Mudahmenguap meskipun pada suhu rendah

danmendidih padasuhu 78ºC dan mudah terbakar.

Kelarutan : Bercampur dengan air dan praktis bercampur dengan

semua pelarut organik.

Penyimpanan : Wadah tertutup rapat jauh dari api.

Kegunaan : Anti mikroba, desinfektan, pelarut, penetrasi kulit.

4. Toge ( Phaseolus radiatus L)

Klasifikasi (Tjitrosoepomo, 2007)

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 8

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Genus : Phaseolus

Spesies : Phaseolus radiatus L

Kegunaan :Untuk ekstraknya, sebagai sumber nutrient mikroba.

C. Uraian Bakteri

1. Pseudomonas aeruginosa

a. Taksonomi

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 9

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa

b. Karakteristik (Suyono dan Farid, 2011)

Bakteri Pseudomonas sendiri memiliki karakteristik seperti,

gram negatif, berbentuk batang (rods) atau kokus (coccus), aerob

obligat, motil mempunyai flagel polar. Bakteri ini, oksidase positif,

katalase positif, nonfermenter dan tumbuh dengan baik pada suhu

4oC atau dibawah 43oC. Pseudomonas banyak ditemukan pada tanah,

tanaman dan air.

3. Staphylococcus aureus

a. Taksonomi

Kingdom : Monera

Divisio : Firmicutes

Class : Bacilli

Order : Bacillales

Family : Staphylococcaceae

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 10

Genus : Staphilococcus

Species : Staphilococcus aureus

b. Karakteristik (Dewi, 2013)

Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif dan

berbentuk kokus. S. aureus bersifat non-motil, nonspora, anaerob

fakultatif, katalase positif dan oksidase negatif. S. aureus tumbuh

pada suhu 6,5-46º C dan pada pH 4,2-9,3. S. aureus membentuk

pigmen lipochrom yang menyebabkan koloni tampak berwarna

kuning.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 11

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah :

a. Bunsen

b. Cawan petri

c. electromantel

d. Erlenmeyer

e. Gelas kimia

f. Gelas ukur

g. Inkubator

h. Laminar air flow

i. Rak tabung

j. Spoit 1 Ml dan 5 mL

k. Tabung reaksi

l. Timbangan Analitik

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 12

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah:

a. Alkohol 70%

b. Aluminium foil

c. Aquadest

d. Medium NA

e. Medium TEA

f. Plastic wrap

g. Sampel bakteri (P. Aeruginosa dan S. Aureus)

h. Sampel air got

i. Sampel air laut

j. Sampel air sumur

k. Sampel lumpur

l. Sampel tanah

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 13

C. Prosedur Kerja

1. Isolasi mikroorganisme

a. Mengencerkan sampel yang akan diisolasi, pengenceran 10-3 untuk

sampel cair dan 10-6 untuk sampel padat .

b. Dari pengenceran yang dikehendaki sebanyak 1 ml larutan tersebut

dipipet ke dalam cawan petri steril.

c. Menuangkan agar nutrisi yang telah dicairkan ke dalam cawan petri

tersebut, memutar cawan petri di atas meja dengan gerakan

seperti angka delapan untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara

merata.

d. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut diinkubasi dengan

posisi terbalik.

e. Mengamati koloni mikroba yang terbentuk.

2. Teknik Pemindahan Biakan

a. Memegang tabung yang berisi biakan mikroorganisme dengan tangan

kiri, dan jarum inokulasi dengan tangan kanan.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 14

b. Membuka tabung biakan dengan melepaskan sumbat kapas

menggunakan tangan kanan, memijarkanmemanaskan mulut tabung

diatas nyala api sebanyak 2 kali

c. Memijarkan jarum inokulasi sampai pijar, didinginkan ke dalam

larutan alkohol 70 % kemudian dipijarkan kembali.

d. Mengambil biakan, memindahkan sedikit dari permukaan medium

tabung dan langsung menyentuhkan ke permukaan medium tabung.

e. Memijarkan kembali dan menutup tabung biakan, memanaskan mulut

tabung sama seperti pada waktu membukanya. Menutup kembali

dengan sumbat kapas. Memijarkan jarum inokulasi sampai pijar dan

meletakkan di tempatnya.

3. Pengamatan mikroorganisme dan berbagai macam media

a. Medium Agar Miring

a. Media PDA, dituang ke dalam tabung reaksi dan

memiringkannya dan membiarkanya memadat.

b. Memegang tabung medium pembiakan dengan tangan kiri.

c. Mengambil koloni yang ada dengan jarum inokulasi pada lempeng

pembiakan.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 15

d. Menggores biakan pada permukaan medium miring, dimulai dari

dasar tabung dibuat garis lurus sampai keatas.

e. Menginkubasi pada suhu 250C selama 3 x 24 jam.

f. Melakukan pengamatan koloni secara morfologi.

b. Medium Agar Tegak

1. Memasukan medium kedalam tabung reaksi sebanyak 10 ml.

2. Mengambil satu ose isolat dari medium biakan kemudian tusukan

kedalam permukaan medium agar didalam tabung reaksi.

3. Menginkubasi pada suhu 250C selama 2 x 24 jam.

4. Melakukan pengamatan koloni secara morfologi.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 16

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

1. Isolasi Mikroba

Medium / Metode
No. Sampel Gambar dan Keterangan

1 . A i r l a u t Nutrient Agar (NA) / Tuang

Media Koloni bakteri

2 . Air sumur Nutrient Agar (NA) / Tuang

Media Koloni bakteri

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 17

3. L u m p u r Tauge Extract Agar (TEA) / Tuang

Koloni bakteri Media

4 . T a n a h Tauge Extract Agar (TEA) / Sebar

Koloni bakteri Media

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 18

2. Inokulasi mikroba

No. G a m b a r Sampel / Metode Jenis koloni

1 .
Staphylococcus aureus / metode tegak A e r o b

2 .
Pseudomonas aeruginosa/ metode tegak Filiform

Pseudomonas aeruginosa / metode tegak

3.
B e a d e d

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 19

B. Pembahasan

Isolasi merupakan cara memisahkan mikroorganisme tertentu dari

lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni dan

biakan tersebut disebut kultur murni, sedangkan Inokulasi Penanaman

bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan

bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat

ketelitian yang sangat tinggi. Beberapa tehnik isolasi yang dapat

digunakan yaitu metode gores, metode sebar, dan metode tuang.

Sedangkan tehnik inokulasi yaitu medium agar miring, medium agar tegak,

dan medium cair.

Sampel yang digunakan pada percobaan ini yaitu tanah, air laut, air

got, kulit kepala, dan air sumur. Pertama, sampel diencerkan terlebih

dahulu dengan metode pengenceran bertingkat. Tujuan dari pengenceran

ini yaitu untuk memperkecil atau mengurangi kuantitas jumlah bakteri

agar dapat dihitung jumlahnya. Sampel yang berbentuk padat diencerkan

hingga enam kali pengenceran sedangkan sampel cair hanya tiga kali

pengenceran.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 20

Metode isolasi yang digunakan pada percobaan ini yaitu metode tuang

dan metode sebar. Metode tuang dilakukan dengan cara memasukan

suspensi bakteri yang telah diencerkan terlebih dahulu sebanyak 1 mL lalu

cawab petri digerakkan seperti angka delapan. Tujuan dilakukan cara

seperti ini yaitu untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata

kemudian dimasukan medium pertumbuhannya dan ditunggu hingga

memadat lalu dimasukan ke dalam inkubator selama 1 x 24 jam, sedangkan

metode sebar dilakukan dengan cara memasukan medium terlebih dahulu

hingga memadat kemudian di masukan suspensi bakteri sebanyak 0,1 mL

diatasnya kemudian disebar dan dimasukan kedalam inkubator selama 1 x

24 jam.

Metode inokulasi yang dilakukan pada percobaan ini yaitu dengani

medium agar miring dan medium agar tegak. Media tegak menggunakan ose

lurus dengan cara menusukkan ose yang telah disentuhkan dengan biakan

bakteri Pseudomonas Aureus ke dalam medium NA hingga ½ dari tinggi

medium. Kemudian diinkubasikan selama 1x 24 jam dalam inkubator pada

suhu 25oC, sedangkan metode agar miring inokulasi menggunakan medium

NA yang telah dipadatkan dalam tabung reaksi dengan posisi miring. Pada

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 21

metode ini digunakan ose bulat dengan cara menggoreskan ose yang telah

disentuhkan dengan biakan bakteri Pseudomonas Aureussecara zig-zag

pada permukaan medium NA. Kemudian diinkubasikan selama 1 x 24 jam

dalam inkubator pada suhu 25oC.

Bakteri membutuhkan waktu untuk pembelahan selama 1 - 2 hari

Inkubasi dilakukan dengan membalik cawan Petri. Hal ini dimaksudkan agar

uap air yang terjadi selama proses inkubasi, tidak jatuh ke dalam medium

yang dapat mengganggu petumbuhan mikroba.Mikroorganisme dapat

ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan menunjukkan

terjadinya pertumbuhan mikroorganisme, bila mikroorganisme menumpuk

pada dasar tabung dan pada cawan petri berbentuk bulat-bulat yang

terpisah yang membentuk koloni.

Manfaat percobaan ini dalam bidang farmasi adalah dengan

mengetahui cara isolasi dan inokulasi mikroba, seorang farmasis akan lebih

mudah untuk mengisolasi mikroba yang memiliki manfaat dalam bidang

farmasi misalnya pada pembuatan antibiotik yang memanfaatkan

mikroorganisme yang telah diisolasi dari alam atau sampel.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 22

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan

bahwa untuk memisahkan mikroba dari campurannya dan memperoleh

kultur yang murni dapat menggunakan metode isolasi dan inokulasi. Isolasi

merupakan cara memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan,

sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni dan biakan tersebut

disebut kultur murni, sedangkan Inokulasi Penanaman bakteri atau biasa

disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium

yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat

tinggi. Beberapa tehnik isolasi yang dapat digunakan yaitu metode gores,

metode sebar, dan metode tuang. Sedangkan tehnik inokulasi yaitu

medium agar miring, medium agar tegak, dan medium cair.

B. Saran

Sebaiknya dalam melaksanakan praktiku, praktikan harus lebih hati-

hati menggunakan alat-alat laboratorium.

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041
Isolasi dan Inokulasi 23

DAFTAR PUSTAKA

Akhdiya, Alina, 2013. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin

Termostabil. Buletin Plasma Nutfah, Vol.9 No.2.

Dharma, W, 2015, Penggunaan Virtual Lab Untuk Meningkatkan

Keterampilan Mahasiswa Pendidikan Biologi Dalam
Menggunakan Alat-Alat Mikrobiologi, Jurnal Kependidikan,
Vol. 27 (2).

Ditjen POM., 1979. Farmakope Indonesia Edisi II. Jakarta : Departemen

Kesehatan RI.

Indriati, N., Nandang, P., dan Radestya, T., 2010, Penggunaan Dichloran
Rose Bengal Chloramphenicol Agar (Drbc) Sebagai Media Tumbuh
Kapang Pada Produk Perikanan, Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi
Kelautan dan Perikanan, Vol. 5 (2).

Nur, M., M.G. Isworo R dan Komariyah., 2013. Metode Baru Untuk
Dekontaminasi Bakteri Dengan Plasma Non Termik Pada tekanan
Atmosfer. Berkala Baru. Vol. 8 (3).

Pastra, D., Meki, dan Heron, S., 2012, Penapisan Bakteri yang Bersimbiosis
dengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteri dari
Perairan Pulau Tegal Lampung, Maspari Journal, Vol. 4 (1).

Puspitasari, F. D., Maya, S., dan Nengah, 2012, Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik, Jurnal Sains Dan Seni
Its, Vol. 1 (1).

Retnowati, Y., Nurhayati, B., dan Nona, W. P., 2011, Pertumbuhan Bakteri
Staphylococcus Aureus Pada Media Yang Diekspos Dengan Infus
Daun Sambiloto (Andrographis paniculata), Jurnal saintek, Vol. 6
(2).

Nur Yerni La Ode Muhammad Hidayat Haofu

O1A116041