LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

INDUSTRI DASAR
LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

PEWARNAAN BAKTERI

OLEH
DELLA KUSUMA WARDIANA
NRP. 1141620009

PRODI
TEKNIK KIMIA

SERPONG, TANGERANG
2018
 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

 Group Praktikum : 1
 Tanggal Praktikum : 10 Februari 2018
 Asisten Praktikum : Bpk. Suyono
 Anggota Praktikum : Ade Chandra NRP. 1141620001
Ayu Agustin NRP. 1141620005
Daud Wibisono NRP. 1141620009
Dhianova Putri NRP. 1141620011
Difa Al Fattah NRP. 1141620013

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia

 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

PEWARNAAN BAKTERI

I. TUJUAN
 Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram.
 Mengelompokkan bakteri gram positif atau bakteri gram negative
pada sampel.

II. DASAR TEORI

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.
Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit
akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna
biru.
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek.
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan
secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh
di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga
telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan
lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi
pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas
atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi
seperangkat set kromosom. Berikut adalah gambar Pewarnaan gram pada
basillus subtilis:

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia

 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk

gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam
jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan
manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru
dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare
dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator
pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Berikut adalah gambar
Pewarnaan gram pada E.coli:

III. ALAT DAN BAHAN

 Alat
1. Mikroskop
2. Objek Glass
3. Jarum Inokulasi
4. Busen
5. Penjepit
6. Pipet Tetes

 Bahan
1. Biakan bakteri murni (E. Coli dan Basilus Subtilis)
2. Aquadest
3. Gram A (Methyln Blue)
4. Gram B (Lugol)
5. Gram C (Alkohol)
6. Gram D (Safranin)
7. Air
8. Kertas Hisap

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia

 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

IV. CARA KERJA

Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70%
↓
Ditambahkan 1 tetes aquadest
↓
Kemudian, diambil biakan murni menggunakan ose dan diratakan seulas
1 cm2
↓
Dikeringkan (fiksasi diatas nyala api) dan di angin-anginkan
↓
Celup dalam gram A selama 60 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Celup dalam gram B selama 60 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Celup dalam gram C selama 30 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Celup dalam gram D selama 30 detik
↓
Di cuci pada air yang mengalir dan dikeringkan dengan kertas hisap
↓
Diamati warna yang terbentuk pada biakan dibawah Mikroskop

V. HASIL PENGAMATAN
No. Jenis Bakteri Bentuk Bakteri Warna Gambar
Escherichia coli Basil/Batang, Gram
1.
morfologi negatif -
bentuk basil Biru
yang
memanjang
kurus dan
kecil-kecil.

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia

 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

Basilus Subtilis Gram

2. Basil/Batang,
positif -
morfologi
Merah
bentuk yang
memanjang
dan besar.

VI. PEMBAHASAN
Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan
di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi
mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan
sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram) dapat
digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil
yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel
terhadap tinta safranin atau methyln blue.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun
mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik
aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja,
bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu.
Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan
agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan
ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan
biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes
aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan
diratakan diatas kaca obyek kira-kira 1 cm2. Pengambilan kultur bakteri tidak
diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan
apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan
tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu
menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas
nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada
kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan
pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang
mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A
(methylene blue) dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air
mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan
menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian
dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen
blue.

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia

 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan lugol. Gram B

merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat
warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat,
memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna.
Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan
terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan,
zat warna methylene blue akan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu
dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat
pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik
(lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk
melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru
dari komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung
lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru
karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi untuk
melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan
menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut
persenyawaan methylene blue. Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan
waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan
aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) dan
diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan
perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan
kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram
negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah
menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah
luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab
itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat
warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering
dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau
kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non
target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat
primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu
dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan
warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak
dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol
(etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk
ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram
negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi
dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna biru.

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia

 Laporan Mikrobiologi Industri Dasar – Pewarnaan Gram

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran
zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel.
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan
asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat
yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri
tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri
jenis Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong
dalam bakteri gram positif berwarna merah. Sedangkan Escherichia coli
merupakan bakteru berbentuk batang (basil) dan tergolong dalam bakteru
gram negatif berwarna biru. Keduanya di amati pada mikroskop dengan
pembesaran 40x.

VII. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan
sebagai berikut :
1. Pada Pewarnaan gram digunakan 4 bahan warna, yaitu : Gram A
(Methyln Blue), Gram B (Lugol), Gram C (Alkohol) dan Gram D
(Safranin).
2. Bakteri Bacillus sp. tergolong dalam bakteri gram positif (berwarna
merah) dan Escherichia coli tergolong dalam bakteri gram negatif
(berwarna biru).

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Rizki,silvi.2015.Praktikum Mikrobiologi. http://dietistasilvi.blogspot.co.id
Diakses pada 15 Februari 2018
Gozali, Amir, 2009, PewarnaanGram, http://www.gozali.blogspot.com./
Diakses pada tanggal 14 April 2012.
Dwidjoseputro.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia

Praktikan,

(Della Kusuma Wardiana)

Della Kusuma Wardiana/1141620009/Teknik Kimia/Institut Teknologi Indonesia