BAB III

METODE PENELITIAN

A. Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Farmasi Institut Sains
&Teknologi Al Kamal dan Determinasi akan dilakukan di LIPI Bogor.
B. Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan selama 3 bulan,dari mulai bulan juli sampai
September 2018.
C. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian experimental
D. Alat dan Bahan
1. Alat Penelitian
Pada penelitian ini menggunakan alat : timbangan analitik,blender,
,penggaris, ,aluminium foil,kertas saring, Erlenmeyer,wadah plastik,beaker
gelas,gelas ukur,corong,tabung reaksi,lampu 40 watt ,kotak
sterofoam,spatula,batang pengaduk,pipet tetes,kaca arloji,botol kaca,rotary
evaporator,Lup,Labu ukur.
2. Bahan Penelitian
Penelitian ini menggunakan bahan dan reagen:Air laut, akuades, serbuk
kering daun Alpukat (Perseae Americana), kertas saring, pelarut Etanol 70
%,telur udang Artemia salina Leach ,NaOH 10%,DMSO 2%, H2SO4 2
N ,pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorf,HCl pekat ,serbuk magnesium
(serbuk mg).
E. Prosedur Penelitian
1. Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposive random tanpa
membandingkan dengan daerah lain. Sampel yang digunakan dalam
penelitian ini daun karet kebo (ficus elastica).
2. Uji Determinasi
Uji determinasi tanaman Daun karet kebo (ficus elastica) akan
dilakukan di Herbarium Bogoriense” Bidang Botani Pusat Penelitian
Biologi-LIPI di Bogor.
3. Pembuatan Simplisia
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah daun karet kebo (ficus
elastic yang sudah kering di peroleh dari Lembaga Ilmu Penelitian
Indonesia kemudian ditimbang sebagai berat kering. simplisia kemudian
 dimasukkan kedalam wadah plastik tertutup.Simplisia kering yang sudah
diperoleh ditimbang dan dihitung susut pengeringannya kemudian
dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak.

Susut pengeringan Simplisia = Bobot simplisia Basah-Bobot simplisia kering

Bobot simplisia Basah

F. Pembuatan Ekstrak
Simplisia daun karet kebo (ficus elastica) ditimbang sebanyak 50 gram,
kemudian di haluskan dengan blender dengan derajad kehalusan tertentu
untuk dimaserasi dengan etanol 70% 320 ml dan 50 gram simplisia
kemudian bagian pelarut hingga simplisia terendam lalu disimpan di suhu
kamar 1 hari 24 jam dengan diaduk sampai 5 menit lalu diganti pelarut
etanol 70% yang baru secara kontiunue. Selanjutnya disaring
menggunakan kertas saring.Ampas yang tersisa dimaserasi kembali
menggunakan pelarut yang sama sampai 3 hari. Filtrat yang diperoleh dari
beberapa kali lalu diekstraksi dengan diuapkan oleh alat rotary evaporator
sehingga diperoleh ekstrak kental etanol. Ekstrak kental etanol yang
diperoleh dihitung rendemennya dan kemudian dilakukan analisa
lanjutan.

Rendemen Ekstrak= bobot total ekstrak

Bobot serbuk simplisia total
G. Pemeriksaan Ekstrak
1. Pemeriksaan 3 senyawa kimia karet kebo (ficus elastica)
yakni Alkaloid,Flavonoid dan tritarpen,saponin.
Dilakukan dengan reaksi warna untuk mengetahui kandungan
tersebut. Ekstrak kental sampel dimasukkan kedalam tabung
reaksi,ditambahkan 5 ml aquadest dan 5 ml kloroform asetat, dan
dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan air dan kloroform.
1) Uji Flavonoid (Metode Sianidin Test)
Ambil lapisan air 1-2 tetes ,teteskan pada plat tetes lalu
tambahkan serbuk mg dan HCl (p),terbentuknya warna merah
menandakan adanya kandungan flavonoid.
2) Uji Saponin
 Ambil lapisan air,kocok kuat-kuat dalam tabung
reaksi,terbentuknya busa yang permanen (± 15 menit)
menunjukkan adanya saponin.
3) Uji Alkaloid (Metode Culvenore –Fitzgerald)
Ambil sedikit lapisan kloroform tambahkan 10 ml kloroform
amoniak 0,05 N aduk perlahan tambahkan beberapa tetes
H2SO4 2N kemudian dikocok perlahan,biarkan
memisah.Lapisan asam ditambahkan beberapa tetes pereaksi
mayer,reaksi positif alkaloid ditandai dengan adanya kabut
putih hingga gumpalan putih.

2. Pemeriksaan Organoleptis
3. Pengamatan dilakukan secara visual dengan mengamati bentuk,warna
dan bau.

H. Uji Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

1. Penyiapan Larva Artemia Salina Leach
 Wadah beker glas 1000 ml disiapkan untuk penetasan telur udang
dengan ruang penyinaran lampu sebagai tempat telur yang akan
menetas.
 Sejumlah satu liter air laut dimasukkan kedalam wadah terendam
Kemudian salah satu ruang dalam wadah tersebut diberi
penerangan dengan cahaya lampu pijar untuk menghangatkan
suhu dalam wadah penetasan dan untuk merangsang proses
penetasan. Untuk penerangan lampu dinyalakan selama 24 jam
untuk menetaskan telur.
 Setelah menetas udang berumur 24 jam di ganti air laut buatan
yang baru dengan 1 liter dimasukan pada beker glas dan
dipindahkan udang yang berumur 24 jam tersbut agar tidak
mempenagruhi perkembangan larva udang. Setelah 24 jam
kemudian,larva sudah berumur 48 jam .Larva yang digunakan
untuk hewan uji pada metode BSLT adalah larva yang sudah
berumur 48 jam,dan aktif bergerak.
 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak etanol karet kebo (ficus elastica)
Larutan induk ekstrak karet kebo (ficus elastica) 1%
Timbang 4 mg ekstrak kental ke labu 2 mL (konsentrasi 2.000
ppm). Larutkan dengan aquadest dan tambahkan dimetilsulfoksida
(DMSO) sebanyak 2 mL tambahkan aquadest sampai batas dan
kocok sampai tercampur sempurna.
 Lakukan pengenceran dari larutan induk ekstrak karet kebo

Konsentrasi (ppm) Pemipetan (Labu ukur 100 mL)

25 0.25 ml

50 0.5 ml

100 1 ml

250 2.5 ml

500 5 ml

1000 10 ml

Larutkan dengan aquadest sampai batas dan kocok.

Perhitungannya
Konsentrasi 1000 ppm
V1 x N1= V2 x N2
V1 x 10.000 ppm= 100 ml x 1000 ppm
V1= 10 mL
Konsentrasi 500 ppm
V1 x N1= V2 x N2
V1 x 10.000 ppm= 100 ml x 500 ppm
V1= 5 mL

Konsentrasi 250 ppm

V1 x N1= V2 x N2
V1 x 10.000 ppm= 100 ml x 250 ppm
V1= 2.5 mL

Konsentrasi 100 ppm

V1 x N1= V2 x N2
V1 x 10.000 ppm= 100 ml x 100 ppm
V1= 1 mL

Konsentrasi 50 ppm
 V1 x N1= V2 x N2
V1 x 10.000 ppm= 100 ml x 50 ppm
V1= 0.5 mL

Konsentrasi 25 ppm
V1 x N1= V2 x N2
V1 x 10.000 ppm= 100 ml x 25 ppm
V1= 0.25 mL

NO KONSENTRASI EKSTRAK DAUN KETERANGAN

KARET KEBO(ppm)
1 500 ppm
2 250 ppm
3 125 ppm
4 50 ppm
5 25 ppm
6 12.5 ppm
7 Kontrol negatif (0 ppm)
1 ml Air laut + 1 ml Lar.konsentrasi 1000 ppm + 10
Larva udang
1 ml Air laut + 1 ml Lar.konsentrasi 500 ppm + 10
Larva udang
1 ml Air laut + 1 ml Lar.konsentrasi 250 ppm + 10
Larva udang
1 ml Air laut + 1 ml Lar.konsentrasi 125 ppm + 10
Larva udang
1 ml Air laut + 1 ml Lar.konsentrasi 50 ppm + 10 Larva
udang
1 ml Air laut + 1 ml Lar.konsentrasi 25 ppm + 10 Larva
udang
1 ml Air laut + 10 Larva udang

 Konsentrasi tersebut masing-masing menjadi sebesar ½ dari konsentrasi

awal karena di dalam vial sudah terdapat air laut sebanyak 1 ml,sehingga
didalam vial terdapat 2 ml larutan yang berasal dari air laut sebanyak 1ml
dan konsentrasi awal sebanyak 1ml.
 Dari tindakan tersebut didapat konsentrasi akhir masing-masing sebesar
500 ppm, 250 ppm,50 ppm, 25 ppm dan 12.5 ppm yang ada didalam vial

2. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT

 Pengujian metode BSLT menggunakan vial yakni sebanyak 21
vial dimana percobaan ini dilakukan sebanyak 3 kali (triplo)
sehingga masing-masing perlakuan medapatkan 3 vial.Percobaan
pertama dibagi menjadi 6 kelompok vial untuk masing-masing
konsentrasi dan satu kelompok lagi untuk control negatif (air laut).
 Pada masing-masing vial dimasukkan larva artemia yang bergerak
aktif dan sudah berumur 48 jam sebanyak 10 ekor pada tiap vial
 dengan menggunakan pipet tetes ,campur dengan air laut 1 ml
yang sudah diukur pH nya terlebih dahulu.
 Kemudian pada setiap vial yang berisi larva dan air laut tadi
dimasukkan sebanyak 1 ml masing-masing konsentrasi kecuali
pada vial control negatif,sehingga volume pada masing-masing
vial menjadi 2 ml yakni 1ml ekstrak etanol daun alpukat (persea
Americana) dan 1 ml air laut.
 Vial dibiarkan di udara terbuka selama 24 jam. Setelah 24
jam,dihitung jumlah larva yang masih hidup pada masing-masing
vial.Kriteria standar untuk mengukur kematian larva yaitu apabila
larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik
pengamatan.
 Secara manual dapat dihitung dengan cara mengamati larva pada
tabung reaksi menggunakan lup dan kemudian dapat diamati
didalam kaca arloji dengan bantuan cahaya,dan hitung jumlah
larva yang mati.

3. Analisis Data
 Persentase mortalitas hewan uji dihitung setelah 24 jam perlakuan
dengan menggunakan rumus.

% Larva = jumlah larva yang mati

jumlah larva uji

 Data persentase mortalitas hewan uji digunakan untuk mengetahui

konsentrasi yang menyebabkan kematian pada 50 % hewan
percobaan (LC₅₀).
 Selanjutnya diuji dengan analisa probit menggunakan SPSS.

I. SKEMA
1. Kerangka Konsep Penelitian

Daun Karet Kebo (ficus elastica) dipisahkan dari

ranting, dibersihkan, dan dibuat menjadi serbuk
halus
 Ekstrak menggunakan pelarut etanol

Ekstrak kental daun karet kebo( ficus elastica)

Pembuatan larutan Uji

Uji toksisitas akut dengan menggunakan metode

BSLT

Kematian larva Artemia Salina Leach setelah

perlakuan 24 Jam
2. Skema Kerja Preparasi sampel

Penentuan nilai LC50

3. Pembuatan Ekstrak Daun Karet Kebo

Daun Karet Kebo

Simplisia Kering
 Ekstrak Daun Karet
Kebo

Maserasi dengan
etanol 70%

Maserat

Dikentalkan (dengan
rotary evaporator)

4. Uji fitokimia (Alkaloid,Saponin,Flavonoid)

Uji Alkaloid

Ekstrak daun
karet kebo Uji flavonoid

Uji saponin
4. Uji Toksisitas dengan Metode BSLT