ACARA II

TEKNIK ISOLASI BAKTERI DAN PENGECATAN DAN

MORFOLOGI BAKTERI
LAPORAN RESMI PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI UMUM

Disusun Oleh :
EDWIN EKA CRISDIANTORO
2019/21141/THP/STIPP-B

SARJANA TEKNOLOGI INDUSTRI PERKEBUNAN DAN

PANGAN
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN STIPER
YOGYAKARTA
2020
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Tujuan
Tujuan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
1. Mempelajari dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan bakteri.
2. Mempelajari teknik pembuatan apusan dalam pewarnaan bakteri.
3. Mempelajari tata cara pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif dan
pewarnaan Gram
B. Dasar Teori
Isolasi bakteri merupakan suatu teknik yang digunakan untuk dapat
mengetahui karakteristik bakteri dan jenis bakteri yang ada di lingkungan
sekitar. Bakteri yang terdapat di lingkungan ada yang bersifat
menguntungkan dan merugikan.Bakteri yang menguntungkan misalnya
bakteri asam laktat.Bakteria sam laktat merupakan bakteri yang berperan
dalam fermentasi asam laktat. Adapun bakteri ini mampu mengubah glukosa
menjadi asam laktat[6].
Bakteri termasuk dalam golongan prokariota, dapat bereproduksi secara
aseksual, yaitu melalui pembelahan, pembentukan tunas dan pembentukan
lamen serta secara seksual[1]. Bakteri mempunyai diameter 0,2 - 5 μm, asam
nukleat berupa DNA dan RNA dan ribosom 70S, bereplikasi secara
pembelahan biner dan hidup pada sel tuan rumah untuk pertumbuhannya[4].
Bakteri tidak mempunyai mitokondria atau kloroplast; sehingga enzim-enzim
untuk transport elektron tidak bekerja di membran sel; tetapi pada lamellae
yang berada di bawah membran sel. Dinding sel terdiri dari lapisan
peptidoglikan [1]. Beberapa bakteri mempunyai keistimewaan permukaan di
luar dinding sel yaitu mempunyai kapsul, flagella dan pili[4].
Faktor-faktor yang harus dikontrol selama pertumbuhan bakteri meliputi
nutrisi, pH, temperatur, aerasi, konsentrasi garam, dan kekuatan ionik
medium [3]. Bakteri menyimpan makanan cadangannya dalam bentuk
granula sitoplasma. Granula ini bekerja sebagai sumber karbon, tetapi bila
sumber protein berkurang, karbon dalam granula ini dapat dikonversi menjadi
sumber nitrogen [1].
Morfologi bakteri dibagi dalam tiga bentuk utama yaitu kokus, batang, dan
spiral[1]. Perbedaan bentuk dari bakteri yang membedakan kekerasan dinding
sel[4]. Bakteri dibagi atas bakteri yang positif Gram dan negatif Gram
tergantung pada responsnya bila diwarnai dengan pewarnaan kuman menurut
Gram[1].
Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu,
cara pengenceran, cara penuangan, cara penggesekan atau penggoresan, cara
penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan. Masing-
masing mempunyai kelebihan dan kekurangan[7].
Untuk metode streak plate misalnya, mikrobia diletakkan dalam pada
ujung plate menggunakan ose,lalu digoreskan pada permukaan medium agar
tersebut dengan pola tertentu yang khas. Ada pula metode pour plate atau
penuangan. Metode ini dapat digunakan untuk penghitungan bakteri secara
langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut diencerkan terlebih
dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media terdapat
30-300 koloni dapat terpenuhi[5].
Metode pengenceran yaitu dengan mengencerkan misalnya 1 ose bakteri
dengan air. Lalu hasil pengenceran tersebut diencerkan lagi dengan beberapa
ketentuan. Hal ini bertujuan untuk mengurangi konsentrasi bakteri[2].
 BAB II
METODE PRAKTIKUM
A. Tempat dan Tanggal Praktikum
Praktikum dilaksanakan pada hari Senin,20 April 2020 di Laboratorium
Fakultas Teknologi Pertanian Instiper Yogyakarta.

B. Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Suspensi bahan yang
mengandung bakteri dan MNA (Medium Nutrien Agar) tegak,Biakan murni
Bacillus subtilis dalam medium nutrient cair umur 24 jam,biakan murni
Escherichia coli dalam medium nutrient cair umur 24 jam,larutan cat nigrosin
atau tinta cina,alcohol,minyak imersi,larutan cat Huckers crystal violet (Gram
A),larutan Mordan lugol iodine (Gram B),Larutan pencuci atau alcohol(Gram
C),larutan cat safranin(Gram D),Gelas benda.
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Penangas
air,mikroskop,preparet,Petridishsteril,jarumosesuspensi,etiket,incubatormikro
biologi, bungkus dan inkubasikan danlampu spiiritus.

C. Cara Kerja
1. Teoritis
I. Teknik Isolasi Bakteri
a. Cara Goresan ( Streak plate method )
1. Cairan MNA tegak dalam penangas air.
2. Dinginkan sampai temperature kurang lebih 50° C
3. Tuangkan MNA tegak tersebut ke dalam petridish steril secara
aseptik,biarkan sampai dingin dan padat.
4. Ambil satu ose suspense bahan yang mengandung bakteri
secara aseptik,kemudian buat goresan pada permukaan agar.
5. Bungkus dan beri etiket,dan inkubasikan selama 48 jam secara
terbalik pada suhu kamar.
 6. Sesudah inkubasi akan tampak koloni-koloni yang terpisah-
pisah.
7. Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh
berdasarkan bentuk koloni.
b. Cara taburan ( Pour plate method)
1. Suspensikan bahan yang mengandung bakteri seencer
mungkin,maksudnya agar kelak terjadi koloni-koloni yang
terpisah-terpisah sehingga dengan mudah dapat diisolasi.
2. Cairkan MNA tegak dalam penangas air.
3. Dinginkan MNA tegak tesebut sampai temperature kurang
lebih 50° C,selanjutnya inokulasikan dengan stu ose suspense
bahan yang mengandung bakteri.Gojog dengan hati-hati hingga
tercampur merata.
4. Tuangkan dalam petridish secara aseptic dan ratakan.
5. Beri etiket,bungkus dan inkubasikan selama 48 jam secara
terbalik pada suhu kamar.
6. Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh
berdasarkan bentuk koloni.

II. Pengecatan dan Morfologi Bakteri

A. Pengecatan Negatif
1. Bersihkan gelas dengan alcohol hingga bebas lemak,kemudian
panggang diatas nyala lampu spiritus.
2. Setelah dingin,ambil suspense biakan murni Bacillus subtilus
dengan ose secara aseptic dan letakkan diatas gelas benda.
3. Kemudian ambil sedikit larutan cat nigrosin atau tinta
cina,xcampurkan dengan suspense bakteri,retakkan dengan
batang gelas hingga merupakan lapisan yang tipis sekali.
4. Selanjutnya preparat dikeringkan dengan diangin-anginkan
5. Amati preparat dengan mikroskop perbesar kuat dengan
minyak imersi.
 6. Gambar preparat bekteri tersebut.
7. Ulangi pekerjaan 1 sampai dengan 6 untuk biakan murni
Escherichia coli.
B. Pengecatan Gram
1. Bersihkan gelas benda dengan alcohol hingga bebas lemak
kemudian panggang diatas nyala lampu spiritus.
2. Ambil secara aseptic satu ose suspense bakteri Bacillus subtilis
dan letakkan pada gelas benda.Ratakan suspense bakteri
tersebut.
3. Keringkan dengan diangin-anginkan dan selanjutnya lakukan
fiksasi diatas nyala lampu spiritus.
4. Setelah dingin bubuhkan cat utama (Gram A) sebanyak 2-3
tetes dan diamkan selama 1 menit.
5. Cuci dengan air mengalir,kemudiankan keringkan dengan
dianginkan.
6. Tetesi dengan larutan mordan (GramB) dan biarkan selama 1
menit,cuci dengan air mengalir dan kering anginkan.
7. Kemudian cuci dengan larutan pencuci atau alkohol (Gram C)
selama kurang lebih 30 detik,selanjutnya cuci dengan air
mengalir dan keringkan lalu dinginkan.
8. Beri larutan cat penutup (Gram D) selama 2menit.
9. Cuci dengan air mengalir dan keringkan lalu dinginkan.
10. Amati preparat dengan mikroskop perbesar kuat dengan
minyak imersi.Bakteri gram positif berwarna violet,gram
negative bewarna merah, dan gram variable dapat bewarna
merah atau berwarna violet.
11. Gambar hasil –hasil pengecatan bakteri dengan diberi
keterangan mengenai bentuk sel,warna dan reaksi pengecatan.
12. Ulangi pekerjaan 1 sampai dengan 11 untuk biakan murni
Escherichia coli.
2. Skematis
I. Teknik Isolasi
A. Cara goresan (Streak Plate Method)
Dicairkan MNA tegak dalam penagas air.

Didinginkan sampai temperatur kurang lebih 50℃.

Dituangkan MNA tegak tersebut ke dalam petridish steril

secara aseptik, biarkan sampai dingin dan padat

Dibungkus dan beri etiket, dan inkubasikan selama 48 jam

secara terbalik pada suhu kamar

Diinkubasi sampai nampak koloni-koloni yang terpisah-pisah.

Dimati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh

berdasarkan bentuk koloni tersebut.

Diagram Alir I. Cara goresan (Streak Plate Method)

B. Cara Taburan (Pour Plate Method).

Disuspensi bahan yang mengandung bakteri seencer mungkin,

maksudnya agar kelak terjadi koloni-koloni yang terpisah-
terpisah sehingga dengan mudah dapat diisolasi

Dicairkan MNA tegak dalam penangas air

Didinginkan MNA tegak tersebut samapi temperatur kurang

lebih 50℃ , selanjutnya inokulasikan denagn satu ose supensi
bahan yang mengandung bakteri. Gojog hati-hati agar
tercampur merata.
 Dituangkan dalam petridish secara aseptik dan ratakan

Diberikan etiket, bungkus dan inkubasikan selama 48 jam

setara terbalik pada suhu kamar.

Diamati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh

berdasar bentuk koloni

Diagram Alir II. Cara taburan (Pour Plate Method)

II. Pengecatan dan Marfologi Bakteri

A. Pengecatan Negatif

Dibersihkan gelas benda dengan alkohol hingga bebas lemak,

kemudian panggang di atas nyala lampu spiritus.

Diambil suspensi biakan murni Bacillus subtilis dengan ose

secara aseptik dan letakkan diatas gelas benda.

Diambil sedikit larutan cat nigrosin atau tinta cina, campurkan

dengan suspensi bakteri, ratakan dengan batang gelas hingga
merupakan lapisan yang tipis sekali.

Di preparat dikering anginkan

Diamati preparat dengan mikroskop perbesar kuat dengan

minyak imersi

Digambar preparat bakteri tersebut

 Diulangi pekerjaan 1 sampai dengan 6 untuk biakan murni
Escherichia coli.
Diagram Alir III. Pengecatan Negatif

B. Pengecatan Gram
Dibersihkan gelas benda dengan alkohol hingga bebas lemak
kemudian panggang diatas nyala lampu spiritus.

Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri Bacillus

subtilis dan letakkan pada gelas benda. Ratakan suspensi
bakteri tersebut.

Dikeringkan dengan dianginkan, dan selanjutnya lakukan

fiksasi diatas nyala lampu spiritus.

Didinginkan bubuhkan cat utama (Gram A) sebanyak 2-3 tetes

dan diamkan selama 1 menit

Dicuci dengan air mengalir, kemudiaan kering anginkan

Ditetesi dengan larutan mordan (Gram B) dan biarkan selama 1

menit, cuci dengan air mengalir dan kering anginkan

Dicuci dengan larutan pencuci atau alkohol (Gram C) selama

kurang lebih 30 detik, selanjutnya cuci dengan air mengalir dan
kering anginkan

Diberikan larutan cat penutup (Gram D) selama 2 menit

 Dicuci dengan air mengalir dan kering anginkan

Diamati preparat dengan mikroskop perbesar kuat dengan

minyak imersi. Bakteri gram positif berwarna violet, gram
negatif berwarna merah, dan gram variabel berwarna merah
atau berwarna violet

Digambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi

keterangan mengenai bentuk sel, warna dan reaksi pengecatan

Diulangi pekerjaan 1 sampai dengan 11 untuk biakan murni

Escherichia coli

Diagram Alir IV. Pengecatan Gram

 BAB III
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
Berikut ini adalah hasil pengamatan pada praktikum kali ini adalah
sebagai berikut :
1. Teknik Isolasi Bakteri
a.Cara Goresan b.Cara Taburan

Gambar: Goresan Bacillus subtilis Gambar: Taburan Escherecia coli

Keterangan : Teknik isolasi bakteri
dengan cara goresan .
2. Pengecetan dan Morfologi Bakteri
2. 1. Pengecatan Negatif
Bakteri 1: Bacillus subtilis
Keterangan : Teknik isolasi bakteri
bakteri dengan cara taburan
Bakteri 2: Escherecia coli

Pengecatan Negatif Pengecatan Negatif

Gambar: Basillus Subtillis Gambar: Eschericia coli

 Keterangan: Pengecatan negatif Keterangan:Pengecatan negatif
bentuk koloni Irreguler bentuk koloni Timmid

2. 2 . Pengecatan Gram

Bakteri 1:Bacillus subtilis Bakteri 2: Escherecia coli

Pengecatan Negatif Pengecatan Negatif

Gambar: Gram Positif Gambar: Gram Negatif

Keterangan: Bentuk koloni Celoid Keterangan: Bentuk koloni

Rhizold Berwarna violet Berwarna merah
B. Pembahasan
Isolasi bakteri merupakan suatu teknik yang digunakan untuk dapat
mengetahui karakteristik bakteri dan jenis bakteri yang ada di lingkungan
sekitar.Bakteri yang terdapat di lingkungan ada yang bersifat menguntungkan
dan merugikan.Bakteri yang menguntungkan misalnya bakteri asam laktat.
Bakteria sam laktat merupakan bakteri yang berperan dalam fermentasi asam
laktat. Adapun bakteri ini mampu mengubah glukosa menjadi asam laktat[6].
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba.
Metode yang di gunakan dalam praktikum ini ada 2 yaitu cara goresan
untuk bakteri Bacillus subtilis dan cara taburan untuk bakteri Escherichia coli.
Untuk mengetahui morfologi bakteri juga di lakukan pengecatan gram dan
pengecatan negatif. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-
positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan
kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna
merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur
kimiawi dinding selnya.
Hasil percobaan pada pengecatan dan morfologi bakteri, yaitu pada
pengecatan negatif menggunakan bakteri Bacillus subtilis menghasilkan bentuk
koloni irregular,sedangkan menggunakan bakteri Escherichia coli
menghasilkan bentuk koloni timmid. Pada pengecatan gram menggunakan
bakteri Bacillus subtilis menghasilkan bentuk koloni celoid,berwarna violet
yang menunjukkan bakteri
tersebut termasuk gram positif, sedangkan menggunakan bakteri Escherichia
coli menghasilkan bentuk koloni rhizoid,berwarna merah yang menunjukkan
bakteri tersebuttermasukgramnegatif.
 BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat kita ambil pada praktikum ini adalah :
1. Isolasi merupakan suatu teknik yang digunakan untuk dapat mengetahui
karakteristik bakteri dan jenis bakteri yang ada di lingkungan sekitar
2. Mengetahui perbedaan gram dan gram negatif
3. Memahami dan mengetahui teknik atau cara isolasi bakteri baik dengan
cara goresan dan cara tabor.
4. Mengetahui pengecetan gram positif dan gram negatif.
5. Hasil percobaan pada pengecatan danmorfologi bakteri, yaitu pada
pengecatan negatif menggunakan bakteri Bacillus subtilis menghasilkan
bentuk koloni irregular,sedangkan menggunakan bakteri Escherichia coli
menghasilkan bentuk koloni timmid.
6. Hasil Pada pengecatan gram menggunakan bakteri Bacillus subtilis
menghasilkan bentuk koloni celoid,berwarna violet yang menunjukkan
bakteri tersebut termasuk gram positif, sedangkan menggunakan bakteri
Escherichia coli menghasilkan bentuk koloni rhizoid,berwara merah yang
 DAFTAR PUSTAKA

[1] Assani, S. 1994. Ultrastruktur, Morfologi dan Pewarnaan Kuman, dalam

Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta :
Binarupa Aksara. Halaman 10-11.Dikutip pada tanggal 26
april 2020 pukul 07.00 Wib.
[2] Barazandeh, N. 2008. Microbiology Titles Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Media, pp 9-11. Jerman. Dikutip pada tanggal 26 april 2020
pukul 07.40 Wib.
[3] Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A., 2005, Mikrobiologi Kedokteran,
Penerbit Salemba Medika, Jakarta. Dikutip pada tanggal 26
april 2020 pukul 08.00 Wib..
[4] Levinson, W. 2004. Medical Microbiology & Imunology, Examination &
Board review, 8th edition, McGraw-Hill, New York. Dikutip
pada tanggal 26 april 2020 pukul 09.00 Wib.
[5] Prescott, et al. 2008. Microbiology 7thedition. USA: McGraw-Hill Book
Company. Dikutip pada tanggal 26 april 2020 pukul 09.30
Wib.
[6] Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba.Jakarta:BumiAksara. Dikutip pada
tanggal 26 april 2020 pukul 11.00 Wib.
[7] Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang. Dikutip pada
tanggal 26 april 2020 pukul 12.00 Wib

Yogyakarta, 27 April 2020

Mengetahui,
Co. Ass Praktikan

(Bresly Nelce Murdiyatno) (Edwin Eka Crisdiantoro)

LAMPIRAN